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小鼠胚胎成纤维细胞的分离与干细胞饲养层的制备

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小鼠胚胎成纤维细胞的分离与干细胞饲养层的制备

作者：胡海北南方医科大学

学位级别：硕士

背景胚胎干细胞(embryonic stem cells, ES cells)来源于囊胚的内细胞团(Inner Cell Mass, ICM)细胞和原始生殖细胞(primordial germ cells,PGCs);诱导多能性干细胞(Induced Pluripotent Stem Cells, iPS cells)]是由成体细胞逆转而成的具有与ES细胞类似全能性的细胞,二者均有无限增殖、自我更新和多向分化潜能,能够向不同的组织细胞分化。ES细胞及iPS细胞体外培养极易自发分化,必须在培养基中加入分化抑制因子或者将其培养在饲养层细胞上。单独的细胞因子抑制其分化效果不理想,目前多数实验研究采用丝裂霉素C处理小鼠胚胎成纤维细胞(mouse embryonic fibroblast, MEF)来制备饲养层。虽然已有无饲养层培养体系的报道或应用人胎盘成纤维细胞建立人类ES细胞系,但小鼠胚胎成纤维细胞作为ES细胞培养最常用的方法,取材方便,成本低廉,且能分泌细胞因子有效的抑制ES细胞及iPS细胞自发分化和促进其增殖,MEF作为饲养层能有效地促进ES细胞及iPS细胞增殖并维持其未分化特性和多潜能性,且效果优于无饲养层单独添加一些细胞因子,而且可以为ES细胞及iPS细胞提供类似的胚胎发育环境,因此在研究ES细胞及iPS细胞时得到广泛的应用。本实验以ICR品系小鼠为实验材料,对MEF的分离培养和饲养层的制备的最佳条件进行探索,并验证制备的饲养层细胞支持干细胞生长的效果,为后期进一步研究ES细胞及iPS细胞提供实验基础。目的建立稳定高效的ICR小鼠胚胎成纤维细胞饲养层体外培养体系,优化小鼠胚胎成纤维细胞的分离方法及饲养层的制备方法,探索稳定的ICR小鼠胚胎成纤维细胞分离的条件,以及胚胎干细胞饲养层细胞制备的最佳方法,建立符合自身实验条件的干细胞体外饲养层培养体系,对课题组今后的实验提供实践基础,为同类实验对实验条件进行规范化提供依据。方法1.使用胰蛋白酶消化法体外分离MEF,利用不同浓度胰蛋白酶消化ICR小鼠胚胎组织不同时间,在显微镜下观察不同实验组细胞形态,贴壁快慢,记录获取原代细胞数量、苔酚蓝染色检测分离原代细胞培养12h后的存活率等,优化胰蛋白酶消化法体外分离ICR小鼠胚胎成纤维细胞的最佳实验条件。2.对第2至第7代MEF的生长状态,增殖活力进行比较,观察其光学显微镜下细胞形态,细胞计数观察其增殖速度,并使用统计图描述各组细胞生长曲线,探索第几代细胞最适合制备饲养层。为饲养层细胞的制备提供理论依据。3.选择第3代MEF,利用5%、10%、15%、20%不同血清浓度培养基进行培养,每天每个实验组取5个样本进行细胞计数以检测细胞增殖速度,用统计图描述各组细胞生长曲线,统计数据先做方差齐性检验,若方差齐,采用单因素方差分析(One-way ANOVA)险验各实验组是否存在显著差异,如果存在显著差异,则进一步使用LSD法做组间两两比较;若方差不齐,用Welch检验法检验组间是否存在显著性差异,若组间存在显著性差异,则进一步使用Dunnttt T3法检验组间的差异。探索MEF体外培养的最佳血清浓度。4.选择第3代细胞制备饲养层,利用不同浓度的丝裂霉素C (5ug/ml, 10ug/ml,1 5ug/ml,20ug/ml)处理MEF不同时间(1h、2.5h、3.5h)后,使用MTT法检测其培养的3、6、8天细胞活力,酶联仪上检测各实验组MEF在570nm处的吸光度OD值,将相同实验条件下(丝裂霉素C浓度及处理时间)的样本以培养时间分组,利用Levene方法做方差齐性检验,若方差齐,则用One-Way ANOVA检验组间是否存在显著差异;若方差不齐,则用Welch法检验组间是否存在显著差异。确定制备饲养层细胞的最佳方法。并利用荧光法检测制备的饲养层细胞有无支原体感染。5.利用MEF制备饲养层培养人胚胎干细胞及诱导多能性干细胞,观察干细胞在饲养层上的生长状态,根据倒置纤维镜下观察分化细胞在克隆中所占的比例,将hES细胞及iPS细胞克隆分为未分化(分化细胞占克隆细胞比例≤20%)和分化(分化细胞占克隆细胞比例≥20%)两类,实验取3复孔计算hES细胞及iPS细胞分化与未分化克隆数,分析饲养层细胞支持hES细胞及iPS细胞生长状况及观察细胞分化情况,同时利用RT-PCR检测其干细胞标志基因Nanog、OCT-4的表达,验证制备的饲养层细胞支持干细胞生长的效果。7.统计方法：运用SPSS13.O统计软件进行统计分析,所有数据均以均数或者均数士标准差(X±S)表示。不同代次细胞的生长情况使用统计图描述;不同血清浓度对MEF增殖的影响用,用统计图描述各组细胞生长曲线,统计数据先做方差齐性检验,若方差齐性,采用单因素方差分析(One-way ANOVA)检验组间是否存在显著差异,

关键词：鼠胚胎成纤维细胞丝裂霉素C 饲养层干细胞

加味凉血地黄汤口服联合苦参汤坐浴用于血热肠燥型肛裂术后的疗效观察

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中国肛肠病杂志 2022年第12期42卷 33-35页

作者：刘涛胡海北王洪中国科学院大学深圳医院(光明)东院区广东深圳523000

目的:探讨血热肠燥型肛裂术后应用加味凉血地黄汤口服联合苦参汤坐浴治疗的临床效果。方法:选取2020年6月至2022年5月,本院收治的120例肛裂患者,随机分为观察组和对照组,每组各60例。观察组肛裂术后采用加味凉血地黄汤口服联合苦参汤坐... 详细信息

目的:探讨血热肠燥型肛裂术后应用加味凉血地黄汤口服联合苦参汤坐浴治疗的临床效果。方法:选取2020年6月至2022年5月,本院收治的120例肛裂患者,随机分为观察组和对照组,每组各60例。观察组肛裂术后采用加味凉血地黄汤口服联合苦参汤坐浴治疗,对照组术后采用乳果糖口服联合高锰酸钾溶液坐浴治疗。比较2组术后4 h、24 h、3 d和10 d,两组疼痛评分,创面愈合时间及疗效等。结果:术后各时点观察组VAS评分均低于对照组(P<0.05);创面愈合时间、排便改善时间、止血时间、住院时间均短于对照组(P<0.05);瘢痕面积小于对照组(P<0.05);临床总有效率高于对照组(P<0.05);并发症评分低于对照组(P<0.05)。结论:血热肠燥型肛裂术后采用加味凉血地黄汤口服联合苦参汤坐浴治疗,能提高临床疗效,减轻术后创面疼痛,减少出血,促进创面愈合,改善排便情况,降低并发症的发生,安全有效。

关键词：肛裂血热肠燥型术后加味凉血地黄汤苦参汤

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“类哲学”创想的三重主题

吉林大学社会科学学报 2024年第4期 45-55+235-236页

作者：胡海波东北师范大学马克思主义学部哲学院

高清海先生从20世纪90年代初开始他的“类哲学”创想。“类哲学”可以视为当代中华民族创造“哲学自我”的一种新的哲学形态。理解高清海先生的“类哲学”创想，必须把握住“类哲学”的三重主题——人性主题、现实主题与生命主题。高清... 详细信息

高清海先生从20世纪90年代初开始他的“类哲学”创想。“类哲学”可以视为当代中华民族创造“哲学自我”的一种新的哲学形态。理解高清海先生的“类哲学”创想，必须把握住“类哲学”的三重主题——人性主题、现实主题与生命主题。高清海先生自1990年开始重点关注与研究“人”的问题，把“人”作为哲学的主题，实现了哲学观念的变革，也开启了“类哲学”创想的思想历程，人性主题也就构成了高清海先生创想“类哲学”的哲学主题。市场经济研究把“人”的哲学主题创造性地推向一个新的境界，为高清海先生的“类哲学”创想提供了一个时代性的现实主题。高清海先生的类哲学创想与思想建构是围绕着人的“类生命”这一主题具体展开的，是在人类走向“类时代”的语境中思考与表达人的“类生命”和“类本性”的未来哲学问题。类哲学的三重主题也应当是我们面向未来的哲学研究与思想创造的哲学基础。

关键词：类哲学人类生命哲学自我

推进资本市场高质量发展的理论逻辑与政策构想

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学术前沿 2024年第1期 33-43页

作者：胡海峰北京师范大学经济与工商管理学院

资本市场在金融体系运行中具有重要枢纽功能,加快推进资本市场高质量发展,发挥好资本市场功能,对实现经济高质量发展、构建新发展格局、服务实体经济、建设金融强国及防范化解金融风险具有重要的现实意义。未来,推进我国资本市场高质量... 详细信息

资本市场在金融体系运行中具有重要枢纽功能,加快推进资本市场高质量发展,发挥好资本市场功能,对实现经济高质量发展、构建新发展格局、服务实体经济、建设金融强国及防范化解金融风险具有重要的现实意义。未来,推进我国资本市场高质量发展,活跃资本市场,要紧紧围绕深化资本市场供给侧改革、提高上市公司质量、培育一流投资银行和投资机构、引导长期资金入市和推进资本市场高水平对外开放来展开。

关键词：金融强国核心竞争力高质量发展高水平对外开放

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中华文明连续性的哲学基础

中国哲学史 2024年第3期 5-10页

作者：胡海忠中国社会科学院哲学所

基于对变化的恒常性的深刻领悟,中华文明以与时偕行、随时变易的历史自觉,探索出维持人类系统既久且大、既深且远的复杂机制,使大规模政治文明体得以产生和发展。中华文明突出的连续性的内在逻辑是以经、史的互动促使文化生命体不断创生... 详细信息

基于对变化的恒常性的深刻领悟,中华文明以与时偕行、随时变易的历史自觉,探索出维持人类系统既久且大、既深且远的复杂机制,使大规模政治文明体得以产生和发展。中华文明突出的连续性的内在逻辑是以经、史的互动促使文化生命体不断创生,以实事求是的精神保证经史合一、理事合一,扎根于变化探索存在能够连续存在的可能。突出的连续性将时间观化为尽其量以包容整体的政治逻辑,将多线的历史进程所形成的差异纳入当下的一体共在之中,通过占有对历史的解释权、共享时间制度、继承文化传统来组建当世的结构、掌握未来的时间。这种时间秩序的建构方式,为中华文化的主体性提供了坚实的历史根据和可靠的精神支持。

关键词：经史传统通史易学实际哲学

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电磁悬浮系统的改进线性自抗扰控制方法

电机与控制学报 2024年第1期28卷 131-141页

作者：杨杰杨星高涛胡海林江西理工大学电气工程与自动化学院江西赣州341000 江西理工大学永磁磁浮技术与轨道交通研究院江西赣州341000 江西省磁悬浮技术重点实验室江西赣州341000

单点电磁悬浮系统是常导电磁磁浮列车悬浮系统的关键控制单元。针对单点电磁悬浮系统因强干扰影响导致控制性能下降的问题,提出了一种改进型线性自抗扰控制(LADRC)方法。首先,基于电磁悬浮结构及原理建立了单点悬浮系统线性化模型,并对... 详细信息

单点电磁悬浮系统是常导电磁磁浮列车悬浮系统的关键控制单元。针对单点电磁悬浮系统因强干扰影响导致控制性能下降的问题,提出了一种改进型线性自抗扰控制(LADRC)方法。首先,基于电磁悬浮结构及原理建立了单点悬浮系统线性化模型,并对系统稳定性进行了分析。其次,基于自抗扰控制方法设计位置外环控制器以及基于PI调节器的电流内环控制器,对线性扩张状态观测器进行改进,设计两级级联的线性扩张状态观测器提高扰动估计精确度及速度,进而提高LADRC中扩张状态观测器对系统扰动的估计能力,并在频域上分析了改进型LADRC扰动估计性能和抑制能力的优越性。最后,搭建实验环境,对改进线性自抗扰控制方法的有效性进行验证。实验结果表明,所提的改进型LADRC不仅具有良好的位置跟踪性能,同时相比传统LADRC具有更强的抗扰动能力。

关键词：单点电磁悬浮系统线性自抗扰控制级联扩张状态观测器观测精确度频域分析抗扰性能

多模化仿生应力调节膀胱平滑肌细胞的生物学功能

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生物医学工程学杂志 2024年第2期41卷 321-327页

作者：韦堂墙陈林胡海峰杨进成都大学附属医院泌尿外科成都610081

以往研究表明,经过多代培养后的细胞会出现生长停滞、去分化和丧失原有功能等问题,其原因是缺乏应力刺激。为探讨多模化仿生应力(MMBS)对人膀胱平滑肌细胞(HBSMCs)生物学功能的影响,本实验建立了MMBS培养系统来模拟膀胱所受的应力环境,... 详细信息

以往研究表明,经过多代培养后的细胞会出现生长停滞、去分化和丧失原有功能等问题,其原因是缺乏应力刺激。为探讨多模化仿生应力(MMBS)对人膀胱平滑肌细胞(HBSMCs)生物学功能的影响,本实验建立了MMBS培养系统来模拟膀胱所受的应力环境,并对HBSMCs加载不同强度的仿生应力持续24 h,然后检测细胞生长、增殖及功能分化。结果显示,MMBS可以促进HBSMCs的生长和增殖,以80 cm H_(2)O压力附加4%牵张应力,对促进HBSMCs的生长、增殖以及α—平滑肌肌动蛋白和平滑肌蛋白22—α的表达最有效。综上,在构建组织工程膀胱时,MMBS培养系统将有助于调节HBSMCs的生长、增殖以及功能分化成熟。

关键词：组织工程膀胱平滑肌细胞应力细胞增殖细胞分化

现代化产业体系构建与农民农村共同富裕:影响机理与实证检验

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云南民族大学学报（哲学社会科学版） 2024年第1期41卷 139-151页

作者：胡海庄天慧四川农业大学马克思主义学院四川成都611130 四川农业大学西部乡村振兴研究中心四川成都611130

基于2008—2021年中国31个省、市、自治区(不包含港澳台)面板数据,运用主成分分析法与优序图分析相结合的方法测算现代化产业体系构建水平,并研判现代化产业体系构建对农民农村共同富裕的影响。实证分析结果显示:现代化产业体系构建可... 详细信息

基于2008—2021年中国31个省、市、自治区(不包含港澳台)面板数据,运用主成分分析法与优序图分析相结合的方法测算现代化产业体系构建水平,并研判现代化产业体系构建对农民农村共同富裕的影响。实证分析结果显示:现代化产业体系构建可有效赋能农民农村共同富裕。传导机制分析显示,现代化产业体系构建能够通过扩大财税规模、增加创业活动、缩小城乡数字鸿沟,赋能农民农村共同富裕。异质性检验证实,现代化产业体系构建对农民农村共同富裕的赋能作用在东部地区更为显著。空间效应分析显示,现代化产业体系构建对农民农村共同富裕具有正向空间溢出效应。针对于此,未来应构建现代乡村产业体系、激发农村创业创新活力、推动区域产业协调发展,加速推进农民农村共同富裕。

关键词：现代化产业体系财税规模创业活动农民农村共同富裕城乡数字鸿沟

中国式农业农村现代化水平测度与影响因素分析

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科学管理研究 2024年第1期42卷 126-134页

作者：胡海庄天慧四川农业大学马克思主义学院四川成都611130 四川农业大学西部乡村振兴研究中心四川成都611130

立足2013-2021年全国31个省份面板数据,在构建中国式农业农村现代化水平评价指标体系基础上,利用熵权法测算各省份中国式农业农村现代化水平。进一步采用Dagum基尼系数实证分析不同地区中国式农业农村现代化水平的差异及时空演化规律,... 详细信息

立足2013-2021年全国31个省份面板数据,在构建中国式农业农村现代化水平评价指标体系基础上,利用熵权法测算各省份中国式农业农村现代化水平。进一步采用Dagum基尼系数实证分析不同地区中国式农业农村现代化水平的差异及时空演化规律,并通过地理探测器细致考察经济、生产、人力等因素对中国式农业农村现代化水平影响的时空分异。结果表明:中国式农业农村现代化总体发展水平呈逐年缓慢递增趋势且存在区域异质性,其中东部地区中国式农业农村现代化水平最高,中部地区次之,西部地区最低。中国式农业农村现代化水平在不同地区发展不平衡主要由区域间差异引起。从区域内差异来看,东部地区区域内各省份中国式农业农村现代化水平差异最大,中部地区差异最小;从区域间差异来看,西部-东部中国式农业农村现代化水平的区域间基尼系数最大,中部-西部区域间基尼系数最小。农村人均GDP、政府扶持力度和农村产业现代化是导致中国式农业农村现代化产生分异现象的决定性因素。据此,提出有效完善农业农村现代化系统、多维打造农村新型服务模式和统筹整合农业农村资源建议,以全面驱动中国式农业农村现代化水平持续提升。

关键词：农业农村现代化 Dagum基尼系数时空分异影响因素