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力生长因子、E肽重组腺病毒的构建及其在神经细胞中的表达

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力生长因子、E肽重组腺病毒的构建及其在神经细胞中的表达

作者：苏永良西南大学

学位级别：硕士

胰岛素样生长因子(IGF-1)是一种通过循环系统发挥功能的内分泌型生理调控因子,在发育过程中通过调节细胞的增殖、分化、凋亡来发挥其作用。成熟的IGF-1是一个由70个氨基酸组成的单链碱性蛋白,在所有变异体中结构相同。IGF-1基因包含6个... 详细信息

胰岛素样生长因子(IGF-1)是一种通过循环系统发挥功能的内分泌型生理调控因子,在发育过程中通过调节细胞的增殖、分化、凋亡来发挥其作用。成熟的IGF-1是一个由70个氨基酸组成的单链碱性蛋白,在所有变异体中结构相同。IGF-1基因包含6个外显子,可通过选择性剪接产生不同mRNA,从而形成不同的变异体,每种变异体都由信号肽、IGF-1多肽和E肽三部分组成。力生长因子(mechano-growth factor, MGF)是IGF-1选择性剪接变异体的一种,其特点是比IGF-1的羧基端多出个延伸肽(extention peptide, E肽),并且由于来自外显子5的49bp(啮齿类动物是52bp)序列的插入,导致外显子6的阅读框发生移码突变,从而产生了特异性的C端24个氨基酸残基的E肽序列(MGF-24E)。研究发现,MGF能够激活肌肉卫星细胞,促进组织再生,在受应力刺激的肌肉、骨骼,以及损伤的神经、肌肉组织中均有发现MGF在局部组织中高表达;而人工合成的MGF-24E多肽同样具有促进多种细胞增殖和存活的作用。MGF-24E又是MGF区别于其它IGF-1剪接异构体的特异性末端延伸肽,由此,研究者推测MGF-24E可能是MGF的作用中心,但目前尚无有力论据,这个问题也成为大家关注的热点。 IGF-1基因选择性剪接产生的多种变异体都具有神经保护作用,其中MGF的作用更为显著。2004年,Aperghis M等首次发现MGF对神经元撕裂造成的神经元损失起到有效保护作用,拉开了MGF神经修复作用研究的序幕;此外,质粒注射MGF至患有肌萎缩性脊髓侧索硬化症的小鼠肌肉细胞,能够促进脊髓运动神经元存活;近期研究表明,MGF能诱导血红素加氧酶表达增加,从而保护SH-SY5Y细胞抵抗由于6-羟多巴胺诱导的细胞调亡。所有的这些研究结果为一些神经损伤疾病,譬如帕金森病的治疗提供了新的思路。MGF作为一个局部作用因子,其作用模式独立于其他变异体。合成的MGF能激活ERK1/2,而不影响Akt的磷酸化,而IGF-1是通过Akt起作用的,由此可推测,MGF可能是独立于IGF-1,通过ERK信号通路发挥增殖作用。MGF作为一种力响应因子,目前其膜上受体仍不明确,其分子机制有待进一步探索。力生长因子在神经损伤修复方面的研究已经取得较大进展,但鉴于以往对其研究多采用MGF重组质粒直接注射受损组织或通过传统原核表达以及化学合成的方法得到目的蛋白,虽操作简便,同时也存在蛋白表达量低、效力不明显、作用周期短、蛋白功能不够完善等问题,从而局限了MGF在临床上的应用。近年来,随着基因治疗和重组疫苗研究的深入,作为其基础的载体的研究有了突匕猛进的发展,腺病毒载体是目前基因治疗中应用最广泛的一种病毒载体。本研究采用Ad-Easy重组腺病毒包装系统,首次成功构建人的MGF及其末端E肽重组腺病毒,并以神经元细胞和神经胶质细胞的典型代表SH-SY5Y和N9细胞为作用对象,在两种细胞中实现过表达,解决了传统方法的局限性。进而比较MGF和MGF-24E对神经细胞增殖作用的差异,全面科学地阐述了力生长因子的神经保护作用,同时为确定MGF的作用位点奠定理论基础。研究主要包括以下内容： 1.分别构建MGF及其E肽重组腺病毒。采用Ad-Easy法进行MGF和MGF-24E重组腺病毒的包装。首先通过序列的比对,采用人工合成的方法,获得人类MGF及其末端24肽基因序列,连接穿梭质粒pAdTrack-cmv,得到pAdTrack-MGF和pAdTrack-24E重组穿梭质粒;重组穿梭质粒电转化含骨架质粒pAdEasy-1的BJ5183感受态细菌,在胞内完成质粒间的同源重组;重组腺病毒质粒线性化后,经脂质体介导,转染HEK293A细胞,完成目的基因腺病毒的包装和增殖,经PCR鉴定,重组腺病毒含有所需目的片段,成功构建了MGF和MGF-24E重组腺病毒。 2.重组腺病毒在神经细胞中的表达鉴定。经包装构建的重组腺病毒,经反复感染增殖,使其效价不断提高,TCID50(50%组织培养感染剂量法)检测病毒滴度,Karber法计算TCID50。结果显示TCID50(MGF)=10-6.2/100μL;TCID50(MGF-24E)=10-53/100μL,达到感染所需效价。分别用MGF和MGF-24E重组腺病毒感染N9、SH-SY5Y细胞,24h后在荧光显微镜下观察。结果显示：两种细胞均能被包装得到的腺病毒高效率感染,胞浆和胞核都有GFP的表达。收集感染细胞,采用超声破碎的方法提取细胞裂解液,SDS-PAGE分析,Anti-6*His-Tag特异性抗体作West em-blot检测,在MGF和MGF-24E重组腺病毒感染的N9、SH-SY5Y细胞中,分别有分子量约为20kD和2.94kD的蛋白条带,与预期值大小

关键词：力生长因子重组腺病毒载体神经修复细胞增殖基因治疗同源重组选择性剪接

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常用数学思想及其在解题中的应用

中学理科（综合） 2006年第11期 17-18页

作者：苏永良广西扶绥县岜盆中学 532102

数学思想是数学中处理问题的基本观点，是对数学基础知识和基本技能提升为能力的体现，只有掌握了数学思想方法，才能真正掌握数学知识，才能将数学知识转化为能力．本文对新课程（华东师大版七年级教材）中的几种数学思想方法及其应用... 详细信息

数学思想是数学中处理问题的基本观点，是对数学基础知识和基本技能提升为能力的体现，只有掌握了数学思想方法，才能真正掌握数学知识，才能将数学知识转化为能力．本文对新课程（华东师大版七年级教材）中的几种数学思想方法及其应用进行归纳介绍。供同学们在教学中参考．

关键词：数学思想方法应用解题数学基础知识华东师大版基本技能数学知识知识转化

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如何维护好您的空调

无线电 2002年第5期 12-13页

作者：苏永良

五氯酚对稀有鮈鲫卵黄蛋白原及p53的诱导效应

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环境科学 2012年第6期33卷 1858-1864页

作者：熊力马永鹏张晓峥金帮明李伟苏永良毛思予刘堰西南大学生命科学学院淡水鱼类资源与生殖发育教育部重点实验室三峡库区生态环境教育部重点实验室水产科学重庆市市级重点实验室重庆400715 重庆市第三人民医院检验科重庆市临床检验中心重庆400016

采用中国特有鱼种稀有鮈鲫为实验动物,研究五氯酚(PCP)对其肝脏卵黄蛋白原(VTG)、VTG基因及抑癌基因p53的诱导效应,评价PCP的内分泌干扰作用,并从蛋白和基因表达水平上筛选PCP检测的敏感生物标志物.1.5、15、40、80、120、150、160μg.L... 详细信息

采用中国特有鱼种稀有鮈鲫为实验动物,研究五氯酚(PCP)对其肝脏卵黄蛋白原(VTG)、VTG基因及抑癌基因p53的诱导效应,评价PCP的内分泌干扰作用,并从蛋白和基因表达水平上筛选PCP检测的敏感生物标志物.1.5、15、40、80、120、150、160μg.L-1PCP暴露稀有鮈鲫,同时设置空白、溶剂对照和17α-雌二醇(EE2)阳性对照,运用SDS-PAGE,ELISA法检测经PCP暴露后稀有鮈鲫肝脏VTG蛋白的表达差异;克隆稀有鮈鲫新的VTG和p53基因序列片段,运用实时荧光定量PCR方法检测PCP暴露对基因表达的影响.结果表明,40、80、120、160μg.L-1PCP均能诱导雌雄稀有鮈鲫肝脏VTG蛋白的表达,具有显著的浓度-效应关系;1.5、15、150μg.L-1PCP暴露后,雄性稀有鮈鲫肝脏VTG和p53基因表达均明显升高,具有显著的浓度-效应和时间-效应关系.证明PCP具有雌激素效应,稀有鮈鲫肝脏的VTG蛋白、VTG及p53基因可作为PCP检测的敏感分子生物标志物.

关键词：五氯酚稀有鮈鲫 VTG p53 分子生物标志物

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凝汽装置性能综合检查曲线

海军工程学院学报 1984年第1期 70-75页

作者：宋继武苏永良

本文在原设计资料的基础上通过近似计算方法得到凝汽装置在变工况工作时的综合性能检查曲线,为运行管理人员提供一种实用、简便及较为准确地判定凝汽装置工作状态的手段,对管理和教学均有一定参考意义。

关键词：凝汽装置性能综合变工况性能综合检查近似计算图线计算方法汽轮机组主冷凝器冷却水量

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猕猴巴氏杆菌病

中国兽医杂志 1993年第12期19卷 26-27页

作者：邓建新唐荣芳苏志廉郑雅卡苏永良吕国钊梧州动植物检疫局广西543002

1991年1月9日,广西实验动物养殖场的猕猴发生了以败血症为特征的疾病,前后3天共死亡6只,经过临床诊断,病理剖检,微生物学的诊断,确诊为由多杀性巴氏杆菌致死,报告如下。

关键词：猴病猕猴巴氏杆菌病

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五氯酚对稀有鮈鲫胚胎毒性效应研究

中国环境科学 2012年第2期32卷 337-344页

作者：熊力马永鹏毛思予苏永良金帮明刘堰西南大学生命科学学院淡水鱼类资源与生殖发育教育部重点实验室水产科学重庆市市级重点实验室重庆400715 重庆市第三人民医院检验科重庆市临床检验中心重庆400016

研究五氯酚(PCP)对稀有鮈鲫(Gobiocypris rarus)胚胎的致畸和毒性效应.以7.5,30,60,120,250μg/L5个浓度的PCP对0hpf(hpf,受精卵孵出时间)的稀有鮈鲫胚胎进行暴露染毒,同时设置空白对照组、二甲基亚砜溶剂对照组和雌二醇(EE2,2.5ng/L)... 详细信息

研究五氯酚(PCP)对稀有鮈鲫(Gobiocypris rarus)胚胎的致畸和毒性效应.以7.5,30,60,120,250μg/L5个浓度的PCP对0hpf(hpf,受精卵孵出时间)的稀有鮈鲫胚胎进行暴露染毒,同时设置空白对照组、二甲基亚砜溶剂对照组和雌二醇(EE2,2.5ng/L)阳性对照组.在立体显微镜下观察整个胚胎的发育过程,统计胚胎的孵化率、96hpf相对存活率和各时期的畸形率,并利用半定量RT-PCR检测胚胎中CYP1A基因和p53基因mRNA的表达.结果表明,PCP暴露能延迟稀有鮈鲫胚胎发育,并造成胚胎卵凝结、心包囊肿、脊柱弯曲等多种畸形甚至死亡.随着PCP暴露浓度的升高,稀有鮈鲫胚胎的孵化率和96hpf相对存活率降低,各时期的畸形率增加,并呈现一定的浓度效应.稀有鮈鲫胚胎CYP1A基因和p53基因mRNA表达被显著诱导,并随PCP浓度的升高而增加.PCP对稀有鮈鲫胚胎发育表现为显著的毒性效应.稀有鮈鲫胚胎孵化率、96hpf相对存活率、各时期畸形率及CYP1A基因和p53基因的诱导表达可以作为评价PCP毒性作用的敏感指标.

关键词：稀有鮈鲫胚胎发育五氯酚毒性效应 CYP1A p53

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继华炼丹器及其炼丹新工艺

继华炼丹器及其炼丹新工艺

第二届全国基层中医药临床应用研究学术交流会

作者：苏表仪苏永良广东省潮安县古巷镇枫三继华门诊

继华炼丹器是供炼制中医疡科要药红升丹,白降丹的专用工具。该器根据丹药生成的化学反应理论,采用冷热水交换升炼白降丹,且温度计测火候,双层封固和集废气、滤气、净化等装置为一体。其造型新颖,结构合理,耐高温,抗腐蚀,既保持了中医传...

继华炼丹器是供炼制中医疡科要药红升丹,白降丹的专用工具。该器根据丹药生成的化学反应理论,采用冷热水交换升炼白降丹,且温度计测火候,双层封固和集废气、滤气、净化等装置为一体。其造型新颖,结构合理,耐高温,抗腐蚀,既保持了中医传统炼丹特色,还具有操作方便,火候易控,又可适应各种炉火炼制,省时、省工、省燃料,减少对环境污染,克服了白降丹降法炼制时有"坠胎"之苦。提高炼制成功率,保证丹药的产量、质量等优点,一套工具既能炼红升丹,又能炼白降丹等。

关键词：

来源： cnki会议评论

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浅谈汽车冲压件成形及其缺陷分析

科协论坛(下半月) 2010年第2期 53-54页

作者：郭瑞景苏永良冯丽娟保定长城华北汽车有限责任公司

主要介绍汽车冲压件的成形及其在生产过程中的缺陷分析。

关键词：汽车冲压件冲压成形缺陷分析