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高糖微环境下P62对人表皮细胞株HaCaT迁移和运动性的影响及其机制

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中华烧伤与创面修复杂志 2022年第11期38卷 1014-1022页

作者：张喻平张琼邓芳陈兵张均辉胡炯宇陆军军医大学(第三军医大学)第一附属医院内分泌科重庆400038 陆军军医大学(第三军医大学)第一附属医院全军烧伤研究所创伤、烧伤与复合伤国家重点实验室重庆400038 重庆大学附属肿瘤医院老年肿瘤科缓和医疗科重庆400030

目的研究高糖微环境下P62蛋白对人表皮细胞株HaCaT迁移和运动性的影响及其可能的分子机制,以探讨糖尿病足创面难愈合的机制。方法采用实验研究方法。取对数生长期HaCaT进行实验。取细胞,按随机数字表法(分组方法下同)分为正常对照组(培... 详细信息

目的研究高糖微环境下P62蛋白对人表皮细胞株HaCaT迁移和运动性的影响及其可能的分子机制,以探讨糖尿病足创面难愈合的机制。方法采用实验研究方法。取对数生长期HaCaT进行实验。取细胞,按随机数字表法(分组方法下同)分为正常对照组(培养液含终物质的量浓度5.5 mmol/L的葡萄糖)及高糖(培养液含终物质的量浓度30.0 mmol/L的葡萄糖)24 h组、高糖48 h组、高糖72 h组。正常对照组细胞行常规培养72 h,高糖72 h组细胞行高糖培养72 h,高糖48 h组细胞先常规培养24 h再高糖培养48 h,高糖24 h组细胞先常规培养48 h再高糖培养24 h后,采用蛋白质印迹法检测P62蛋白表达。取细胞,分为正常对照组、高糖组,分别同前培养48 h后,采用免疫荧光法检测P62蛋白表达(以绿色荧光表示)。取细胞,分为阴性对照小干扰RNA(siRNA)组、P62-siRNA-1组、P62-siRNA-2组、P62-siRNA-3组,并转染相应试剂,于转染后72 h,采用蛋白质印迹法检测P62蛋白表达。取细胞,分为正常糖+阴性对照siRNA组、正常糖+P62-siRNA组、高糖+阴性对照siRNA组、高糖+P62-siRNA组,并行相应处理,于转染后72 h,采用蛋白质印迹法检测P62蛋白表达;行划痕试验检测并计算划痕后24 h细胞迁移率(样本数为9);在活细胞工作站下,观察3 h内细胞运动范围并计算运动速度(正常糖+阴性对照siRNA组、正常糖+P62-siRNA组、高糖+阴性对照siRNA组、高糖+P62-siRNA组观察细胞数分别为76、75、80、79个)。取细胞,分为正常糖+磷酸盐缓冲液(PBS)组、高糖+PBS组、高糖+N-乙酰半胱氨酸(NAC)组,行相应处理后,于培养48 h,分别采用蛋白质印迹法及免疫荧光法检测P62蛋白表达。除划痕试验外,其余实验各组样本数均为3。对数据行单因素方差分析、LSD检验。结果与正常对照组比较,高糖24 h组、高糖48 h组及高糖72 h组细胞P62蛋白表达量均明显增加(P<0.01)。培养48 h,高糖组细胞中P62的绿色荧光强于正常对照组。转染后72 h,与阴性对照siRNA组比较,P62-siRNA-1组、P62-siRNA-2组和P62-siRNA-3组细胞P62蛋白表达量均明显减少(P<0.01)。转染后72 h,与正常糖+阴性对照siRNA组比较,正常糖+P62-siRNA组细胞P62蛋白表达量明显减少(P<0.01),高糖+阴性对照siRNA组细胞P62蛋白表达量明显增加(P<0.01);与高糖+阴性对照siRNA组比较,高糖+P62-siRNA组细胞P62蛋白表达量明显减少(P<0.01)。划痕后24 h,与正常糖+阴性对照siRNA组[(55±7)%]比较,正常糖+P62-siRNA组细胞迁移率明显升高[(72±14)%,P<0.01],高糖+阴性对照siRNA组细胞迁移率明显下降[(37±7)%,P<0.01];与高糖+阴性对照siRNA组比较,高糖+P62-siRNA组细胞迁移率明显升高[(54±10)%,P<0.01]。观察3 h内,高糖+阴性对照siRNA组细胞运动范围较正常糖+阴性对照siRNA组缩小,正常糖+P62-siRNA组细胞运动范围较正常糖+阴性对照siRNA组增大,高糖+P62-siRNA组细胞运动范围较高糖+阴性对照siRNA组增大。与正常糖+阴性对照siRNA组比较,正常糖+P62-siRNA组细胞运动速度明显增加(P<0.01),高糖+阴性对照siRNA组细胞运动速度明显下降(P<0.01);与高糖+阴性对照siRNA组比较,高糖+P62-siRNA组细胞运动速度明显增加(P<0.01)。培养48 h,与正常糖+PBS组比较,高糖+PBS组细胞P62蛋白表达量明显增加(P<0.01);与高糖+PBS组比较,高糖+NAC组细胞P62蛋白表达量明显减少(P<0.01)。培养48 h,高糖+PBS组细胞中P62的绿色荧光强于正常糖+PBS组,而高糖+NAC组细胞中P62的绿色荧光弱于高糖+PBS组。结论在HaCaT中,高糖微环境可促进P62蛋白表达;敲减P62蛋白可促进其迁移并增加运动性;高糖微环境下活性氧增加可能是P62表达增加的潜在机制。

关键词：糖尿病足活性氧细胞迁移分析 P62 高糖创面修复

黄芪调控内源性保护机制减轻缺氧心肌细胞氧化损伤的研究

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黄芪调控内源性保护机制减轻缺氧心肌细胞氧化损伤的研究

作者：胡炯宇第三军医大学

学位级别：硕士

我们以往的研究表明,严重烧伤后早期(在因毛细血管通透性增加导致有效循环血容量显著减少之前)即出现的心肌损害及心脏泵血功能减弱,不仅引起心功能不全,还可诱发或加重休克,成为烧伤早期缺血缺氧的重要启动因素之一。根据这一认识,提... 详细信息

我们以往的研究表明,严重烧伤后早期(在因毛细血管通透性增加导致有效循环血容量显著减少之前)即出现的心肌损害及心脏泵血功能减弱,不仅引起心功能不全,还可诱发或加重休克,成为烧伤早期缺血缺氧的重要启动因素之一。根据这一认识,提出了烧伤早期缺血缺氧损害的“休克心”假说。因此,防治烧伤后“休克心”对减轻严重烧伤早期缺血缺氧损害具有重要临床意义,但目前尚缺乏有效措施。缺血缺氧时心肌细胞内活性氧(ROS)蓄积所致的氧化损伤是心肌损伤的重要原因。清除ROS可以有效减轻心肌细胞损伤,是防治缺血缺氧心肌损害的一个重要方向。黄芪的主要化学成分有皂甙、黄酮、多糖、微量元素,以及氨基酸、亚油酸等。它对缺血缺氧心肌具有保护作用,作用机制不甚清楚,限制了对它的深入研究和推广应用。黄芪甲苷是一种从黄芪中提取的皂甙类化合物,《中国药典》中以其作为判断黄芪及其制品,如黄芪口服液的质量标准。槲皮素是黄芪黄酮类化合物中含量较高的一种。这两种单体清除ROS,减轻其他疾病导致的心肌氧化损伤的作用均已见报道,但对烧伤早期缺氧心肌细胞氧化损伤的保护作用,以及是否通过调控内源性保护机制减轻缺氧心肌细胞氧化损伤,还缺乏研究。一、研究目的: 本研究选取这两种具有代表性的黄芪单体,旨在观察比较它们对缺氧心肌细胞氧化损伤的作用并确定其量效关系;选择效果较好的一种单体和剂量,深入探讨其除ROS的机制,明确黄芪甲苷是否通过调控内源性抗氧化机制减轻缺氧心肌细胞氧化损伤,为临床防治烧伤后“休克心”提供新的思路和实验依据。二、材料方法: 1.分离培养SD乳鼠心肌细胞,在94%N、5%CO、1% O的混合气体中培养,制作缺氧模型,缺氧时间为12h。 2.将细胞随机分为常氧组(A组)、单纯缺氧组(B组)、缺氧+槲皮素组(C组,C组100 mg/L、C组50 mg/L、C组25 mg/L)、缺氧+黄芪甲苷组(D组,D组50mg/L、D组25 mg/L、D组12.5 mg/L),缺氧+维生素E组(E组10 mg/L)。槲皮素、黄芪甲苷浓度根据已有文献和预实验确定。 3.每组设3个复孔,重复3次,检测常氧、缺氧和缺氧条件下黄芪单体作用前后各组心肌细胞活力(CCK-8)、超氧化物歧化酶(SOD)活性和培养液中乳酸脱氢酶(LDH)、丙二醛(MDA)的含量;根据检测结果,槲皮素、黄芪甲苷组分别选择一种剂量,检测其作用前后缺氧细胞内ROS浓度的变化。 4.根据以上实验结果,挑选黄芪甲苷(25mg/L)进一步研究其清除ROS的机制。 5.利用化合反应使FITC或HRP与黄芪甲苷分子连接,以达到标记和示踪黄芪甲苷分子的目的。在荧光倒置显微镜、激光共聚焦显微镜或透射电子显微镜下观察标记后的黄芪甲苷分子入胞和胞内分布情况。 6.试剂盒检测黄芪甲苷在体外自由基生成体系中清除羟自由基(OH)、超氧阴离子(O)的能力。 7.用SOD阻断剂DDC阻断内源性SOD活性后,检测黄芪甲苷清除缺氧心肌细胞内ROS的能力的变化情况。 8.采用逆转录-聚合酶联反应(RT-PCR)法检测常氧和缺氧(缺氧时间为12h或3h)情况下黄芪甲苷作用前后心肌细胞SOD-1 mRNA表达量的变化。 9.采用免疫蛋白质印迹(Western blotting)法检测常氧和缺氧(缺氧时间为12h)情况下黄芪甲苷作用前后心肌细胞SOD-1蛋白表达量的变化。 10.所有数据以均数±标准差表示,实验结果采用SPSS11.0统计学软件进行单因素方差分析One-Way ANOVA或均值t检验,P<0.05为差异显著,P<0.01为非常显著。三、主要结果 1.单纯缺氧组培养液中LDH、MDA浓度和细胞中的ROS浓度较常氧组明显升高,细胞活力、SOD活性下降。缺氧+槲皮素(2500 mg/L)组、缺氧+黄芪甲苷(12.50 mg/L)组、缺氧+维生素E(10mg/L)组培养液中LDH、MDA浓度和细胞中ROS浓度较单纯缺氧组下降,细胞活力、SOD活性回升。黄芪甲苷、槲皮素的中剂量和大剂量组(C-2、D-2)改善各个指标的作用均优于黄芪甲苷、槲皮素低剂量组(C、D)和维生素E(10mg/L)组。同等剂量(C与D,C与D)相比,黄芪甲苷组降低LDH浓度和提高细胞活力的作用优于槲皮素组,但二者降低MDA、ROS浓度、提高SOD活性的作用无显著差异。 2.合成并提纯了黄芪甲苷-BSA-FITC和黄芪甲苷-BSA-HRP化合物。分别在495nm(FITC在此处有特征吸收率)、403nm(HRP在此处有特征吸收率)处测吸光度,根据标准曲线确定化合物中FITC、HRP浓度,结果如下:FITC:7.2mg/L,HRP:44mg/L。 3.荧光倒置显微镜和激光共聚焦显微镜下观察黄芪甲苷-BSA-FITC胞内分布情况,可见心肌细胞胞浆中有弥散的绿色荧光,分布不均,胞核中无荧光分布;透射电镜下观察黄芪甲苷-BSA-HRP分布情况,可见高电子密度的黑褐色粗大颗粒分布于线粒体膜上,

关键词：肌细胞心脏细胞低氧氧化应激槲皮素黄芪甙维生素E 细胞保护超氧化物歧化酶羟自由基超氧阴离子

循证医学与PBL教学结合在内分泌教学中的应用

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重庆医学 2016年第35期45卷 5028-5029页

作者：胡炯宇陈兵第三军医大学西南医院内分泌科重庆400038

内分泌疾病是指具有内分泌功能的器官和组织的功能和（或）结构异常导致的症候群。内分泌系统在生理和病理学上与其他各系统密切相关,内分泌及代谢性疾病作为内科学的重要组成部分,与其他学科联系紧密。近年来,分子生物学、免疫学、遗... 详细信息

内分泌疾病是指具有内分泌功能的器官和组织的功能和（或）结构异常导致的症候群。内分泌系统在生理和病理学上与其他各系统密切相关,内分泌及代谢性疾病作为内科学的重要组成部分,与其他学科联系紧密。近年来,分子生物学、免疫学、遗传学等学科的发展使内分泌学疾病的理论和临床水平不断提高,

关键词：内分泌功能 PBL教学循证医学内分泌疾病内分泌系统应用代谢性疾病分子生物学

脂肪甘油三酯脂肪酶基因敲除对C57BL/6鼠肾脏结构和功能的影响

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第三军医大学学报 2016年第10期38卷 1107-1110页

作者：陈文胡炯宇陈兵第三军医大学西南医院内分泌科重庆400038

目的研究脂肪甘油三酯脂肪酶(adipose triglyceride lipase,ATGL)基因敲除对C57BL/6鼠肾脏结构和功能的影响。方法将Atgl+/-小鼠通过近亲交配繁殖得到Atgl基因敲除纯合子小鼠(Atgl^(-/-)鼠)和野生型鼠(Atgl^(+/+)鼠),通过观察Atgl^(-/-... 详细信息

目的研究脂肪甘油三酯脂肪酶(adipose triglyceride lipase,ATGL)基因敲除对C57BL/6鼠肾脏结构和功能的影响。方法将Atgl+/-小鼠通过近亲交配繁殖得到Atgl基因敲除纯合子小鼠(Atgl^(-/-)鼠)和野生型鼠(Atgl^(+/+)鼠),通过观察Atgl^(-/-)鼠和Atgl^(+/+)鼠肾脏结构和功能差异来研究Atgl基因敲除对小鼠肾脏结构和功能影响。实验分为对照组(Atgl^(+/+)鼠)及实验组(Atgl^(-/-)鼠),为保证实验结果的一致性,实验所用所有小鼠均为雄性;8~10周龄;体质量约20 g;每组8只。ELISA检测各组小鼠尿肌酐及尿白蛋白浓度,通过计算尿白蛋白肌酐比反映肾功能变化。HE染色及透射电镜分别观察各组小鼠肾皮质病理及超微病理改变。油红O染色观察脂肪在各组小鼠肾脏分布。肾脏组织TG定量检测比较两种小鼠肾脏TG含量差异。结果 Atgl^(-/-)鼠尿白蛋白肌酐比显著高于对照组[(4 219.0±2 331.8)g/mol vs(329.8±175.6)g/mol,P0.05]。HE染色显示Atgl^(-/-)鼠肾小管肿胀,肾小囊明显缩小,油红O染色结果提示肾小球及肾小管均有弥漫性脂滴聚集,以肾小管为主。肾脏组织TG检测结果提示Atgl^(-/-)鼠每毫克肾脏中TG含量显著高于Atgl^(+/+)鼠[(39.89±5.14)μg vs(2.18±0.58)μg,P<0.05]。透射电镜进一步证实了这一点,并发现Atgl^(-/-)鼠足细胞足突融合,微绒毛脱落萎缩;足细胞及肾小管细胞内线粒体形态结构异常进一步提示足细胞及肾小管细胞功能失调。这些结果提示Atgl^(-/-)鼠存在滤过功能及重吸收障碍。结论 Atgl基因敲除引起脂滴大量聚集于肾小球和肾小管,导致肾小球滤过屏障及肾小管结构和功能异常。

关键词：脂肪甘油三酯脂肪酶脂滴肾小球肾小管线粒体

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依那普利拉减轻大鼠烧伤早期脏器损害的研究

中华外科杂志 2008年第13期46卷 1014-1017页

作者：张兵钱王广胡炯宇张家平黄跃生第三军医大学西南医院全军烧伤研究所重庆400038

目的探讨依那普利拉对烧伤早期内脏损害保护作用的量效关系。方法随机将54只SD大鼠分为烫伤组（B组）和烫伤后小剂量、中剂量和大剂量依那普利拉治疗组（E1、E2、E3组），每组12只大鼠，另取6只大鼠不致伤作为正常对照组。检测烫伤前及... 详细信息

目的探讨依那普利拉对烧伤早期内脏损害保护作用的量效关系。方法随机将54只SD大鼠分为烫伤组（B组）和烫伤后小剂量、中剂量和大剂量依那普利拉治疗组（E1、E2、E3组），每组12只大鼠，另取6只大鼠不致伤作为正常对照组。检测烫伤前及伤后6h和12h动脉血压、血管紧张素Ⅱ、尿素氮（Bun）、肌酐（Cr）和肌酸激酶（CK）、丙氨酸转氨酶（ALT）、天冬氨酸转氨酶（AST），以及主要脏器组织病理变化。结果B组血管紧张素Ⅱ明显升高，治疗组均明显低于B组（P均〈0．05），E2和E3组明显低于E1组；B组大鼠CK，Bun、Cr，ALT，AST均显著高于正常参考值（P均〈0．05），治疗组较B组不同程度降低，E1组下降明显（P〈0．05），各时相点基本与正常值接近；E2和E3组下降不明显，明显高于E1组；烫伤后各组动脉收缩压和舒张压均有不同程度下降，其中E2、E3组较E1组更明显，E1组较B组明显升高。结论小剂量依那普利拉能够显著减轻严重烧伤后脏器损害的程度，但对动脉收缩压和舒张压无显著影响。

关键词：烧伤内脏损害依那普利拉

汉语国际教育本科生专业实践能力提升路径研究

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语言与翻译 2024年第2期 70-74页

作者：胡炯梅郭丽新疆师范大学国际文化交流学院乌鲁木齐830017

本文以《国际中文教师专业能力标准》中专业实践能力的维度为理论依据,采用问卷和访谈对汉语国际教育本科生的专业实践能力,从课堂教学计划、教学资源选择与利用、课堂组织与管理、学习评估与反馈四方面做了深入调研。研究发现,汉语国... 详细信息

本文以《国际中文教师专业能力标准》中专业实践能力的维度为理论依据,采用问卷和访谈对汉语国际教育本科生的专业实践能力,从课堂教学计划、教学资源选择与利用、课堂组织与管理、学习评估与反馈四方面做了深入调研。研究发现,汉语国际教育本科生专业实践能力出现的问题主要聚焦于:对课程教学大纲熟悉度较低、开发中文教学资源能力不足、对学习者关注度不够等八方面。针对上述问题提出:突出课程教学大纲重要性、建立完善的国际中文教学资源库、构建家校沟通平台等八方面建议。

关键词：汉语国际教育本科生专业实践提升

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烧伤并发胰腺炎1例

第三军医大学学报 2006年第6期28卷 597-597,600页

作者：胡炯宇黄跃生刘旭盛郑霁高维东第三军医大学西南医院全军烧伤研究所重庆400038

烧伤后急性胰腺炎的发病率约0．07％，病因尚未完全明了。可能与缺血缺氧、炎症反应导致胰管水肿阻塞，胰管上皮因内压升高受损，胰酶消化胰组织，或与肠道菌群移位和重定植相关旧。。血清淀粉酶高于500U／dl，尿淀粉酶明显升高（正常... 详细信息

烧伤后急性胰腺炎的发病率约0．07％，病因尚未完全明了。可能与缺血缺氧、炎症反应导致胰管水肿阻塞，胰管上皮因内压升高受损，胰酶消化胰组织，或与肠道菌群移位和重定植相关旧。。血清淀粉酶高于500U／dl，尿淀粉酶明显升高（正常值40～180U／dl）即提示本病，结合症状、腹部B超和（或）CT可确诊。我科收治1例特重烧伤患者，伤后4个月并发胰腺炎，现报告如下。

关键词：烧伤胰腺炎腹部B超血清炎症反应

黄芪甲苷减轻缺氧心肌细胞氧化损伤的机制研究

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黄芪甲苷减轻缺氧心肌细胞氧化损伤的机制研究

黄芪甲苷减轻缺氧心肌细胞氧化损伤的机制研究

第八届全国烧伤外科学年会

作者：胡炯宇黄跃生第三军医大学西南医院全军烧伤研究所创伤、烧伤与复合伤国家重点实验室

目的观察黄芪甲苷对缺氧心肌细胞氧化损伤的作用;并探寻其机制。方法原代培养乳鼠心肌细胞,缺氧12h,观察黄芪甲苷作用前后细胞活力(cell counting kit-8,CCK-8)、超氧化物歧化酶(SOD)活性、乳酸脱氢酶(LDH)、丙二醛(MDA)、活性氧(ROS)...

目的观察黄芪甲苷对缺氧心肌细胞氧化损伤的作用;并探寻其机制。方法原代培养乳鼠心肌细胞,缺氧12h,观察黄芪甲苷作用前后细胞活力(cell counting kit-8,CCK-8)、超氧化物歧化酶(SOD)活性、乳酸脱氢酶(LDH)、丙二醛(MDA)、活性氧(ROS)含量的变化;用异硫氰酸荧光素(FITC)、辣根过氧化物酶(HRP)标记黄芪甲苷分子,激光共聚焦显微镜和电子显微镜下观察其在细胞内的分布情况;体外检测黄芪甲苷对超氧阴离子(O

关键词：

来源： cnki会议评论

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黄芪甲苷减轻缺氧心肌细胞氧化损伤的机制研究