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稳定表达PRRSV M蛋白的MARC-145^(ORF6)细胞系的构建及其对PRRSV增殖的影响

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畜牧兽医学报 2024年第3期55卷 1159-1169页

作者：荆扬王玉淼李洋常辉马志倩李志伟肖书奇中国农业科学院兰州兽医研究所、兰州大学动物医学与生物安全学院动物疫病防控全国重点实验室兰州730046 西北农林科技大学动物医学院杨凌712100 塔里木大学动物科学与技术学院阿拉尔843300

为了给深入研究猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndromevirus,PRRSV)ORF6基因编码的M蛋白的生物学功能提供重要试验材料,本研究首先利用慢病毒包装系统构建了过表达PRRSVORF6基因的重组慢病毒质粒,将该... 详细信息

为了给深入研究猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndromevirus,PRRSV)ORF6基因编码的M蛋白的生物学功能提供重要试验材料,本研究首先利用慢病毒包装系统构建了过表达PRRSVORF6基因的重组慢病毒质粒,将该质粒连同辅助质粒共同转染至HEK293T细胞获得重组慢病毒;之后将重组慢病毒感染MARC-145细胞,利用嘌呤霉素结合有限稀释法进行筛选,连续筛选3轮后建立了稳定表达PRRSVM蛋白的MARC-145ORF6细胞系;并使用CCK-8试验评估过表达PRRSVM蛋白对MARC-145细胞生长的影响。利用RT-PCR、蛋白免疫印迹(Westernblot)和间接免疫荧光(IFA)评估MARC-145ORF6细胞系的传代稳定性并鉴定M蛋白的亚细胞定位,进一步利用RT-qPCR评估过表达M蛋白对MARC-145细胞的干扰素及相关调节基因的影响;此外,还测定了PRRSV在MARC-145ORF6细胞系、MARC-145Flag细胞系和MARC-145细胞中的病毒滴度并绘制多步生长曲线以比较其差异。CCK-8试验结果表明,过表达PRRSVM蛋白对MARC-145细胞活力无显著影响;RT-qPCR、Westernblot和IFA等试验结果表明,MARC-145ORF6细胞系能够表达PRRSV的M蛋白且在传代过程中稳定。此外,稳定表达PRRSVM蛋白显著下调了细胞系的Ⅰ型干扰素及其相关调节基因;多步生长曲线表明,MARC-145ORF6细胞系促进PRRSV增殖,提高其病毒滴度。综上,本研究构建了可以稳定表达PRRSVM蛋白的MARC-145ORF6细胞系,发现其Ⅰ型干扰素水平显著下调且促进PRRSV复制。本研究构建的MARC-145ORF6细胞系将为M蛋白功能的深入研究提供重要生物材料。

关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒过表达细胞系 ORF6基因 M蛋白 MARC-145细胞

PRRSV阳性猪源肺炎克雷伯菌的分离鉴定及特性分析

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中国兽医科学 2024年

作者：常辉王玉淼李静李洋荆扬郑紫方裴秀秀陈劭肖书奇郑海学齐萌西北农林科技大学动物医学院中国农业科学院兰州兽医研究所兰州大学动物医学与生物安全学院动物疫病防控全国重点实验室塔里木大学动物科学与技术学院

本试验旨在研究临床感染猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)后继发感染的细菌病原及其生物学特性，为实现PRRSV继发细菌感染的有效防控提供研究基础。无菌采集感染PRRSV死亡仔猪的胸... 详细信息

本试验旨在研究临床感染猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)后继发感染的细菌病原及其生物学特性，为实现PRRSV继发细菌感染的有效防控提供研究基础。无菌采集感染PRRSV死亡仔猪的胸腔积液进行细菌的分离与纯化，对分离菌进行形态学鉴定、分子生物学鉴定、药敏试验检测、耐药基因和毒力基因检测，进一步通过动物试验评估分离菌的致病性。结果发现，该菌为革兰阴性短杆菌，葡萄糖、尿素、蛋白胨水、枸橼酸盐、赖氨酸生化试验呈阳性，初步鉴定为克雷伯菌属细菌；细菌通用引物PCR扩增产物测序结果显示，该菌与巴基斯坦肉鸡源肺炎克雷伯菌的同源性为99.77%，进一步鉴定出分离菌株为肺炎克雷伯菌。药敏试验结果显示，该株肺炎克雷伯菌对四环素、红霉素、阿奇霉素、青霉素、氨苄西林、林可霉素6种药物有较强的耐药性，对链霉素、卡那霉素不敏感；该菌携带3种耐药基因和6种毒力基因，对BALB/c小鼠具有较强的致病性，7.0×108CFU/mL攻毒时死亡率为100%。本研究自PRRSV感染死亡仔猪体内分离出1株肺炎克雷伯菌，该菌具有多重耐药性和较强的致病性；肺炎克雷伯菌是PRRSV感染的重要继发致病菌，对PRRSV阳性猪继发细菌感染的防治具有重要指导意义。

关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒肺炎克雷伯菌毒力耐药性致病性

谷氨酰胺对大鼠运动性疲劳的改善作用及其机制

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中国应用生理学杂志 2021年第3期37卷 293-297页

作者：江涛韦雪亮肖书奇广西大学体育学院南宁530004 西北农林科技大学动物医学院陕西杨凌712100

目的:探讨谷氨酰胺(Gln)对大鼠运动性疲劳、骨骼肌氧化应激和肝脏细胞凋亡的改善作用。方法:将8周龄SPF级雄性SD大鼠20只,体重180~220 g,适应性喂养1周后随机分为对照组和谷氨酰胺干预组,每组10只。谷氨酰胺干预组采用每天1.0 g/kg/d谷... 详细信息

目的:探讨谷氨酰胺(Gln)对大鼠运动性疲劳、骨骼肌氧化应激和肝脏细胞凋亡的改善作用。方法:将8周龄SPF级雄性SD大鼠20只,体重180~220 g,适应性喂养1周后随机分为对照组和谷氨酰胺干预组,每组10只。谷氨酰胺干预组采用每天1.0 g/kg/d谷氨酰胺灌胃(约2 ml),对照组以等体积生理盐水灌胃(约2 ml),持续7 d。随后进行力竭实验,禁食不禁水12 h后处死大鼠,检测血清及骨骼肌谷胱甘肽(GSH)和丙二醛(MDA)水平及超氧化物歧化酶(SOD)活力,检测血清乳酸(LD)水平及肌酸激酶(CK)和乳酸脱氢酶(LDH)活力;荧光实时定量PCR检测肝组织Bcl-2和Bax基因表达水平。结果:与对照组相比,谷氨酰胺干预组大鼠力竭时间显著延长(P<0.05),血清CK、LDH及LD水平显著降低(P<0.05),血清与骨骼肌中GSH和SOD水平显著提高(P<0.05),MDA水平明显降低(P<0.05);肝组织Bax基因表达水平显著降低(P<0.05),Bcl-2基因表达水平明显显著增高(P<0.05)。结论:谷氨酰胺有缓解大鼠运动性疲劳的作用,其机制可能与降低骨骼肌氧化应激程度和延缓肝脏细胞凋亡率有关。

关键词：谷氨酰胺运动性疲劳氧化应激细胞凋亡大鼠

猪IGF-I基因转录子的克隆、表达特性及SNPs分析

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猪IGF-I基因转录子的克隆、表达特性及SNPs分析

作者：肖书奇吉林大学

学位级别：硕士

IGF-Ⅰ是动物生长发育和代谢的主要调节因子和生长激素启动生长活性的主要介导者。而猪IGF-Ⅰ基因的特征和IGF-ⅠmRNAs转录子类别及表达方式的研究落后于其它物种,本文通过RACE、实时荧光定量PCR和PCR-SSCP方法,研究了松辽黑猪IGF-I基... 详细信息

IGF-Ⅰ是动物生长发育和代谢的主要调节因子和生长激素启动生长活性的主要介导者。而猪IGF-Ⅰ基因的特征和IGF-ⅠmRNAs转录子类别及表达方式的研究落后于其它物种,本文通过RACE、实时荧光定量PCR和PCR-SSCP方法,研究了松辽黑猪IGF-I基因的结构、表达特征、SNP以及与生长和胴体性状的相关性。为进一步从分子水平进行该基因的表达调控研究和松辽黑猪的超早期选种和遗传改良提供理论依据。研究结果表明: 松辽黑猪IGF-Ⅰ基因外显子1和外显子2选择性的拼接到外显子3上分别产生Ⅰ类和Ⅱ类IGF-ⅠmRNA转录子;在松辽黑猪IGF-I cDNA的3’末端没有发现外显子5的序列,推测松辽黑猪肝脏中IGF-I基因的绝大部分转录产物可能只使用外显子6,翻译成蛋白质IGF-IA。两类IGF-I mRNAs在松辽黑猪的各种组织中均有表达,而且Ⅰ类IGF-I mRNA的表达丰度显著高于Ⅱ类IGF-ⅠmRNA的表达丰度;两类IGF-I mRNAs在松辽黑猪、野猪、杜洛克猪、长白猪和大白猪的肝脏中的表达丰度差异不显著,在5个品种的肌肉中的表达丰度差异也不显著;肝脏中I类IGF-I mRNA的表达丰度显著高于肌肉组织。肌肉组织中I类IGF-I mRNA的表达水平与猪的日增重和腿臀比呈正相关,II类IGF-I mRNA的表达水平也与日增重呈正相关;而肝脏中的I类IGF-I mRNA和II类IGF-I mRNA的表达水平均与所测定的生产性能没有相关性。松辽黑猪IGF-Ⅰ基因的5’UTR区未发现PCR-SSCP遗传多态;在第四外显子中存在一A→G同义突变,有三种基因型AA型、AB型、BB型;AA型个体的瘦肉率显著低于AB型和BB型,背膘厚极显著高于AB型和BB型,日增重显著高于AB型和BB型。可以初步推断IGF-Ⅰ基因可能是影响猪的生长和胴体性状的一个主效基因或是一个与影响猪生长和胴体性状的QTL连锁的基因。

关键词：松辽黑猪 IGF-Ⅰ基因 RACE 荧光定量RT-PCR SNP 相关分析

一种基于猪流行性腹泻病毒S1蛋白的单域抗体的阻断ELISA方法及其评价

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生物工程学报 2021年第9期37卷 3221-3230页

作者：马志倩白鸽王天宇李志伟李洋肖书奇李爽西北农林科技大学动物医学院陕西杨凌712100 渭南市动物疫病预防控制中心陕西渭南714000

文中旨在利用猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)S1蛋白生物素化纳米抗体建立一种阻断酶联免疫吸附试验(Blocking enzyme-linked immunosorbent assay,bELISA)方法,用于检测猪体内PEDV抗体水平及疫苗免疫效果的评估。对PEDVS1蛋白的特异性单域抗体(Single-domain antibodies,sdAb)sdAb3基因进行扩增,并在3′端融合Avitag序列,构建至原核表达载体pET21b,进行sdAb3-Avitag蛋白诱导表达纯化。对纯化的sdAb3-Avitag融合蛋白进行生物素标记并鉴定其活性。以PEDV重组S1蛋白为抗原,通过对各反应条件进行摸索与优化,建立一种可靠灵敏的bELISA方法应用于血清样品检测,并与商品化试剂盒检测进行比价。成功构建重组载体pET21b-sdAb3-Avitag并诱导表达出sdAb3-Avitag蛋白。体外生物素标记的sdAb3(sdAb3-Biotin)具有良好的活性。所构建的bELISA方法中,最适参数为:S1蛋白的包被浓度200 ng/孔;血清稀释比例1︰2,血清孵育时间2 h;sdAb3-Biotin稀释比1︰8000,孵育时间30 min;酶标抗体稀释比例1︰5000,反应时间30 min。所建立的方法与猪传染性胃肠炎病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒等主要猪源病毒的阳性血清均无交叉反应,具有良好的特异性和重复性。利用建立的bELISA方法对临床54份猪血清样品进行检测,结果显示,该方法与商品化试剂盒检测结果具有92.56%的总体符合率。文中建立了一种省时可靠的bELISA方法,可用于PEDV的临床监测和疫苗免疫效果评估。

关键词：猪流行性腹泻病毒生物素化单域抗体阻断ELSIA S1蛋白

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双低油菜籽粕在生长育肥猪日粮中的应用

河南农业科学 2004年第3期33卷 46-47页

作者：李培庆张慧辉肖书奇河南职业技术师范学院河南新乡453003

随着我国大规模畜牧产业化的形成,饲料资源的开发利用显得更为重要.但由于油菜籽粕含有硫苷、单宁、植酸、芥子碱等有毒成分,使其在畜禽饲料中的应用受到了限制,而经处理后不含硫苷、单宁、植酸、芥子碱等有毒成分的油菜籽粕可作为畜禽... 详细信息

随着我国大规模畜牧产业化的形成,饲料资源的开发利用显得更为重要.但由于油菜籽粕含有硫苷、单宁、植酸、芥子碱等有毒成分,使其在畜禽饲料中的应用受到了限制,而经处理后不含硫苷、单宁、植酸、芥子碱等有毒成分的油菜籽粕可作为畜禽饲料使用.经无毒处理过的油菜籽粕,其粗蛋白含量高达45%,氨基酸的含量接近豆粕,是一种很好的畜禽饲料原料.

关键词：双低油菜籽粕生长育肥猪日粮

分光光度测量法与比浊法判定布鲁菌病试管凝集试验结果的比较

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动物医学进展 2019年第12期40卷 131-135页

作者：赵玥肖书奇孙世铎西北农林科技大学动物科技学院陕西杨凌712100 西北农林科技大学动物医学院陕西杨凌712100 汉台区畜牧兽医技术推广中心陕西汉中723000

为鉴定、验证、评价分光光度测量法在试管凝集试验结果判定中的实用价值,按照《动物布鲁氏菌病诊断技术》(GB/T 18646-2002)试管凝集试验操作方法检测72份已知凝集效价血清,比较分光光度测量法和比浊法判定结果差异。结果显示,分光光度... 详细信息

为鉴定、验证、评价分光光度测量法在试管凝集试验结果判定中的实用价值,按照《动物布鲁氏菌病诊断技术》(GB/T 18646-2002)试管凝集试验操作方法检测72份已知凝集效价血清,比较分光光度测量法和比浊法判定结果差异。结果显示,分光光度测量法和比浊法判定72份血清效价与已知效价符合率分别为88.89%(64/72)、83.33%(60/72)(P>0.05),判定结果一致率为94.44%,Kappa值0.77>0.75,但分光光度测量法判定效价与已知效价符合率高于比浊法,且对试验结果的判定更为客观、准确,因此,分光光度测量法判定试管凝集试验结果适宜在布鲁菌病监测中推广应用。

关键词：分光光度测量法比浊法布鲁菌病试管凝集试验

PI3K/AKT抑制剂渥曼青霉素对猪前体脂肪细胞增殖和凋亡的影响

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遗传 2012年第10期34卷 1282-1290页

作者：郭云学莫德林陈瑶生张悦张云肖书奇刘小红中山大学生命科学学院有害生物控制与资源利用国家重点实验室广州510006

为探寻PI3K/AKT抑制剂渥曼青霉素(Wortmannin,WM)对猪前体脂肪细胞增殖和凋亡均无影响的适宜浓度,文章首先分离并验证了猪原代前体脂肪细胞的分化潜能,然后对不同浓度渥曼青霉素处理11 d的细胞采用Annexin V-FITC/PI双标法检测细胞凋亡... 详细信息

为探寻PI3K/AKT抑制剂渥曼青霉素(Wortmannin,WM)对猪前体脂肪细胞增殖和凋亡均无影响的适宜浓度,文章首先分离并验证了猪原代前体脂肪细胞的分化潜能,然后对不同浓度渥曼青霉素处理11 d的细胞采用Annexin V-FITC/PI双标法检测细胞凋亡,并通过凋亡相关基因的表达以及DNA损伤程度进行验证,同时利用甲烷硫代磺酸盐(Methanethiosulfonate,MTS)检测了细胞的增殖活性。结果表明,100 nmol/L渥曼青霉素对猪前体脂肪细胞的增殖和凋亡均无显著影响,而200 nmol/L的渥曼青霉素对猪原代脂肪细胞的增殖活性虽没有显著影响,但对细胞凋亡有显著促进作用。研究发现,处理后促凋亡因子caspase8和TNFR1表达显著上调,非caspase依赖促凋亡因子GZMA表达无显著性差异,而GZMB表达则显著上调,抗凋亡因子Bcl-x1表达显著上调,cFLIP表达则无显著性差异。100 nmol/L的渥曼青霉素对细胞DNA的损伤不显著。因此,100 nmol/L的渥曼青霉素对猪前体脂肪细胞的增殖和凋亡均无显著影响,是在不影响细胞生长的情况下研究PI3K通路对脂肪细胞分化的较为理想的浓度。

关键词：渥曼青霉素脂肪细胞增殖凋亡

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一株猪源肺炎克雷伯菌的分离与鉴定

中国兽医科学 2021年第8期51卷 999-1006页

作者：付霞丽郑紫方肖书奇李爽西北农林科技大学动物医学院陕西杨凌712100

2020年6月陕西某猪场猪大规模发病,表现为精神萎靡、喜卧、不食、呼吸急促、腹泻、肺部有出血点,肝脏肿大。为查明是否有细菌感染,通过细菌分离培养、革兰染色、菌落形态观察、生化试验、药敏试验、16S rRNA基因测序比对、致病性试验,... 详细信息

2020年6月陕西某猪场猪大规模发病,表现为精神萎靡、喜卧、不食、呼吸急促、腹泻、肺部有出血点,肝脏肿大。为查明是否有细菌感染,通过细菌分离培养、革兰染色、菌落形态观察、生化试验、药敏试验、16S rRNA基因测序比对、致病性试验,对病原菌进行了分离鉴定。结果,分离到一株革兰阴性短杆菌;该分离菌株在固体LB琼脂平板呈白色、隆起、菌落直径较大的湿润菌落;尿素、七叶苷、乳糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、山醇、硫化氢、阿糖反应为阳性,赖氨酸反应为阴性;16S rRNA基因序列比对结果显示,该分离菌株与肺炎克雷伯菌的同源性高达99%,确定该菌为肺炎克雷伯菌;药敏结果显示,该分离菌株对抗生素有不同程度的耐药性;耐药基因检测结果显示,该分离菌株具有SHV耐药基因;动物致病性试验显示,该菌能使小鼠死亡,表明该菌具有致病性。上述结果表明,本研究分离到的细菌为猪源肺炎克雷伯菌,为进一步研究肺炎克雷伯菌的特性提供了基础数据,为抗生素的合理使用提供了参考依据。

关键词：肺炎克雷伯菌生化试验药敏试验 16S rRNA 致病性