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细胞膜色谱法制备酪蛋白源抗菌肽及其抗菌性研究

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细胞膜色谱法制备酪蛋白源抗菌肽及其抗菌性研究

作者：苑华宁江南大学

学位级别：硕士

近年来，我国乳品行业发展迅速，但产品结构单一、附加值低。牛乳中酪蛋白含量丰富，开发和利用酪蛋白可以提高牛乳的经济价值。酪蛋白源抗菌肽安全性高，但酶解分离纯化步骤繁琐限制了其发展，所以建立高效、快速的抗菌肽分离纯化方法... 详细信息

近年来，我国乳品行业发展迅速，但产品结构单一、附加值低。牛乳中酪蛋白含量丰富，开发和利用酪蛋白可以提高牛乳的经济价值。酪蛋白源抗菌肽安全性高，但酶解分离纯化步骤繁琐限制了其发展，所以建立高效、快速的抗菌肽分离纯化方法是实现其工业化生产亟待解决的问题。本论文通过蛋白酶水解酪蛋白，建立一种固相亲和萃取联合HPLC指纹图谱的细胞膜色谱法（CMC），快速、准确地从酶解液中筛选出抗菌肽，并研究其抑菌特性及稳定性，初步探讨了该抗菌肽对金黄色葡萄球菌生长曲线及菌体细胞壁膜组分的影响，为开发利用酪蛋白和制备抗菌肽提供理论依据。首先以酪蛋白为原料，分别用碱性蛋白酶、胃蛋白酶、中性蛋白酶和复合蛋白酶水解酪蛋白，以酶解产物对金黄色葡萄球菌的抑菌活性为指标筛选胃蛋白酶作为水解酶，并对酶解条件进行优化，确定制备抗菌肽的条件为酪蛋白浓度10mg/mL，酶底比（E/S）1:15，pH2.0，温度37℃，水解时间3h。其次，利用反复冻融、超声辅助破壁技术破碎啤酒酵母菌细胞，并结合密度梯度离心技术制备细胞膜,以硅胶为载体采用涂覆法制备酵母菌细胞膜固定相，并通过电镜扫描对其进行表征。研究结果表明：啤酒酵母菌先经反复冻融处理（加水量为25%、冻融4次），然后经过超声处理（超声功率400W，每次超声时间10s，超声总时间15min，酵母菌浓度20mg/mL），破壁率达到了89.31%，且破壁率是反复冻融单独作用的2.4倍，是超声波单独作用的1.5倍。电镜显示，细胞膜固定相SCMSP与纯硅胶载体相比，表面已被细胞膜包裹而变得粗糙。硅胶表面对细胞膜的饱和吸收值Csmax为2.38mg/g、吸收常数K*为325.61mL/mg。再次，建立CMC从酪蛋白酶解液中成功筛选出抗菌肽，利用MALDI-TOF-MS/MS技术鉴定抗菌肽的氨基酸序列为Leu-Arg-Leu-Lys-Lys-Tyr-Lys-Val-Pro-Gln-Leu。抑菌活性表明，利用CMC分离酪蛋白源抗菌肽是可行的，所得抗菌肽对革兰氏阳性菌、阴性菌表现出抑菌活性，且具有一定的热稳定性、能够抵抗一定的离子强度变化，室温条件储藏稳定性较好。最后，利用光密度法实现在活菌条件下测定酪蛋白源抗菌肽对金黄色葡萄球菌的生长曲线、菌体内膜等组分的影响，并利用红外光谱技术研究其对菌体结构的影响。结果表明：酪蛋白源抗菌肽可以破坏菌体壁膜结构，导致菌体死亡。

关键词：酪蛋白抗菌肽细胞膜亲和色谱抑菌特性

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反复冻融和超声协同作用破碎酵母细胞

食品与发酵工业 2013年第12期39卷 62-67页

作者：苑华宁黄冬云张晖钱海峰王立齐希光江南大学食品学院江苏无锡214122

利用反复冻融法和超声波技术相结合的方法破碎啤酒酵母细胞壁,研究协同作用对酵母细胞破壁率的影响。研究结果表明:啤酒酵母先经反复冻融处理(加水量为25%、冻融4次),然后经过超声处理(超声功率400 W,每次辐射时间11 s,超声总时间14.5 m... 详细信息

利用反复冻融法和超声波技术相结合的方法破碎啤酒酵母细胞壁,研究协同作用对酵母细胞破壁率的影响。研究结果表明:啤酒酵母先经反复冻融处理(加水量为25%、冻融4次),然后经过超声处理(超声功率400 W,每次辐射时间11 s,超声总时间14.5 min,酵母浓度20 mg/mL)进行破碎,破壁率达到了89.31%,且破壁率是反复冻融单独作用的2.4倍,是超声波单独作用的1.5倍。

关键词：啤酒酵母反复冻融超声波破壁率

纤维素酶对米糠可溶性膳食纤维含量及抗氧化性的影响

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食品工业科技 2014年第15期35卷 112-115,120页

作者：钱海峰黄冬云苑华宁张晖王立江南大学食品学院江苏无锡214122

采用纤维素酶水解米糠膳食纤维,以可溶性膳食纤维含量为指标,通过单因素实验和正交实验对酶解条件进行优化,并对在最优条件下制备的可溶性膳食纤维和不溶性膳食纤维进行分离,对其抗氧化性质作进一步的研究。结果表明,在pH5.0,酶的添加量... 详细信息

采用纤维素酶水解米糠膳食纤维,以可溶性膳食纤维含量为指标,通过单因素实验和正交实验对酶解条件进行优化,并对在最优条件下制备的可溶性膳食纤维和不溶性膳食纤维进行分离,对其抗氧化性质作进一步的研究。结果表明,在pH5.0,酶的添加量为65EGU/g米糠膳食纤维的条件下,50℃水解3h,可溶性膳食纤维含量最高,为6.97%;经纤维素酶处理得到的总膳食纤维和可溶性膳食纤维的总酚含量分别达到4.38±0.30、(18.53±1.41)mg没食子酸·g-1,分别是酶解前的2.08倍和8.82倍;总抗氧化能力分别达到15.43±0.62、(35.25±3.18)μmol Trolox当量·g-1,分别是酶解前的2.13倍和4.86倍;纤维素酶处理后得到的膳食纤维清除DPPH·,·OH,O-2·的能力显著增强;在亚油酸体系中的抗氧化能力均强于0.5mg/mL的抗坏血酸;膳食纤维的总抗氧化能力和还原力都与总酚含量间均存在显著的正相关。

关键词：米糠膳食纤维纤维素酶抗氧化

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木聚糖酶制取米糠膳食纤维的功能性质

食品与发酵工业 2013年第12期39卷 30-34页

作者：黄冬云钱海峰苑华宁张晖王立齐希光江南大学食品学院江苏无锡214122

采用木聚糖酶水解米糠膳食纤维,将制备的可溶性膳食纤维(X-SDF)、不溶性膳食纤维(X-IDF)和总膳食纤维(X-TDF)进行分离,研究其功能性质发现,木聚糖酶酶解后,膳食纤维的持水力持油力显著增强,溶胀性降低;阳离子交换能力未见显著变化;X-TDF... 详细信息

采用木聚糖酶水解米糠膳食纤维,将制备的可溶性膳食纤维(X-SDF)、不溶性膳食纤维(X-IDF)和总膳食纤维(X-TDF)进行分离,研究其功能性质发现,木聚糖酶酶解后,膳食纤维的持水力持油力显著增强,溶胀性降低;阳离子交换能力未见显著变化;X-TDF、X-IDF和X-SDF对葡萄糖的吸附能力分别是RBDF的1.28倍、1.35倍和2.11倍,X-TDF、X-SDF的葡萄糖透析延迟指数相比RBDF显著升高,X-IDF相比RBDF有所降低;在模拟胃和小肠的环境下,X-TDF、X-SDF对胆固醇的吸附量分别为(19.99±1.26)、(23.26±0.52)mg/g和(22.64±1.48)、(27.06±2.22)mg/g,相比RBDF有显著提高。扫描电镜观察其超微结构发现,膳食纤维由不规则块状颗粒组成,木聚糖酶作用后的膳食纤维结构疏松,出现较多空腔和裂缝。

关键词：膳食纤维木聚糖酶阳离子交换能力葡萄糖透析延迟指数胆固醇

超高效液相色谱串联质谱法测定猪肝中克伦特罗的不确定度分析

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质量安全与检验检测 2022年第3期32卷 15-17,21页

作者：陈旭晋苑华宁陆宇阳周锋杰曹佳苏州市农产品质量安全监测中心江苏苏州215000

本文通过对超高效液相色谱串联质谱(UPLC-MS)法测定猪肝中克伦特罗的不确定度的主要来源进行分析评定。参照农业部1025号公告-18-2008对猪肝中克伦特罗的含量进行测定,通过建立不确定度数学模型,对整个测定过程中的不确定度的主要来源... 详细信息

本文通过对超高效液相色谱串联质谱(UPLC-MS)法测定猪肝中克伦特罗的不确定度的主要来源进行分析评定。参照农业部1025号公告-18-2008对猪肝中克伦特罗的含量进行测定,通过建立不确定度数学模型,对整个测定过程中的不确定度的主要来源进行分析,参照JJF 1135-2005和JJF 1059.1-2012的规定,计算出该方法的合成扩展不确定度。猪肝样品中克伦特罗含量测定结果表示为w=2.04±0.13μg/kg(置信概率为95%,k=2)。可见该方法适用于超高效液相色谱串联质谱法测定猪肝中克伦特罗的不确定度评定。

关键词：克伦特罗不确定度超高效液相色谱串联质谱

黄陵隆起片麻岩和花岗岩的^(40)Ar/^(39)Ar年龄及其构造意义

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地球科学 2024年第2期49卷 700-711页

作者：吴阳沈传波邱华宁中国地质大学资源学院湖北武汉430074 中国地质大学构造与油气资源教育部重点实验室湖北武汉430074

黄陵花岗岩是研究扬子陆块构造演化和岩浆活动的关键对象,高精度的^(40)Ar/^(39)Ar定年可以为确定黄陵花岗岩的构造演化提供准确的年代学依据.采用^(40)Ar/^(39)Ar阶段加热技术分别测定了黄陵隆起核部变质岩中角闪石、黄陵庙花岗岩中白... 详细信息

黄陵花岗岩是研究扬子陆块构造演化和岩浆活动的关键对象,高精度的^(40)Ar/^(39)Ar定年可以为确定黄陵花岗岩的构造演化提供准确的年代学依据.采用^(40)Ar/^(39)Ar阶段加热技术分别测定了黄陵隆起核部变质岩中角闪石、黄陵庙花岗岩中白云母和黑云母单矿物的年龄.角闪石^(40)Ar/^(39)Ar坪年龄(835.1±0.8)Ma,白云母坪年龄为(830.0±1.7)Ma,黑云母获得上凸型年龄谱,没有形成明显的年龄坪.分析认为,角闪石年龄指示围岩受到花岗岩侵入烘烤重置的时间,白云母年龄指示黄陵花岗岩冷却至350℃的年龄,岩体侵入时间不晚于835 Ma,在835~830 Ma经历快速冷却事件,冷却速率为50℃/Ma.黑云母低温阶段获得的年轻年龄216 Ma,记录了在晚三叠世黄陵地区缓慢差异隆升过程中发生的一期热事件.

关键词：黄陵花岗岩黄陵隆起 ^(40)Ar/^(39)Ar定年热扰动地球化学

渗流影响下黏弹塑性岩体隧道支护压力预测的解析模型

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清华大学学报(自然科学版) 2024年

作者：刘倩王华宁同济大学航空航天与力学学院同济大学土木工程防灾国家重点实验室

对于流变岩体中衬砌支护深埋圆形隧道,该文用黏弹塑性模型模拟岩石流变特性并考虑实际应力路径及非稳态渗流场的影响,推导并获得支护压力及围岩、衬砌应力及位移的精确解析解,可以更快速精准地预测与时间相关的支护结构的受力变化和围... 详细信息

对于流变岩体中衬砌支护深埋圆形隧道,该文用黏弹塑性模型模拟岩石流变特性并考虑实际应力路径及非稳态渗流场的影响,推导并获得支护压力及围岩、衬砌应力及位移的精确解析解,可以更快速精准地预测与时间相关的支护结构的受力变化和围岩稳定状态。通过开挖释放荷载下的加载计算获得开挖阶段的流变位移与应力。在支护阶段,通过分离变量法获得全域全时段的非稳态孔压分布;正确考虑支护阶段的加卸载应力路径,得到渗流影响下衬砌支护力以及围岩、衬砌力场和位移场的时效解析解。对比考虑加卸载应力路径和仅按加载路径计算的结果,发现仅按加载路径而未考虑实际应力路径时围岩变形预测值偏小,支护结构按此设计将偏于危险。该文为黏弹塑性岩体中深埋圆形隧道与时间相关的支护压力预测和围岩、衬砌流变力场分析提供了快速预测的方法。

关键词：隧道工程黏弹塑性解析解应力路径非稳态渗流场支护压力预测

青岛市售贝类副溶血性弧菌污染状况及耐药性分析

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中国卫生检验杂志 2012年第2期22卷 375-377页

作者：江艳华姚琳宋春丽苑华宁翟毓秀王联珠农业部水产品质量安全检测与评价重点实验室、中国水产科学研究院黄海水产研究所山东青岛266071 青岛大学医学院山东青岛266071

目的:对青岛市售贝类中副溶血性弧菌进行污染状况调查,并对分离菌株进行毒力基因检测和耐药性分析,为贝类产品的食用安全及食源性疾病的防控提供依据。方法:根据GB/T 4789.7-2008标准对贝类中副溶血性弧菌进行分离鉴定,PCR法检测毒力基... 详细信息

目的:对青岛市售贝类中副溶血性弧菌进行污染状况调查,并对分离菌株进行毒力基因检测和耐药性分析,为贝类产品的食用安全及食源性疾病的防控提供依据。方法:根据GB/T 4789.7-2008标准对贝类中副溶血性弧菌进行分离鉴定,PCR法检测毒力基因,K-B法进行药敏试验。结果:143份样品中82份检出副溶血性弧菌,检出率达57.3%,不同品种和不同季节检出率差异显著。从阳性样品中分离到98株副溶血性弧菌,所有菌株均不含毒力基因tdh和trh,大部分菌株对氨苄西林和阿莫西林耐药,耐药率分别为92.9%和71.4%,所有菌株对头孢曲松、头孢吡肟、庆大霉素、卡那霉素、诺氟沙星、环丙沙星、萘啶酸、吡哌酸、氯霉素和呋喃妥因100%敏感。结论:青岛市售贝类副溶血性弧菌污染较严重,存在一定程度的耐药情况,应加强对水产品副溶血性弧菌的监控和抗生素的使用管理。

关键词：贝类副溶血性弧菌污染耐药性

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岩石化学风化力学特性的宏微观定量关联

同济大学学报（自然科学版） 2024年第6期52卷 911-919页

作者：周志豪王华宁蒋明镜同济大学土木工程学院上海200092 同济大学航空航天与力学学院上海200092 同济大学土木工程防灾国家重点实验室上海200092 苏州科技大学土木工程学院江苏苏州215009

为了分析化学风化对岩石力学性能的影响机制,采用密集排列的颗粒集合体模拟岩石材料,将与化学风化时间相关的质量损失率引入颗粒刚度和胶结模型。基于均匀化方法和格构模型,推导获得了风化岩石弹性阶段应力‒应变关系和强度准则以及宏观... 详细信息

为了分析化学风化对岩石力学性能的影响机制,采用密集排列的颗粒集合体模拟岩石材料,将与化学风化时间相关的质量损失率引入颗粒刚度和胶结模型。基于均匀化方法和格构模型,推导获得了风化岩石弹性阶段应力‒应变关系和强度准则以及宏观弹性和强度参数与微观参数(颗粒接触响应特性、风化损伤参数等)的定量关联,并探究了化学风化及其时效性对岩石力学性能的影响规律。结果表明,随着质量损失率的增大以及反应时间的增加,风化岩石的刚度和强度均呈负指数减小;当环境pH值较低时,岩石的峰值黏聚力和峰值内摩擦角随着反应时间的增大均显著降低;当环境pH值较高时,开始阶段岩石的峰值黏聚力显著降低,而峰值内摩擦角变化不大,峰值内摩擦角的显著降低需要更长的风化时间。

关键词：岩石化学风化宏微观时效效应

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