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甲基丙烯酸酐化明胶-甲壳素纳米晶须生物墨水的特性和3D打印效果

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中华泌尿外科杂志 2023年第12期44卷 935-942页

作者：凌争云肖树伟王鹏超赵健安子彦符舟洋邵金鹏符伟军南开大学医学院天津300071 解放军总医院第三医学中心泌尿外科医学部北京100039

目的探讨由甲基丙烯酸酐化明胶(GelMA)和甲壳素纳米晶须(ChiNC)组成的混合生物墨水的物理特征、生物相容性,以及3D打印效果。方法2021年5月至2022年12月,于100mg/mlGelMA生物墨水中添加ChiNC,制备成ChiNC浓度分别为5、10、20mg/ml的混... 详细信息

目的探讨由甲基丙烯酸酐化明胶(GelMA)和甲壳素纳米晶须(ChiNC)组成的混合生物墨水的物理特征、生物相容性,以及3D打印效果。方法2021年5月至2022年12月,于100mg/mlGelMA生物墨水中添加ChiNC,制备成ChiNC浓度分别为5、10、20mg/ml的混合生物墨水,分别命名为GC5、GC1O、GC20组,与未添加ChiNC的GelMA生物墨水(CCO组)共同实验。采用扫描电镜观察4组生物墨水光固化后形成的水凝胶的横截面,计算孔隙率。称量各组水凝胶溶胀前后质量,计算平衡溶胀比。将4组生物墨水加入48孔板中,光固化成水凝胶,表面种植入脐静脉内皮细胞(HUVECs),于培养基中培养至第1、3、7天分别行CCK-8实验检测吸光度A值,比较4组水凝胶中细胞的增殖速度。4组生物墨水中添加HUVECs,打印网格状支架,于培养基中培养至第1、7天分别行Live-Dead染色,观察细胞存活率。采用打印挤出成丝实验,观察各组生物墨水挤出时的连续成丝性,比较各组的打印效果。采用最佳配比的混合生物墨水3D打印模拟膀胱壁黏膜层、黏膜下层和肌层解剖结构的组织工程膀胱补片,观察打印结构的稳定性和保真度,验证混合生物墨水打印多层复杂结构的可行性。结果扫描电镜观察结果显示,GCO、GC5、GC1O、GC20组水凝胶的孔隙率分别为(51.43±6.23)%、(51.85±6.47)%、(50.55±4.59)%和(42.49±2.20)%,GC0组与其他3组比较差异均无统计学意义(P=0.9994、P=0.9948、P=0.1200)。GC0组平衡溶胀比为9.37±0.49,低于GC5组(8.81±0.41,P=0.0457)、GC10组(7.95±0.19,P<0.01)、GC20组(7.71±0.14,P<0.01),差异均有统计学意义。CCK-8检测结果显示,GCO、GC5、GC10、GC20组培养第1天的吸光度A值分别为0.357±0.0070.350±0.012、0.360±0.009、0.345±0.018,GC10组与其他3组比较差异均无统计学意义(P=0.9332、P=0.5464、P=0.4937);培养第3天的吸光度A值分别为0.634±0.010、0.704±0.009、0.755±0.012、0.653±0.015,GC10组与其他3组比较差异均有统计学意义(P<0.01、P=0.0033、P=0.0002);培养第7天的吸光度A值分别为0.846±0.026、0.930±0.043、1.001±0.***.0.841±0.024,GC10组与其他3组比较差异均有统计学意义(P=0.0012、P=0.1390、P=0.0010)。GCO、CC5、GC10、CC20组培养第1天的HUVECs细胞存活率分别为(90.13±1.63)%、(90.6±2.45)%、(92.58±2.15)%、(91.40±3.17)%,GC0组与其他3组比较差异均无统计学意义(P=0.9869、P=0.3093、P=0.8008);培养第7天的细胞存活率分别为(89.97±3.10)%、(92.18±2.21)%、(92.05±2.25)%、(90.12±1.97)%GC0组与其他3组比较差异均无统计学意义(P=0.3965、P=0.4511、P=0.9995)。打印挤出成丝测试结果显示,GC0组在24℃~25℃时挤出连续且能成丝,GC10组在24℃~27℃时挤出连续且能成丝。使用CC10组打印组织工程膀胱补片,结果显示打印的补片稳定,无塌,保真度高。结论在GelMA中添加ChiNC能促进细胞黏附、增殖,扩大GelMA生物墨水的打印窗口。在GelMA中添加10mg/ml ChiNC制备的混合生物墨水的生物相容性良好,能打印模拟天然膀胱壁解剖结构的组织工程膀胱补片。

关键词： 3D生物打印甲基丙烯酸酐化明胶日甲壳素纳米晶须生物墨水膀胱补片

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基于脱细胞基质支架的输尿管组织工程研究

基于脱细胞基质支架的输尿管组织工程研究

作者：肖树伟中国人民解放军医学院

学位级别：硕士

输尿管作为腹膜后位器官,损伤发生的机率很低,但近年来随着腔镜技术在临床中的广泛应用,输尿管损伤发生的概率逐年升高。常规手术治疗方式(输尿管断端吻合,输尿管的再植,膀胱成形术等)可以恢复输尿管结构的连续性,而不能完全恢复其功能... 详细信息

输尿管作为腹膜后位器官,损伤发生的机率很低,但近年来随着腔镜技术在临床中的广泛应用,输尿管损伤发生的概率逐年升高。常规手术治疗方式(输尿管断端吻合,输尿管的再植,膀胱成形术等)可以恢复输尿管结构的连续性,而不能完全恢复其功能,且常伴有一些术后并发症,例如：复发性狭窄,漏尿以及肾脏损害等。随着组织工程技术在泌尿系统中的广泛应用,为输尿管的修复重建提供了新的契机。组织工程学融合了材料学、生命科学和工程学的理念,属于前沿交叉学科领域,研究的最终目的是体外构建具有生物学功能的工程化输尿管,替换体内受损的输尿管组织,达到临床治愈的目标。随着组织工程技术在泌尿系统广泛而深入的研究,体外构建工程化输尿管的研究也有了很多突破性的进展,但尚未构建出理想的工程化输尿管组织,用于临床的治疗。其中支架材料问题是其主要原因之一。输尿管细胞外基质的结构和成分较为复杂,现阶段技术条件很难在体外完全模拟出细胞外基质的微环境。脱细胞技术的出现和发展,使得制备脱细胞基质材料成为可能,受到了广泛的关注和研究。脱细胞基质材料独有的特点是将细胞成分从组织或器官中清除,同时能够很好地保留细胞外基质的结构和成分,因而是较为理想的组织工程支架材料。输尿管脱细胞基质常用的制备方法为物理搅拌同时结合化学洗涤剂的洗脱作用,来达到脱细胞效果,这一制备过程需消耗较长的时间,且制备的输尿管脱细胞基质的成分常遭到破坏。此外,长时间的搅拌和化学洗涤剂作用,也会破坏脱细胞基质的结构,进而影响组织工程输尿管的构建。因此,探寻一种快速,便捷的脱细胞方案,使制备的输尿管脱细胞基质的细胞成分被完全清除,同时细胞外基质结构和成分得到很好地保留,对以后的输尿管再造研究具有重要的意义。既往的研究报道,细胞外基质在调控干细胞分化中扮演着重要的角色。DeQuach等人的研究表明,骨骼肌脱细胞基质能够促进肌源性干细胞向骨骼肌细胞分化,心脏脱细胞基质能够促进胚胎干细胞向心肌细胞分化。有文献报道脱细胞基质的硬度在调控间充质干细胞分化起到重要的作用,质地较为坚硬的基质有利于间充质干细胞的成骨分化,相反质地较软的基质更有利于间充质干细胞的成脂分化。此外,也有关于细胞外基质中某些组分可以促进干细胞的分化的报道。但关于输尿管脱细胞基质成分在促进干细胞分化方面的研究尚未有报道。基于以上问题的分析,本论文主要从以下三方面进行了相关研究：第一部分：输尿管脱细胞基质的灌注制备及条件优化目的：探索灌注系统在制备输尿管脱细胞基质中的可行性,并对制备的输尿管脱细胞基质进行系统且详细地评价。方法：利用输尿管本身存在的管腔结构,通过灌注系统制备输尿管脱细胞基质。根据化学洗涤剂的不同特性设置3个不同的灌注组,单纯SDS组、单纯TritonX-100组以及联合组(TritonX-100+SDS)。结果：HE染色和DAPI染色显示联合组制备的输尿管脱细胞基质中没有明显的核物质残留,DNA定量和凝胶电泳证实了这一结果。Masson's三色染色、Alcian Blue染色、胶原含量测定和GAG含量测定显示联合组保留了输尿管脱细胞基质三维胶原结构和生物活性成分。扫描电镜观察联合组制备的输尿管脱细胞基质表面存在大量的孔隙结构。结论：灌注系统可用于输尿管脱细胞基质的制备,筛选出一套比较理想的脱细胞方案,制备的输尿管脱细胞基质可作为输尿管组织工程再造。第二部分：输尿管脱细胞基质的生物相容性评价和再细胞化目的：对制备的输尿管脱细胞基质进行生物相容性评价,并进行再细胞化研究。方法：通过AO/PI染色和MTT检测评价输尿管脱细胞基质的生物相容性;将犬膀胱平滑肌细胞种植在输尿管脱细胞基质的表面,观察脱细胞基质中细胞的生长行为。结果：AO/PI染色和MTT检测显示平滑肌细胞可在输尿管脱细胞基质浸提液中生长和增殖;HE染色、DAPI染色和PCNA染色显示犬膀胱平滑肌细胞可在输尿管脱细胞基质中粘附、生长、迁移和增殖。结论：制备的输尿管脱细胞基质具有良好的生物相容性,可用做输尿管组织工程的支架材料。第三部分：输尿管脱细胞基质的化学成分诱导脂肪干细胞的分化目的：探寻输尿管脱细胞基质的化学成分是否可诱导干细胞分化。方法：将犬脂肪干细胞种植在铺有输尿管脱细胞基质消化液的盖玻片上,观察脂肪干细胞的分化情况。结果：免疫荧光染色显示脂肪干细胞向平滑肌细胞分化,Western Blot检测显示有平滑肌蛋白的表达。结论：输尿管脱细胞基质的化学成分可以诱导犬脂肪干细胞向平滑肌细胞分化。综上所述,本论文将灌注系统引入到输尿管脱细胞基质的制备中,并成功筛选出一套适用于制备犬输尿管脱细胞基质的脱细胞方案。同时对制备的输尿管脱细胞基质进行了系统且详细的评价,证实制备的输尿管脱细胞基质很好地清除了细胞核成分,同时较好地保留了输尿管的三维结构和生物活性成分。并且验证了所制备的输尿管脱细胞基质具有良好的生物相容性,进行了再细胞化实验,表明优化后的脱细胞方案所制备的输尿管脱细胞基质可用作输尿管组织工程

关键词：输尿管脱细胞基质组织工程支架

双层蚕丝支架复合脂肪干细胞构建的组织工程膀胱补片用于膀胱修复重建的效果

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中华泌尿外科杂志 2022年第10期43卷 778-785页

作者：肖树伟符伟军王鹏超赵健凌争云安子彦符舟洋张旭解放军总医院泌尿外科北京100853

目的探讨双层蚕丝支架复合脂肪干细胞(ADSCs)构建的组织工程膀胱补片在膀胱修复重建中的效果。方法2020年5月至2021年3月利用家蚕蚕茧获得丝素蛋白(SF)水溶液,制备由丝素蛋白膜和丝素蛋白海绵组成的双层蚕丝支架。分离培养大鼠ADSCs,并... 详细信息

目的探讨双层蚕丝支架复合脂肪干细胞(ADSCs)构建的组织工程膀胱补片在膀胱修复重建中的效果。方法2020年5月至2021年3月利用家蚕蚕茧获得丝素蛋白(SF)水溶液,制备由丝素蛋白膜和丝素蛋白海绵组成的双层蚕丝支架。分离培养大鼠ADSCs,并对ADSCs表面标志物(CD29、CD90、CD45、CD106)进行流式细胞鉴定。将ADSCs种植在双层蚕丝支架上构建组织工程膀胱补片。将36只雄性SD大鼠按随机数字表法分为组织工程膀胱补片组(SF-ADSCs组,15只)、双层蚕丝支架组(SF组,15只)、对照组(6只)。SF-ADSCs组和SF组分别将组织工程膀胱补片和双层蚕丝支架包埋于大鼠的大网膜,以促进移植物血管化。包埋7 d后,两组分别处死3只大鼠,行HE和免疫荧光染色检查评估血管化情况。SF-ADSCs组(12只)和SF组(12只)于膀胱顶部切除超过50%的膀胱组织,保留三角区和输尿管开口,分别采用大网膜包埋后的组织工程膀胱补片和双层蚕丝支架修补膀胱缺损;对照组在充分暴露膀胱组织后随即关闭切口。术后4周,SF-ADSCs组和SF组分别随机取6只大鼠,观察膀胱组织的大体形态,行膀胱造影检查观察膀胱壁形态,移植物取材后行HE和Masson's 3色染色、免疫荧光染色检查观察膀胱壁组织再生情况。术后12周,3组均行尿动力学检查,均行上述检查比较膀胱组织形态学、组织再生情况的差异。结果流式细胞实验结果显示,分离的细胞阳性表达CD29和CD90,未见CD45和CD106显著表达。大体观察和扫描电镜结果证实制备的双层蚕丝支架不仅具备利于细胞种植的孔隙结构,还具备良好的韧性利于手术缝合。大网膜包裹后,SF-ADSCs组血管样结构的数量[(43.50±2.66)个]和面积占比[(0.73±0.03)%]明显高于SF组[(24.50±3.51)个,(0.55±0.05)%],差异均有统计学意义(P<0.05)。膀胱修补术后4周,SF-ADSCs组和SF组移植物组织学染色可见大量双层蚕丝支架降解碎片;术后12周形态学检测结果显示,SF-ADSCs组移植物膀胱形态均一,与正常膀胱组织形态相近,免疫荧光染色结果表明SF-ADSCs组中可见连续的尿路上皮层、大量的平滑肌组织、血管结构和再生的神经元。尿动力学检查结果显示,SF-ADSCs组膀胱最大容积[(0.74±0.03)ml]和顺应性[(16.68±0.44)μl/cmH2O]明显优于SF组[(0.47±0.05)ml、(14.89±0.37)μl/cmH2O],但低于对照组[(1.12±0.08 ml)、(19.34±0.45)μl/cm H2O],差异均有统计学意义(P<0.05)。结论双层蚕丝支架和ADSCs构建的组织工程膀胱补片,可促进膀胱组织形态学修复、膀胱壁结构再生和膀胱生理功能的恢复。

关键词：膀胱丝素蛋白脂肪干细胞组织工程

脱细胞基质在泌尿系统修复重建中应用的研究进展

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中华实验外科杂志 2014年第11期31卷 2645-2646页

作者：肖树伟符伟军张旭解放军总医院海南分院泌尿外科三亚572013

泌尿系统的损伤、炎症、肿瘤和先天性畸形等疾病都可导致器官组织结构改变或功能障碍.目前临床上常用的治疗方法有异体移植、自体移植和人工合成材料的替代,但这些治疗方法都有其各自的缺陷和不足.组织工程技术的发展为泌尿系统的修复... 详细信息

泌尿系统的损伤、炎症、肿瘤和先天性畸形等疾病都可导致器官组织结构改变或功能障碍.目前临床上常用的治疗方法有异体移植、自体移植和人工合成材料的替代,但这些治疗方法都有其各自的缺陷和不足.组织工程技术的发展为泌尿系统的修复和重建带来了全新的理念.组织工程的研究内容主要集中于以下3个方面：（1）种子细胞的培养;（2）支架材料的研究;（3）组织工程化的组织对各种病损组织替代研究.目前组织工程常用的支架材料主要包括可降解的人工合成高分子材料和天然的脱细胞基质两大类[1].其中人工合成高分子材料表面的微观结构与生物组织相差甚远,表面疏水性及细胞黏附性差,因而影响种子细胞与材料的附着和相互作用.天然的脱细胞基质材料去除了可引起免疫反应的细胞成分,保留了含有生物活性分子的细胞外基质,更是完整地保留了组织的三维结构.脱细胞基质的这些特点更复合理想中的支架材料,因而近年来利用脱细胞基质重建泌尿系统组织器官成为研究的热点.

关键词：脱细胞基质泌尿系统修复重建人工合成材料合成高分子材料组织工程技术应用器官组织

输尿管脱细胞基质涂层诱导脂肪干细胞分化的研究

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中华泌尿外科杂志 2020年第9期41卷 692-697页

作者：王鹏超肖树伟符伟军张旭解放军总医院泌尿外科北京100853

目的探讨输尿管脱细胞基质(UDM)涂层对脂肪干细胞分化的影响。方法2018年1月至2019年10月利用灌注法制备犬UDM,为UDM组,以正常犬输尿管为正常输尿管组。采用HE染色、DAPI染色和DNA定量检测评估UDM组和正常输尿管组中细胞成分的残留情况;... 详细信息

目的探讨输尿管脱细胞基质(UDM)涂层对脂肪干细胞分化的影响。方法2018年1月至2019年10月利用灌注法制备犬UDM,为UDM组,以正常犬输尿管为正常输尿管组。采用HE染色、DAPI染色和DNA定量检测评估UDM组和正常输尿管组中细胞成分的残留情况;Masson三色染色和胶原定量检测评估UDM组和正常输尿管组中胶原的保留情况;阿尔新蓝染色和糖胺聚糖定量检测评估UDM组和正常输尿管组中糖胺聚糖的分布及含量。分离培养犬脂肪间充质干细胞(CADMSCs)并用流式细胞仪鉴定。用胃蛋白酶消化法制备UDM涂层作为实验组,I型鼠尾胶原涂层作为对照组,将cADMSCs种植在不同涂层上,免疫荧光染色和蛋白质印迹法检测cADMSCs的分化情况。结果HE和DAPI染色结果显示UDM组未见明显的细胞核残留;DNA定量检测结果显示UDM组中DNA含量[(38.87±3.40)ng/mg]明显低于正常输尿管组[(1694.63±169.83)ng/mg,P0.05)。阿尔新蓝染色结果显示UDM组中有糖胺聚糖分布;糖胺聚糖定量检测结果显示UDM组中糖胺聚糖含量[(1.57±0.19)μg/mg]低于正常输尿管组[(3.43±0.12)μg/mg](P0.05)。免疫荧光染色检测结果示实验组和对照组α-SMA的表达趋势与蛋白质印迹法检测结果--致。结论制备的UDM去除了细胞成分,且很好地保留了胶原结构和生物活性成分;UDM涂层可促进cADMSCs向平滑肌细胞分化。

关键词：细胞外基质输尿管脂肪干细胞组织工程

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膀胱组织工程研究进展

中华实验外科杂志 2018年第3期35卷 595-597页

作者：肖树伟符伟军张旭解放军总医院海南分院泌尿外科三亚572013 解放军总医院泌尿外科北京100853

泌尿系统的肿瘤、创伤、炎症和先天畸形等疾病均可使膀胱受损，目前利用肠道修复重建常伴随一系列的并发症。组织工程技术为解决这一问题提供了新的思路。本文就膀胱组织工程研究进展情况作一综述，详细阐述了在膀胱组织工程重建中所涉... 详细信息

泌尿系统的肿瘤、创伤、炎症和先天畸形等疾病均可使膀胱受损，目前利用肠道修复重建常伴随一系列的并发症。组织工程技术为解决这一问题提供了新的思路。本文就膀胱组织工程研究进展情况作一综述，详细阐述了在膀胱组织工程重建中所涉及的三大主要方面的研究现状，即支架材料的选取、种子细胞的培养与移植、生长因子的调节作用。并指出了目前所面临的一些挑战，例如膀胱组织工程支架材料的选取、组织工程膀胱移植到体内后营养供应问题等，都有待我们进一步深入研究解决。

关键词：膀胱组织工程支架材料种子细胞生长因子

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适用于犬输尿管脱细胞基质制备的灌注系统

南方医科大学学报 2016年第3期36卷 365-370页

作者：肖树伟王鹏超符伟军王忠新李钢张旭解放军总医院海南分院泌尿外科海南三亚572013 解放军第309医院泌尿外科北京100091 解放军总医院泌尿外科北京100853

目的探讨应用灌注系统制备输尿管脱细胞基质的可行性方案。方法利用输尿管本身存在的管腔结构,通过灌注系统制备输尿管脱细胞基质。根据化学洗涤剂的不同特性设置3个不同的灌注组,单纯SDS组、单纯Triton X-100组以及联合组(Triton X-100... 详细信息

目的探讨应用灌注系统制备输尿管脱细胞基质的可行性方案。方法利用输尿管本身存在的管腔结构,通过灌注系统制备输尿管脱细胞基质。根据化学洗涤剂的不同特性设置3个不同的灌注组,单纯SDS组、单纯Triton X-100组以及联合组(Triton X-100+SDS)。利用HE染色,DAPI染色,DNA定量,琼脂糖凝胶电泳评价输尿管脱细胞基质中细胞核的残留情况。采用Masson's 3色染色、Alcian Blue染色、胶原含量测定、GAG含量测定、扫描电镜和毒性检测等手段评价制备输尿管脱细胞基质的三维结构和生物活性成分。结果 HE染色和DAPI染色显示联合组制备的输尿管脱细胞基质中没有明显的核物质残留,DNA定量和凝胶电泳证实了这一结果。Masson's 3色染色、Alcian Blue染色、胶原含量测定和GAG含量测定显示联合组保留了输尿管脱细胞基质三维胶原结构和生物活性成分。扫描电镜观察联合组制备的输尿管脱细胞基质表面存在大量的孔隙结构。毒性测定证实联合组制备的输尿管脱细胞基质无毒性。结论本研究灌注系统可用于输尿管脱细胞基质的制备,筛选出一套比较理想的脱细胞方案,制备的输尿管脱细胞基质可用于输尿管组织工程再造。

关键词：输尿管脱细胞基质灌注系统组织工程支架