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作者：苑曼琳华南农业大学

学位级别：硕士

由尖孢镰刀菌古巴专化型(Fusarium oxysporum f.***.cubense)引起的香蕉枯萎病严重威胁着全球的香蕉生产,有关病原菌致病机理的研究亟待新的进展。而真核生物的非编码RNA(Non-coding RNA,ncRNA),包括一类内源单链microRNA(mi RNAs),可通... 详细信息

由尖孢镰刀菌古巴专化型(Fusarium oxysporum f.***.cubense)引起的香蕉枯萎病严重威胁着全球的香蕉生产,有关病原菌致病机理的研究亟待新的进展。而真核生物的非编码RNA(Non-coding RNA,ncRNA),包括一类内源单链microRNA(mi RNAs),可通过与靶标基因完全或不完全结合抑制其靶标基因的表达,在生长发育的不同阶段发挥重要的调控功能。真菌milRNAs(microRNA-like RNAs)的发现为真核生物小分子RNA的功能研究奠定了基础,但目前在香蕉枯萎病菌中鲜有milRNAs功能的报道。本研究应用小分子RNA高通量测序技术,分析比较了香蕉枯萎病菌野生型和FoQDE2基因敲除突变体的milRNAs的表达,并对目标小RNA(Samll non-coding RNAs,s RNAs)进行功能研究,结果如下:1.香蕉枯萎病菌依赖FoQDE2产生的s RNAs的生物信息分析以纯培养条件下香蕉枯萎病菌野生型与FoQDE2基因缺失突变体菌株为测序对象,通过对其小分子RNA数据生物信息分析我们得到了3595条s RNAs序列,其中156条在FoQDE2基因缺失突变体表达量显著下调s RNAs,22条表达量显著上调。生物信息分析显示在20-24 nt的范围内FoQDE2基因突变体中的s RNAs占比要低于野生型,同时多数以尿嘧啶(U)开头。2.依赖FoQDE2基因产生milRNAs的鉴定及其在致病初期的表达量检测对初步预测的156条显著下调s RNAs进行二级结构预测与IGV可视化分析,我们发现部分具有较好的milRNAs前体二级结构,且同一前体可能产生多个milRNAs;通过进一步q RT-PCR验证筛选出4条s RNAs在(?)FoQDE2中表达量降低的同时在致病接种初期的表达量显著提高,将其分别命名为milR109、milR123、milR130、milR133。经反转录PCR克隆测序,发现milR109长21 nt、milR123长25 nt、milR133长22 nt都是比较典型的milRNAs,而milR130长140 nt推测可能是长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)。3.依赖FoQDE2基因产生目标milRNAs缺失型突变体的筛选与鉴定使用PEG介导的原生质体转化法,对选定目标milRNAs进行前体片段敲除,因milR123产生位置与milR109靠近所以一起敲除。经PCR检测获得前体成功敲除突变体(?)milR109、(?)milR130及(?)milR133;q RT-PCR检测发现目标milRNAs在对应的敲除突变体中均不表达。4.依赖FoQDE2基因产生目标milRNAs缺失型突变体的表型分析(?)milR109、(?)milR130及(?)milR133的菌株形态、生长速率、分生孢子大小均与野生型没有显著差异;产孢量存在不同程度下降,其中(?)milR133下降达到一半左右。在孢子的耐热性测定与穿透能力测定试验中(?)milR133的存活率降低、孢子穿透能力丧失,而突变体(?)milR109、(?)milR130未表现出显著差异。三者对于过氧化氢、细胞壁抑制剂、近紫外光照射均未受到显著影响。5.依赖FoQDE2基因产生目标milRNAs缺失型突变体的致病能力检测对突变体菌株致病能力检测发现,(?)milR130、(?)milR133在番茄接种结果中病斑明显减小,(?)milR133表现得更加稳定,(?)milR109则没有明显差异。在接种寄主香蕉后,寄主的发病情况表现出不同程度的减弱,其中,(?)milR133接种后病情指数出现显著降低。6.依赖FoQDE2基因产生目标milRNAs靶标基因的初步预测通过网站对milR109、milR123、milR133靶标基因进行初步预测发现,在其缺失型突变体中,有一些基因表达量显著上调,例如:E3泛素蛋白连接酶BRE1基因、过氧化氢酶基因等。上述结果表明,香蕉枯萎病菌中的milR133积极参与孢子产生、孢子活力以及调控病原菌的致病能力。为研究真菌中milRNAs的功能增加了新的证据,也为进一步解析香蕉枯萎病菌致病机理奠定了基础。

关键词：香蕉枯萎病菌小RNA测序 milRNAs FoQDE2基因致病力

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香蕉枯萎病菌milR133靶标基因的鉴定与功能研究

香蕉枯萎病菌milR133靶标基因的鉴定与功能研究

引用

中国植物病理学会2023年学术年会

作者：张芙蓉曾敬苑曼琳姜子德李敏慧华南农业大学植物保护学院

由尖孢镰孢菌古巴专化型(Fusarium oxysporum f.***.cubense,Foc)引起的香蕉枯萎病,被称为"香蕉的癌症",此病成为全球香蕉产业持续健康发展的主要障碍。病原菌在与植物互作的过程中,会分泌大量的细胞壁降解酶(cell wall degrading enzyme... 详细信息

由尖孢镰孢菌古巴专化型(Fusarium oxysporum f.***.cubense,Foc)引起的香蕉枯萎病,被称为"香蕉的癌症",此病成为全球香蕉产业持续健康发展的主要障碍。病原菌在与植物互作的过程中,会分泌大量的细胞壁降解酶(cell wall degrading enzymes,CWDEs)来解聚寄主植物细胞壁的多糖成分,从而破坏植物细胞壁结构,其中大多数的CWDEs是糖基水解酶(glycoside hydrolases,GHs)。实验室前期在香蕉枯萎病菌中筛选出一个依赖Argonaute蛋白FoQDE2合成的类微小RNA (Foc-milR133),该milRNA在病原菌侵染初期显著高表达,是香蕉枯萎病菌致病相关的milRNA。为进一步阐明Foc-milR133如何调控香蕉枯萎病菌的致病机制,本研究利用eGFP标记的靶基因鉴定方法,通过烟草瞬时表达系统,验证了Foc-milR133能够靶向抑制香蕉枯萎病菌FoRohin1的翻译。生物信息学分析发现FoRohin1编码一种GH16家族的糖基水解酶,N端具有信号肽序列;在烟草叶片瞬时表达该基因可显著激活植物的免疫反应,而当FoRohin1与Foc-milR133共表达时寄主免疫反应被明显抑制;转录模式分析显示FoRohin1在香蕉枯萎病菌侵染寄主24 h和48 h后转录水平明显比纯培养时降低,而Foc-milR133在此阶段则显著地高表达。通过对香蕉枯萎病菌FoRohin1基因敲除,以及对敲除突变体的表型分析和致病力测定,我们研究了该基因的功能。结果发现ΔFoRohin1的生长和产孢与野生型XJZ2菌株相比基本不受影响;但对荧光增白剂的耐受性显著降低;对香蕉苗的致病力检测结果显示ΔFoRohin1敲除突变体的致病力明显高于野生型菌株。上述实验结果表明FoRohin1虽然编码细胞壁降解酶,但在香蕉枯萎病菌侵染初期并非作为致病因子而发挥功能,而是具有激活植物抗病反应的功能。推测该基因极有可能编码一种效应子在病原菌与寄主识别过程中发挥重要的作用。本研究揭示了FocmilR133通过调控其靶标基因FoRohin1表达,从而调控枯萎病菌对寄主香蕉的致病力,为香蕉枯萎病菌的致病机理研究提供有力的分子证据。

关键词：香蕉枯萎病菌 milRNA GH16糖基水解酶致病机理

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香蕉枯萎病菌致病机理研究进展

引用

果树学报 2019年第6期36卷 803-811页

作者：李敏慧苑曼琳姜子德李华平华南农业大学农学院植物病理学系

香蕉是世界重要的水果作物和第四大粮食作物,也是世界贸易第一大宗水果,具有很高的经济价值,然而目前由尖孢镰刀菌古巴专化型(Fusarium oxysporum f. sp. cubense)引起的香蕉枯萎病正严重威胁着全世界的香蕉生产。由于病原菌通过土壤传... 详细信息

香蕉是世界重要的水果作物和第四大粮食作物,也是世界贸易第一大宗水果,具有很高的经济价值,然而目前由尖孢镰刀菌古巴专化型(Fusarium oxysporum f. sp. cubense)引起的香蕉枯萎病正严重威胁着全世界的香蕉生产。由于病原菌通过土壤传播,迄今该病害还没有有效的防治措施,且其致病机理尚未完全明确。本文对香蕉枯萎病菌的遗传多样性及其致病机理研究进展系统进行概述,以期为香蕉枯萎病的综合防控提供理论依据。

关键词：香蕉枯萎病尖孢镰刀菌古巴专化型遗传多样性致病机理

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