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人椎间盘退变差异性表达microRNA的筛选及验证研究

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人椎间盘退变差异性表达microRNA的筛选及验证研究

作者：臧加成天津医科大学

学位级别：硕士

目的：检测人腰椎间盘髓核细胞microRNA(miRNA)表达谱,筛选退变髓核细胞与正常髓核细胞差异性表达的miRNA,预测差异性表达miRNA的靶基因及信号通路;对显著性差异表达的miR-494和miR-513a-5p在人退变腰椎间盘组织中进行验证。为miRNA在... 详细信息

目的：检测人腰椎间盘髓核细胞microRNA(miRNA)表达谱,筛选退变髓核细胞与正常髓核细胞差异性表达的miRNA,预测差异性表达miRNA的靶基因及信号通路;对显著性差异表达的miR-494和miR-513a-5p在人退变腰椎间盘组织中进行验证。为miRNA在人椎间盘退变发病机制中作用的研究提供实验基础。方法： 1.分别获取腰椎退行性病患者手术取出的髓核组织3份和腰椎骨折患者髓核组织1份,分为退变组和正常组。采用酶消化法从髓核组织中分离出髓核细胞,后放置培养皿中培养。第一代细胞爬片至70%～80%融合时,将细胞爬片取出,对髓核细胞进行染色鉴定;提取标本总RNA,采用miRNA微阵列技术检测两组细胞中miRNA表达谱,筛选出差异表达的miRNAs;采用MicroCosm v5、TargetScan5.1和***软件预测差异性miRNAs的靶基因;将差异基因或靶基因进行Gene Ontology (GO)分析;统计每个GO term中所包括的差异基因或靶基因个数,并用Fisher精确检验的统计方法计算每个GO term中差异基因或靶基因富集的显著性;后将得到的差异基因或靶基因进行Pathway显著性分析,分析每个Pathway中所包含的差异基因或靶基因个数,用超几何分布的统计检验方法计算出反映Pathway中差异基因或靶基因分布富集显著性的Pvalue,根据Pvalue大小找出与差异基因或靶基因功能显著相关的生物通路。 2.分别获取腰椎退行性病患者手术取出的髓核组织5份和腰椎骨折患者髓核组织2份,分为退变组和正常组。手术取出标本后即刻保存于RNA保存液中,4℃保存过夜,取出后将髓核组织进行分离。首先将每个标本的一部分做病理切片、染色验证其退变性;然后另一部分标本采用Real-time qPCR技术对miR-494和miR-513a-5p差异性表达检测。包括RNA提取,miRNA反转录,实时荧光定量PCR;按照ΔΔCt解析法来进行实验设计,采用染料法(SYBR Green I)进行相对定量分析。结果：退变及正常的髓核细胞经过酶消化法分离、培养后均呈典型的髓核细胞形态。通过miRNA微阵列分析发现退变组中呈差异性上调的miRNAs有20种(miR-21*、miR-663、miR-29c*、miR-638、miR-572、miR-1225-5p、miR-513a-5p、 miR-101、miR-1275、miR-10b、miR-923、miR-195、miR-575、miR-181d、miR-494、 miR-765、miR-210、miR-497、miR-483-5p、miR-345)。其中,miR-513a-5p和miR-494呈显著性高表达,Ratio值分别为2.2222和2.9485;综合三种软件MicroCosm v5、TargetScan5.1和***预测得出miR-513a-5p和miR-494的靶基因分别为MKK4和JunD,此两种靶基因均参与JNK信号通路,且两个靶基因在此通路中均显著上调。通过对病理切片和染色证实了退变和正常髓核组织的特点;通过Real-timeqPCR技术检测显示退变组中miR-513a-5p与miR-494较正常组均呈现明显的高表达,差异倍数2-ΔΔα值分别为47.3660±39.0525和13.5560±7.9860(P<0.05),差异具有统计学意义,两种miRNA高表达的差异倍数较基因芯片筛选结果更为明显。验证了微阵列差异基因筛选结果的可靠性和准确性。结论：本研究首次通过miRNA微阵列技术对人腰椎间盘髓核细胞进行了miRNA表达谱分析,筛选出退变椎间盘中差异性表达上调的miRNAs共20种,其中miR-513a-5p和miR-494呈现非常显著性上调;预测出miR-513a-5p和miR-494对应的靶基因MKK4和JunD,及其可能共同参与并发挥作用的信号传导通路JNK通路;Real-time qPCR实验技术验证了miR-513a-5p和miR-494在退变髓核组织中的同样呈现显著性差异高表达,与微阵列筛选结果完全一致。为进-步在基因水平研究椎间盘退变的发病机制获得了新的突破口,为将来可能实现的基因诊断、基因干预治疗以及疾病的预防奠定一定的实验基础。

关键词：微小RNA椎间盘退变髓核微阵列实时荧光定量PCR靶基因

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双膦酸盐相关性非典型股骨骨折临床诊疗进展

中华骨科杂志 2018年第15期38卷 943-952页

作者：臧加成马信龙天津市天津医院骨科 300211

双膦酸盐已成为临床治疗骨质疏松的一线药物,其通过抑制破骨细胞活性和增加骨密度来降低脆性骨折风险.双膦酸盐治疗骨质疏松的同时,会伴随一些不良反应的发生,其中双膦酸盐相关性非典型股骨骨折（atypical femoral fractures,AFF）逐渐... 详细信息

双膦酸盐已成为临床治疗骨质疏松的一线药物,其通过抑制破骨细胞活性和增加骨密度来降低脆性骨折风险.双膦酸盐治疗骨质疏松的同时,会伴随一些不良反应的发生,其中双膦酸盐相关性非典型股骨骨折（atypical femoral fractures,AFF）逐渐被关注和认识.AFF具有典型的临床特征,患者多有长期双膦酸盐服用史,无创伤或低能量创伤或扭转造成的股骨转子下或股骨干骨折.AFF的X线表现为横行或短斜形骨折,内侧皮质呈“尖峰”状,骨折区域骨皮质因出现局部或弥漫性骨膜反应而表现为骨皮质增厚.AFF的病理机制尚不明确,大多认为与长期服用双膦酸盐而严重抑制骨转换有关,其他的学说包括：胶原异常与交联增加学说、矿物质异常学说、低磷酸酯酶症综合征样表现学说等.尽管AFF绝对发病率很低,但随着老龄化骨质疏松患者数量的激增和双膦酸盐应用的社会广泛化,AFF数量必然会随之增多,须引起临床的重视.AFF风险因素包括：双膦酸盐长期服用史,糖皮质激素治疗史,女性,在骨折发生前数月或数周出现大腿或腹股沟处疼痛、不适、无力等前驱症状;另外,股骨干的弯曲程度与AFF骨折部位具有相关性.目前,治疗AFF的观点是：①完全骨折,行股骨全长、扩髓髓内钉固定;②不全骨折,同样也考虑行预防性髓内钉固定治疗.AFF骨折愈合时间明显增长,治疗后最常见的并发症是延迟愈合和不愈合,延迟愈合发生率可高达26％,临床如何提高此类骨折的疗效尚需要进一步研究.通过检索AFF的相关文献,全面了解其临床特点、诊断标准、发病率、相关风险因素、病理机制、治疗方法及并发症发生的最新研究进展.

关键词：股骨骨折双膦酸盐临床诊疗相关性非典型扩髓髓内钉固定患者数量股骨干骨折

腰椎间盘MRI高信号区与椎间盘造影阳性相关性的Meta分析

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中国脊柱脊髓杂志 2014年第5期24卷 427-432页

作者：臧加成马信龙王涛马剑雄田鹏韩超天津市天津医院骨科 300211

目的：系统评价腰椎间盘MRI高信号区（HIZ）与椎间盘造影阳性的相关性。方法：计算机检索1973年1月-2013年4月MEDLINE、EMBASE、CochraneCENTRAL（First Quarter 2013）、ScienceDirect、OVID、Springer—Link、中国生物医学文献数据库。纳入文献为腰痛患者接受腰椎MRI和椎间盘造影检查、并对MRI所观察到的HIZ与椎间盘造影检查椎间盘形态学变化和疼痛复制现象进行相关性比较的临床观察性研究．筛选出符合纳入标准的文献，评价纳入研究的方法学质量。利用RevMan5．1．1（下载于CochraneLibrary）对提取数据进行Meta分析。结果：经过筛选，11篇文献符合纳入标准。Meta分析结果显示：HIZ阳性与椎间盘造影中椎间盘形态不正常存在显著相关性，有统计学意义[OR=47．79，95％CI（17．07，133．77），P〈0．00001]；HIZ阳性的椎间盘在造影中产生一致性疼痛的发生率（79％，309／393）高，与HIZ阴性（29％，237／805）比较有统计学差异[OR=8．65，95％CI（4．92，15.23），P〈0．00001]；HIZ阳性且椎间盘形态异常的节段产生一致性疼痛的发生率高（90％，211／235），与HIZ阴性（34％，87／257）比较有统计学差异[OR=8．65，95％CI（4．92，15．23），P=0．007]。结论：腰椎间盘MRIHIZ的出现预示着椎间盘形态的异常．HIZ阳性与椎间盘造影疼痛复制之间存在明显的相关性，HIZ可作为临床责任间隙判断及椎间盘源性腰痛诊断的一个有效指标．

关键词： MRI 高信号区椎间盘造影椎间盘源性腰痛 Meta分析

髋关节翻修术中应用Cup-in-Cup技术重建PaproskyⅢ型髋臼骨缺损的早期疗效

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中华骨科杂志 2022年第9期42卷 579-586页

作者：臧加成赵秀祥马信龙张银光天津市天津医院髋关节外科天津300211

目的探讨髋关节翻修术中采用Cup-in-Cup技术重建PaproskyⅢ型髋臼骨缺损的早期疗效。方法2017年1月至2019年12月采用Cup-in-Cup技术重建PaproskyⅢ型髋臼骨缺损20例(20髋),男9例、女11例;年龄(64.6±9.8)岁(范围45~76岁)。翻修原因为假... 详细信息

目的探讨髋关节翻修术中采用Cup-in-Cup技术重建PaproskyⅢ型髋臼骨缺损的早期疗效。方法2017年1月至2019年12月采用Cup-in-Cup技术重建PaproskyⅢ型髋臼骨缺损20例(20髋),男9例、女11例;年龄(64.6±9.8)岁(范围45~76岁)。翻修原因为假体无菌性松动17例、假体周围感染导致假体松动3例;PaproskyⅢA型髋臼骨缺损13例、PaproskyⅢB型7例。采用单纯髋臼侧翻修13例,髋臼和股骨侧同时翻修7例。术后随访时评估Harris髋关节评分,统计术中血管、神经损伤和术后假体脱位、假体周围感染及骨折等严重并发症的发生情况,通过X线片测量髋关节旋转中心高度和水平位置。结果翻修手术时间为(110±25)min(范围80~180 min);术中出血量为(700±180)ml(范围500~1600 ml)。20例均获得随访,随访时间12~36个月,平均18个月。末次随访时16例Harris髋关节评分在80分以上,2例评分为优、14例为良、4例为可;Harris评分为(84.3±7.5)分,较术前的(40.1±16.6)分提高,差异有统计学意义(t=15.34,P<0.001)。末次随访时患侧髋关节旋转中心高度由术前(34.2±3.3)mm降低至(18.6±2.8)mm,差异有统计学意义(t=15.11,P<0.001);水平距离由术前(18.1±5.5)mm增加至(26.2±7.3)mm,差异有统计学意义(t=-5.95,P<0.001);术后患侧髋关节旋转中心高度较对侧[(12.2±3.3)mm]轻度上移,差异有统计学意义(t=6.73,P=0.018);水平位置为(26.2±7.3)mm,与对侧(30.1±5.5)mm比较差异无统计学意义(t=-3.29,P=0.381)。无一例出现血管、神经损伤、假体周围感染及切口相关并发症。随访期间假体位置良好,无假体松动及螺钉松动、断裂。结论髋关节翻修术中采用Cup-in-Cup技术重建PaproskyⅢ型髋臼骨缺损能获得较好的早期疗效,重建相对正常的髋关节旋转中心,假体初始稳定性和早期稳定性良好。

关键词：关节成形术,置换,髋再手术髋臼

微创椎间盘切除与标准切除术治疗腰椎间盘突出症的Meta分析

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中国脊柱脊髓杂志 2010年第11期20卷 938-944页

作者：臧加成马信龙马剑雄王涛田鹏韩超天津医科大学总医院骨科天津市300052 天津市天津骨科医院天津市300211

目的:系统评价微创椎间盘切除术与标准开放椎间盘切除两种手术方式治疗腰椎间盘突出症的疗效。方法:计算机检索MEDLINE(1977年～2010年5月)、EMBASE(1977年～2010年5月)、Cochrane ControlledClinical Trials Register(2010第1期)、Current Controlled Trials(2003年5月～2010年5月)、中国生物医学文献数据库(1984年～2010年5月),手工检索相关杂志。搜集国内外关于微创椎间盘切除术与标准开放椎间盘切除术治疗腰椎间盘突出症疗效比较的随机对照试验(RCT)。制定入选和剔除标准,筛选出符合纳入标准的文献,评价纳入研究的方法学质量。利用RevMan5.0(Cochrane Library)进行Meta分析。结果:共有9篇研究符合纳入标准,共1109例患者,微创椎间盘切除术654例,标准开放椎间盘切除455例。Meta分析结果显示:微创椎间盘切除术与标准开放椎间盘切除术比较,前者平均手术时间长于后者(P<0.05),术中出血量少于后者(P<0.01),术后腰痛VAS评分优于后者(P<0.01);在住院时间、并发症发生率、二次手术率、术后腿痛VAS评分及术后JOA评分,两者差异无统计学意义。结论:微创椎间盘切除术与标准开放椎间盘切除术治疗腰椎间盘突出症都取得了良好的疗效,在术中出血量、术后腰痛改善方面微创手术优于后者,但手术时间长于后者,总体疗效并无显著差异。

关键词：腰椎间盘突出症微创椎间盘切除术开放椎间盘切除术 Meta分析

颈椎前路减压椎间融合器或自体骨植骨融合治疗颈椎病的Meta分析

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中国脊柱脊髓杂志 2012年第1期22卷 37-43页

作者：臧加成马信龙王涛马剑雄田鹏韩超天津医科大学总医院骨科天津市300052 天津骨科医院天津市300211

目的:系统评价颈椎前路减压椎间融合器(cage)或自体骨植骨融合治疗颈椎病的疗效。方法:计算机检索MEDLINE、EMBASE、Cochrane CENTRAL(First Quarter 2011)、ScienceDirect、OVID、SpringerLink、中国生物医学文献数据库7个数据库(时间... 详细信息

目的:系统评价颈椎前路减压椎间融合器(cage)或自体骨植骨融合治疗颈椎病的疗效。方法:计算机检索MEDLINE、EMBASE、Cochrane CENTRAL(First Quarter 2011)、ScienceDirect、OVID、SpringerLink、中国生物医学文献数据库7个数据库(时间截至2011年6月),手工检索Spine、Euro Spine、JBJS、中华骨科、中国脊柱脊髓等相关杂志,纳入关于颈椎前路减压椎间融合器或自体骨植骨融合治疗颈椎病的RCT研究,评价纳入研究的方法学质量。利用RevMan5.1.1(下载于Cochrane Library)进行Meta分析。选取平均手术时间、失血量、住院时间、并发症发生率、融合率、优良率、取骨处疼痛等指标进行比较。结果:经过筛选,11篇研究符合纳入标准,共1139个病例。纳入研究的质量评价等级均较高(A级10个,B级1个)。Meta分析结果显示:颈椎椎间融合器(cage)融合组与自体骨植骨融合组比较,前者平均术中失血量少于后者[MD=-8.42,95%CI(-15.59,-1.25),P=0.02],平均住院时间短于后者[MD=-0.31,95%CI(-0.62,-0.01),P=0.05],术后并发症发生率小于后者[OR=0.56,95%CI(0.37,0.83),P=0.004],取骨处疼痛二者间存在统计学差异[OR=0.06,95%CI(0.01,0.27),P=0.0002];平均手术时间[MD=-14.55,95%CI(-30.79,1.69),P=0.08]、融合率[OR=1.44,95%CI(0.70,2.96),P=0.32]、优良率[OR=1.39,95%CI(0.92,2.09),P=0.12],两种融合方式之间差异无统计学意义。结论:颈椎椎间融合器(Cage)与自体骨植骨融合治疗颈椎病都取得了良好的疗效。应用cage行椎间融合可以减少术中出血量,缩短住院时间,减少并发症尤其是取骨处疼痛的发生,并且在平均手术时间、融合率、优良率等方面与自体骨植骨融合效果相同。

关键词：颈椎病椎间融合器自体骨植骨融合 Meta分析

近侧骨折段向前成角移位的股骨粗隆间骨折治疗经验

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中国修复重建外科杂志 2018年第9期32卷 1162-1166页

作者：王敬博于树军李辰臧加成王裕民天津医院创伤髋关节一病区天津300211

目的探讨近侧骨折段向前成角移位的股骨粗隆间骨折的特点及治疗措施。方法 2015年3月—2016年3月采用手术切开复位、髓内钉固定治疗40例近侧骨折段向前成角移位的股骨粗隆间骨折患者。男11例,女29例;年龄56～87岁,平均75.7岁。致伤原因... 详细信息

目的探讨近侧骨折段向前成角移位的股骨粗隆间骨折的特点及治疗措施。方法 2015年3月—2016年3月采用手术切开复位、髓内钉固定治疗40例近侧骨折段向前成角移位的股骨粗隆间骨折患者。男11例,女29例;年龄56～87岁,平均75.7岁。致伤原因:交通事故伤1例,摔伤39例。体质量指数18.9～33.8 kg/m2,平均24.3 kg/m2。受伤至入院时间2～360 h。骨折按照AO-OTA分型:A1.2型7例,A1.3型1例,A2.1型6例,A2.2型9例,A2.3型12例,A3.2型2例,A3.3型3例。记录患者入院时、术前以及术后最低血红蛋白(haemoglobin,Hb)值,住院期间输血量和手术显性出血量。采用简明健康调查量表(SF-36量表)评估患者伤前及术后12周生活质量,疼痛视觉模拟评分(VAS)评估入院时及术后2 d疼痛程度。根据术后X线片及临床检查判断骨折愈合情况。术后12周采用Harris评分评价患侧髋关节功能。结果患者入院时Hb为(114.33±14.93)g/L,术前最低Hb为(99.10±16.48)g/L,差异有统计学意义(t=9.134,P=0.000)。11例术前输血(520.00±269.98)m L。手术显性出血量(373.08±154.68)m L,术中输血量为(569.23±207.94)m L。术后患者最低Hb为(105.41±13.36)g/L,8例患者术后再次输血(500.00±185.16)m L。术后3 d按照改良Baumgaertner法评价骨折复位情况:优16例,良18例,差6例。40例获随访,随访时间12～15周,平均12.8周。术后切口无感染发生。术后2 d VAS评分为(3.2±0.5)分,较入院时的(8.2±0.5)分显著改善(t=37.500,P=0.000)。术后12周骨折均愈合;患侧髋关节Harris评分为(82.5±6.9)分;SF-36量表评分为(51.4±11.5)分,较伤前(54.9±11.5)分显著降低(t=18.901,P=0.000)。术后4例出现谵妄,8例感染肺炎,5例泌尿系统感染,2例出现静脉血栓形成,均经相应处理后治愈。结论近侧骨折段向前成角移位的股骨粗隆间骨折是一种难复位、不稳定型骨折,术中需要通过辅助器械达到骨折良好复位,解剖对位是取得良好疗效的首要条件,同时需注意及时纠正患者贫血。

关键词：股骨粗隆间骨折向前成角移位解剖对位复位

Wnt/β-catenin及NF-кB信号通路与椎间盘退变的研究进展

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中国修复重建外科杂志 2013年第12期27卷 1523-1528页

作者：孔敬波马信龙王涛马剑雄田鹏韩超臧加成李鹏飞姜宏强天津医院天津市中西医结合骨科研究所天津300211 天津医科大学总医院骨科骨科生物力学实验室

目的综述Wnt/β-catenin及NF-кB信号通路在椎间盘退变过程中作用机制的研究进展。方法查阅Wnt/β-catenin及NF-кB信号通路在椎间盘退变过程中作用的相关文献,并进行分析总结。结果 Wnt/β-catenin及NF-кB信号通路在椎间盘退变过程中... 详细信息

目的综述Wnt/β-catenin及NF-кB信号通路在椎间盘退变过程中作用机制的研究进展。方法查阅Wnt/β-catenin及NF-кB信号通路在椎间盘退变过程中作用的相关文献,并进行分析总结。结果 Wnt/β-catenin及NF-кB信号通路在椎间盘退变过程中均被激活,且存在相互作用,但是它们在椎间盘退变过程中的具体作用机制以及相互作用的中间介质尚不清楚。结论 Wnt/β-catenin及NF-кB信号通路在椎间盘退变过程中的作用仍需深入研究。

关键词： Wnt β-catenin NF—κB 椎间盘退变信号通路

MRI上腰椎终板信号改变的影响因素分析——性别、体重、劳动量及吸烟与Modic改变的相关性

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中国脊柱脊髓杂志 2011年第3期21卷 222-225页

作者：韩超马信龙马剑雄王涛田鹏臧加成天津医科大学总医院骨科 300052 天津市天津医院 300211 天津市中西医结合骨科研究所天津市300211

目的:探讨腰腿痛患者腰椎MRI上终板Modic改变的分布特点及其相关因素。方法:回顾性分析我院2009年2月～2010年10月收治的210例腰腿痛患者腰椎MRI中Modic改变的发生率及类型,并评估Modic改变与性别、体重、劳动量及吸烟等因素的相关性。... 详细信息

目的:探讨腰腿痛患者腰椎MRI上终板Modic改变的分布特点及其相关因素。方法:回顾性分析我院2009年2月～2010年10月收治的210例腰腿痛患者腰椎MRI中Modic改变的发生率及类型,并评估Modic改变与性别、体重、劳动量及吸烟等因素的相关性。结果:47例患者共58个椎间盘邻近椎板存在Modic改变,占入选患者的22.4%。其中男16例;女31例,ModicⅠ型、Ⅱ型和Ⅲ型的人数分别为16例、25例、6例,出现Modic改变的节段为L5/S1(28个)、L4/5(17个)、L3/4(9个)、L2/3(4个)。在肥胖人群中Modic改变的发生率高于正常体重和超重人群(P0.05)。吸烟与Modic改变无明显相关性(P>0.05)。结论:患者的性别、体重及劳动量等因素与Modic改变的发生具有相关性,生物力学损伤可能在Modic改变中发挥着重要作用。

关键词：腰椎 Modic改变椎间盘终板 MRI