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人肝癌HepG2细胞α-1，3岩藻糖转移酶Ⅳ基因靶向miRNA干扰载体的构建及鉴定

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人肝癌HepG2细胞α-1，3岩藻糖转移酶Ⅳ基因靶向miRNA干扰载体的...

作者：肖骏琦广州医学院

学位级别：硕士

背景肝细胞癌( Hepatocellular carcinoma, HCC )死亡率在全球癌症死亡率中居第三位,在我国为第二位癌症死因。采取以手术治疗为主的综合治疗方式,虽有效提高了术后生存率,但即使根治性切除,术后复发率1年达20%-64%;3年高达57%-81%,而... 详细信息

背景肝细胞癌( Hepatocellular carcinoma, HCC )死亡率在全球癌症死亡率中居第三位,在我国为第二位癌症死因。采取以手术治疗为主的综合治疗方式,虽有效提高了术后生存率,但即使根治性切除,术后复发率1年达20%-64%;3年高达57%-81%,而局部治疗的转移复发率更高。转移复发已成为进一步提高肝癌生存率的一个瓶颈。肝癌细胞的转移有三个途径,首先是肝内转移,第二是肝外转移,第三为种植转移。通过对肝癌早期转移机制研究发现肝癌细胞多通过门静脉发生肝内转移,肝癌细胞与门静脉内皮细胞的粘附是形成肝癌肝内转移的关键所在。 α-1,3岩藻糖转移酶( alpha -1,3 fucosyltransferase , FUT )是一类催化岩藻化寡糖合成的酶类[1]。参与唾液酸化路易斯抗原(Sialyl Lewis X, SLeX)合成最后一步的岩藻糖化反应,有9个亚型[2]。其中α-1,3岩藻糖转移酶Ⅳ(FUT4)是SleX合成的关键酶[3]。SLeX是最常表达在胚胎组织及肿瘤细胞表面糖脂和糖蛋白上的含有寡聚糖的一组碳水化合物抗原[4, 5]。它不仅是三种选择素(E,L,P-选择素)最小可识别的配体,而且是肿瘤相关的糖链抗原[6]。经研究发现SleX抗原强表达于有关的肿瘤细胞表面如结肠癌、胃癌、肝癌等细胞,且SleX的表达水平与肿瘤的转移能力,手术后复发密切相关[6, 7]。我们前期病理研究[8]也已证实在原发灶肝癌细胞SleX表达阳性率为64.10%,并且存在门脉癌栓、有术前肝外转移、有卫星灶、术后3月内复发患者sLeX表达有更高的阳性率。基于这一特点,有研究通过单克隆抗体封闭SleX和内皮细胞选择素(endothelium-selectin, E-selectin)的粘附来阻断肿瘤细胞转移,获得良好效果[9],另一些研究则通过模拟聚合物的方式来抑制这两者结合也取得了一定的效果[10],但是都有一定的缺点及应用局限性。因此总结前人经验和我们大量前期实验基础上,考虑对肝癌HepG2细胞采用RNA干扰的方法。通过微小干扰RNA( micro-RNA, miRNA )沉默α-1,3岩藻糖转移酶基因,降低肝癌细胞表面SleX配体的表达,从而达到与E-selectin的相互粘附作用减弱,阻断肝癌细胞粘附转移的途径。而该实验成功的必要条件是构建高效合适的miRNA干扰载体:从FUT4-mRNA中依据miRNA设计原则找出四个最优的干扰靶位点,把每个位点序列单独嵌合在载体上形成miRNA干扰载体,随后载体扩增和转染细胞,并通过一系列的实验手段分析比较四个miRNA干扰载体干扰效果,选取最好的干扰载体进行下一步的稳定转染,为后续实验奠定基础。目的:1、探讨α-1,3岩藻糖转移酶Ⅳ基因miRNA干扰对肝癌细胞转移的意义。2、构建表达α-1,3岩藻糖转移酶Ⅳ基因miRNA序列的载体。3、鉴定α-1,3岩藻糖转移酶Ⅳ基因miRNA序列的沉默效果,筛选出高效的干扰片段及载体。方法:软件Cenix bioscience设计合成针对FUT4-mRNA的FUT4-miRNA四个候选干扰片段。并逐个与pcDNA?6.2-GW/EmGFPmi载体退火连接形成FUT4-miRNA干扰载体;转化单克隆扩增后测序;转染人肝癌HepG2细胞,进行荧光显微镜观察,荧光定量PCR ( FQ-PCR )检测FUT4-mRNA在不同组别的表达情况,并比较选出沉默效率最好的一组。western-blot在蛋白质水平检测FUT4蛋白量。实验分为转染组,阴性对照组及空白组。结果:测序结果证实载体包含有靶基因的miRNA序列,并正确连接,DNA电泳显示质粒纯度高,无其他DNA杂质。荧光定量PCR结果说明实验组FUT4-mRNA比空白对照组少(P0.05)。同时western-blot结果显示实验组FUT4蛋白表达量和空白对照组比明显降低(P>0.05)。结论:1、BLAST分析四组miRNA序列片段与人类原癌基因无同源性,阴性对照序列片段与目的基因无同源性。2、四组miRNA序列片段和阴性对照序列片段完整,正确连接至载体。3、质粒成功转染人肝癌HepG2细胞,无内毒素,核酸毒性较低,转染效率40%。4、质粒在人肝癌HepG2细胞存在转录翻译。5、059-1组质粒及其包含的干扰片段沉默效率最高,达到44%-53%

关键词： miRNA干扰载体 α-1,3岩藻糖转移酶Ⅳ 转染 SleX抗原

肝癌组织中E-selectin、sLeX、sLeA和CD44v6的表达及其临床意义

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广东医学 2011年第7期32卷 891-894页

作者：邓武坚陈德钱世鹍林航胡海李强肖骏琦陈松伟广州医学院第二附属医院普外科广州510260

目的研究原发性肝细胞癌组织中E-selectin、sLeX(sialyl Lewis X)、sLeA(sialyl Lewis A)、CD44v6的表达,探讨其与患者临床特征的关系。方法采用免疫组化法检测78例肝癌组织中E-selectin、sLeX、sLeA、CD44v6的表达情况,收集统计患者的... 详细信息

目的研究原发性肝细胞癌组织中E-selectin、sLeX(sialyl Lewis X)、sLeA(sialyl Lewis A)、CD44v6的表达,探讨其与患者临床特征的关系。方法采用免疫组化法检测78例肝癌组织中E-selectin、sLeX、sLeA、CD44v6的表达情况,收集统计患者的临床特征资料,分别比较在各种临床特征中E-selectin、sLeX、sLeA、CD44v6的表达差异。结果 E-selectin在癌灶边缘血管内皮细胞中的阳性率为70.51%,与病理分级、门脉癌栓、肝外转移、卫星灶、术后3个月内复发相关,与患者生存期、肿瘤大小、血清甲胎蛋白(alpha fetoprotein,AFP)水平无明显相关。sLeX和sLeA在肝细胞癌肿瘤细胞中的表达阳性率分别为64.10%和69.23%,与患者生存期、门脉癌栓、肝外转移、卫星灶、术后3个月内复发相关,与病理分级、肿瘤大小、AFP无明显相关。CD44v6在肿瘤细胞中的表达阳性率为62.90%,与患者生存期、病理分级、术后3个月内复发相关,与门脉癌栓、肝外转移、卫星灶、肿瘤大小、AFP无明显相关。结论 E-selectin、sLeX、sLeA、CD44v6与患者的预后、门脉癌栓等临床特征密切相关。

关键词：黏附分子肝细胞癌预后

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下肢动脉长段闭塞腔内治疗12例体会

下肢动脉长段闭塞腔内治疗12例体会

身痛逐瘀汤加减辅助治疗下肢动脉硬化闭塞症介入术后缺血灌注损伤的研究

江西省第二届胃肠外科学术会议暨江西省第十二次中西医结合...

作者：刘凤恩肖骏琦赣南医学院第一附属医院

＜正＞动脉硬化性闭塞症（arteriosclerosis obliterans,ASO）是动脉粥样硬化所致的慢性动脉闭塞性疾病,是周围动脉疾病的重要组成部分。其病理基础是动脉粥样硬化斑块形成,形成继发血栓进而导致官腔狭窄甚至闭塞。但是对以下肢（髂动...

＜正＞动脉硬化性闭塞症（arteriosclerosis obliterans,ASO）是动脉粥样硬化所致的慢性动脉闭塞性疾病,是周围动脉疾病的重要组成部分。其病理基础是动脉粥样硬化斑块形成,形成继发血栓进而导致官腔狭窄甚至闭塞。但是对以下肢（髂动脉以远）血管动脉硬化性长段闭塞治疗方式的选择还是存在争议的,主要集中在是行人工血管转流手术还是介入治疗。我们回顾性分析了2009年7月至2011年7月间12例应用腔内治疗下肢动脉

关键词：

来源： cnki会议评论

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cnki会议

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中国中西医结合杂志 2017年第8期37卷 1014-1015页

作者：刘建平郑保平刘凤恩叶荣段青肖骏琦段训洪刘潜赣南医学院第一附属医院血管外科江西341000 赣南医学院第一附属医院中医科江西341000

下肢动脉硬化闭塞症是我国常见病及多发病,随着微创技术的发展,介入治疗成为首选。介入治疗成功后动脉再通可出现缺血再灌注损伤,不仅影响缺血组织功能,而且还可以累及远隔器官,严重时引发多器官功能衰竭而导致患者死亡。现有研究表明,... 详细信息

下肢动脉硬化闭塞症是我国常见病及多发病,随着微创技术的发展,介入治疗成为首选。介入治疗成功后动脉再通可出现缺血再灌注损伤,不仅影响缺血组织功能,而且还可以累及远隔器官,严重时引发多器官功能衰竭而导致患者死亡。现有研究表明,中药可有效减轻缺血再灌注损伤,笔者对下肢动脉硬化闭塞症介入围手术期患者给予身痛逐瘀汤加减辅助治疗,现报道如下。

关键词：身痛逐瘀汤缺血再灌注损伤围手术期患者介入术缺血组织多器官功能衰竭无症状期支架植入术诊断标准术后血清

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老年腹主动脉瘤术后中远期死亡的危险因素

中国老年学杂志 2019年第10期39卷 2392-2394页

作者：肖骏琦段青刘建平叶荣段训洪乐志标刘凤恩赣南医学院第一附属医院普外三科江西赣州341000

目的探讨老年腹主动脉瘤术后中远期死亡的高危因素。方法行手术治疗的老年腹主动脉瘤患者107例作为研究对象。调查内容包括性别、年龄、吸烟史,合并糖尿病、高血压、冠心病,瘤体直径、平均失血量、手术时间、休克、血肌酐水平等。观察... 详细信息

目的探讨老年腹主动脉瘤术后中远期死亡的高危因素。方法行手术治疗的老年腹主动脉瘤患者107例作为研究对象。调查内容包括性别、年龄、吸烟史,合并糖尿病、高血压、冠心病,瘤体直径、平均失血量、手术时间、休克、血肌酐水平等。观察术后随访中远期死亡情况,单因素和多因素Logistic回归分析影响术后中远期死亡的独立危险因素。结果术后随访6～59个月,平均(21.30±4.52)个月。根据死亡情况分为存活组(n=87)与死亡组(n=20)。单因素分析表明,两组性别和合并冠心病比较无统计学差异(P>0.05),年龄、吸烟史、合并糖尿病、合并高血压、瘤体直径、平均失血量、休克和血肌酐水平比较具有统计学差异(P<0.05)。将单因素分析具有统计学差异的因素纳入多因素Logistic回归分析,年龄、吸烟史、瘤体直径、休克和血肌酐水平为影响术后中远期死亡的独立危险因素。结论老年腹主动脉瘤术后中远期死亡受多种因素影响,应采取针对性预防措施以降低死亡发生。

关键词：腹主动脉瘤中远期死亡

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经单孔胸腔镜手术治疗手汗症

中国内镜杂志 2011年第12期17卷 1299-1301页

作者：熊健宪赖政洪肖骏琦罗志方李章红赣南医学院第一附属医院心胸外科江西赣州341000

目的评价经单孔胸腔镜胸交感神经链切除术治疗手汗症的安全性和有效性。方法自2006年～2010年6月,74倒手汗症患者采用双腔气管插管全麻,在电视胸腔镜下,光源杆及电凝棒经胸壁单孔操作,行双侧胸交感神经切断术治疗手汗症。结果 74例患者... 详细信息

目的评价经单孔胸腔镜胸交感神经链切除术治疗手汗症的安全性和有效性。方法自2006年～2010年6月,74倒手汗症患者采用双腔气管插管全麻,在电视胸腔镜下,光源杆及电凝棒经胸壁单孔操作,行双侧胸交感神经切断术治疗手汗症。结果 74例患者术后手掌多汗症状消失,无Honer’s综合征及死亡病例。平均手术时间(38.52±9.24)min,随访8～24个月,无病例复发。结论经单孔腔镜胸胸交感神经节切除是一种简单、安全有效的治疗手汗症的微创手术。

关键词：胸交感神经链切除术手汗症

E-选择素及其配体表达对肝癌转移的临床意义

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中华肝脏病杂志 2010年第6期18卷 440-444页

作者：钱世鹃陈德李悦杨学伟邓武坚李强林航胡海肖骏琦陈松伟广州医学院第二附属医院肝胆外科 510260

目的探讨E-选择索（E-selectin）及其配体在肝癌细胞与内皮细胞黏附中的作用和二者表达的临床意义并筛选可能阻断黏附作用的药物. 方法收集78例肝细胞癌患者的临床资料,采用免疫组织化学方法检测E-selectin、sLeX、sLeA、CD44v6的... 详细信息

目的探讨E-选择索（E-selectin）及其配体在肝癌细胞与内皮细胞黏附中的作用和二者表达的临床意义并筛选可能阻断黏附作用的药物. 方法收集78例肝细胞癌患者的临床资料,采用免疫组织化学方法检测E-selectin、sLeX、sLeA、CD44v6的表达情况,按临床特征分组并比较各组E-selectin、sLeX、sLeA、CD44v6的阳性表达率差异.体外实验采用实时荧光定量PCR检测E-selectin和细胞间黏附分子（ICAM）-1在ED25、ECV304两种内皮细胞中的表达黏附实验检测肝癌细胞HepG2与ED25、ECV304两种内皮细胞的黏附活性,并检测不同药物对黏附作用的影响.对临床资料数据采用χ2检验、Kaplan-Meier生存分析与Wilcoxon检验对体外实验计量数据进行方差分析.结果 E-selectin在肝癌病灶内血管内皮细胞中的阳性表达率为70.51%,sLeX、sLeA、CDJ44v6在肝癌细胞中的阳性表达率分别为64.10%、69.23%、62.90%.sLeX、sLeA、CD44v6表达阴性患者的平均生存期显著长于阳性患者（P值均〈0.05）.有门静脉癌栓、术前肝外转移、卫星病灶、术后3个月内复发各组E-selectin、sLeX、sLeA的阳性表达率差异均有统计学意义（P值均〈0.05）而肿瘤大小、血清AFP水平均与E-selectin、sLeX、sLeA的阳性表达率无相关性病理分级Ⅲ～Ⅳ级组与Ⅰ～Ⅱ级组的E-selectin和CD44v6的阳性表达率差异均有统计学意义（P值均〈0.05）.CD44v6的表达特点是术后3个月内复发者有较高的阳性率,有卫星灶者阳性率也较高.E-selectin和ICAM-1可高表达于活化后的ED25和ECV304细胞且能介导HepG2细胞与ED25和ECV304细胞的黏附,地塞米松,丹参酮ⅡA都具有较强的抗黏附能力,且抗黏附作用随着浓度的增加而增强.结论 E-selectin、sLeX.sLeA、CD44v6的表达与患者的预后,门静脉癌栓等临床特征密切相关,可作为临床预后和术后早期复发的评估依据.E-selectin、ICAM-1及其配体可增强肝癌细胞与内皮细胞的黏附,促进肝癌转移地塞米松、丹参酮ⅡA可阻断其黏附作用.

关键词：癌,肝细胞肿瘤转移预后 E-选择素

兔颈动脉修复联合牛心包补片成形术后再狭窄的效果研究

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血管与腔内血管外科杂志 2021年第7期7卷 787-792,798页

作者：曾澄冯远平王良华肖骏琦段青刘凤恩赣南医学院心脑血管疾病防治教育部重点实验室江西赣州341000 赣南医学院第一附属医院血管外科江西赣州341000

目的探讨兔颈动脉修复联合牛心包补片成形术后再狭窄的效果。方法按照兔颈动脉修复方法不同将15只兔子分为三组,每组5只。比较术后2周、4周、12周凝血指标和血细胞;术后2周、4周、12周超声观察颈动脉狭窄情况;观察术后12周三组动物苏木... 详细信息

目的探讨兔颈动脉修复联合牛心包补片成形术后再狭窄的效果。方法按照兔颈动脉修复方法不同将15只兔子分为三组,每组5只。比较术后2周、4周、12周凝血指标和血细胞;术后2周、4周、12周超声观察颈动脉狭窄情况;观察术后12周三组动物苏木精-伊红染色法染色、Tunel凋亡检测、透射电镜和免疫组化结果。结果术后不同时间点三组凝血指标及血细胞比较,差异无统计学意义(P>0.05);术后不同时间点,对照组内膜增生严重,管腔狭窄;静脉补片组见假性动脉瘤形成,牛心包补片组缝合处均未见明显管腔狭窄、瘤样扩张、血栓形成等。补片周围均未见积液或脓肿。术后12周,对照组血管内膜显著增厚、结构致密,细胞严重纤维化,平滑肌细胞及纤维组织增生,静脉补片组与牛心包补片组内皮细胞排列整齐,纤维化程度较低;对照组与静脉补片组细胞凋亡较少,牛心包补片组细胞凋亡较多;对照组小细胞紧密分布于血管平滑肌细胞内,板层细胞排列紊乱和分层;静脉补片组中膜平滑肌细胞分布不规律、变性,间质增宽,中层胶原纤维显著增生;牛心包补片组中膜平滑肌细胞空泡变性,中层胶原纤维增生较少;对照组基质金属蛋白酶2、基质金属蛋白酶9表达量最高;牛心包补片组蛋白激酶Cα表达量最高。结论牛心包补片在颈动脉修复术中生物相容性较高,可有效防止术后再狭窄。

关键词：颈动脉狭窄牛心包补片基质金属蛋白酶蛋白激酶

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19例破裂腹主动脉瘤急救流程规范性研究

上海医药 2018年第21期39卷 36-38页

作者：肖骏琦刘凤恩段青刘建平唐金红叶荣江西省赣州市赣南医学院第一附属医院江西赣州341000

目的 :探讨破裂腹主动脉瘤急救流程的规范性。方法 :选取19例破裂腹主动脉瘤患者,均行开腹手术。A组(10例)采用急诊室-CT室-手术室-重症监护室急救流程;B组(9例)采用急诊室-重症监护室-CT室/介入室-手术室-重症监护室流程。比较两组术... 详细信息

目的 :探讨破裂腹主动脉瘤急救流程的规范性。方法 :选取19例破裂腹主动脉瘤患者,均行开腹手术。A组(10例)采用急诊室-CT室-手术室-重症监护室急救流程;B组(9例)采用急诊室-重症监护室-CT室/介入室-手术室-重症监护室流程。比较两组术前低血压持续时间、入院至手术响应时间、术中出血量、输血量、住院时间、并发症及病死情况。结果 :两组术前低血压持续时间、并发症、病死率比较无统计学差异(P>0.05);B组入院至手术响应时间长于A组,术中出血量、输血量少于A组,住院时间短于A组,均有统计学差异(P<0.05)。结论 :规范的破裂腹主动脉瘤急救流程效果明显。

关键词：破裂腹主动脉瘤急救规范性研究