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聚羟基丁酸酯颗粒在重组人组织纤溶酶原激活剂（rPA）表达中的应用

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聚羟基丁酸酯颗粒在重组人组织纤溶酶原激活剂（rPA）表达中的应用

作者：耿艳平山东大学

学位级别：硕士

聚羟基脂肪酸酯（PHAs）是多种微生物在碳源过量或其他营养物质匮乏时,合成的碳源和能源的储藏化合物。PHAs的合成原料为可再生资源,具有良好的热塑性和弹性,易被生物降解,且无毒害作用,在工业和医药行业具有重要应用价值。聚羟基丁酸酯... 详细信息

聚羟基脂肪酸酯（PHAs）是多种微生物在碳源过量或其他营养物质匮乏时,合成的碳源和能源的储藏化合物。PHAs的合成原料为可再生资源,具有良好的热塑性和弹性,易被生物降解,且无毒害作用,在工业和医药行业具有重要应用价值。聚羟基丁酸酯（PHB）是发现最早,研究最透彻的短链PHASCL,在细胞中以不溶性纳米粒／微粒形式存在。PHB颗粒含有一个聚酯核心,被单层磷脂膜包裹,膜上结合着多种蛋白,其中PhaP是主要结构蛋白。近年来,PHB的应用范围被逐渐扩大到生物医学领域,对真核药物蛋白的表面表达和纯化具有重要作用。本研究从Ralstonia eutropha H16中克隆了PHB生物合成途径中的三个催化酶：β-酮硫解酶（PhbA）、乙酰乙酰-CoA还原酶（PhbB）和PHA合酶（PhbC）,将这三个酶的编码基因置于rpoS基因的启动子下游,构建了由生长压力诱导从而启动转录的PHB操纵子。将载有该操纵子的质粒pHBS01分别导入Eschericha. coli XL1-Blue和BL2l（DE3）中,在LB培养基中以0.5%葡萄糖为碳源进行发酵,检测两种重组菌株的生长状态和合成PHB的能力。结果表明,E. coli XL1-Blue/pHBS01的生物量约为BL21（DE3）的两倍;其胞内PHB颗粒的含量占菌体干重的25%,约是BL21 （DE3）/pHBS01中PHB含量的三倍（9%）,且XL1-Blue/pHBS01合成的PHB颗粒数量较多,形态较小,均匀布满于整个细胞。已知PHB颗粒表面共价结合大量小分子蛋白PhaP,通过融合表达策略可以将外源蛋白锚定到颗粒表面。载有融合蛋白的PHB颗粒经过简单的超速离心即可分离纯化,较传统的蛋白纯化方法简便经济、可靠易行。因此,上述构建的重组*** XL1-Blue/pHBS01是一种基于PHB颗粒的蛋白表面表达系统。在正常生理条件下,E. coli胞内的还原态不利于二硫键的形成,含有较多二硫键的真核蛋白往往以无活性的包涵体形式存在于E. coli胞质中。为解决此问题,我们选择了重组人组织纤溶酶原激活剂（rPA）作为研究蛋白。rPA分子内含有九对二硫键,是一种很难在E. coli胞质中进行活性表达的非糖基化真核药物蛋白。我们将rPA基因克隆到小分子蛋白PhaP基因的C端,在基因之间引入凝血酶切割位点,构建了受Plac启动子调节的PhaP-rPA融合蛋白表达载体pSPAr,并将此质粒转化到压力诱导合成PHB的XL1-Blue/pHBS01细胞中,构建了重组菌XL1-Blue （pHBS01+pSPAr）。在LB培养基中以0.5%葡萄糖为碳源,在指数生长后期诱导PhaP-rPA融合蛋白的表达。SDS-PAGE和免疫印记检测结果表明,PhaP-rPA融合蛋白成功展示在PHB颗粒表面,且具有溶纤维蛋白活性,酶活约为760 IU/g细胞干重,产量为53.8μg/g细胞。上述结果表明,PHB合成过程中对还原力NADPH的消耗改变了E. coli胞内的还原态,有效地促进了分子内含有复杂二硫键真核蛋白的活性表达;此外,PHB颗粒稳定性高、纯化过程简便经济,因此,本研究构建的PHB表面表达系统,为分子内含有二硫键外源蛋白的活性表达和纯化,提供了有价值的理论参考和技术基础。把rPA活性展示在PHB颗粒表面用的是双质粒系统,不仅需要考虑质粒的相容性,而且双重抗生素会加大宿主的代谢负担,从而降低该系统的稳定性并限制其扩大应用。为此,我们将编码PHB合成的三个酶的基因置于经过改造的单拷贝tac启动子下游,构建了组成型表达的PHB操纵子,并利用高效的大片段重组技术将其整合到E. coli的poxB基因位点。实验结果表明,该菌株在以葡萄糖为碳源的M9培养基中,不添加任何诱导剂即可稳定合成PHB,但产量较低。于是我们采用启动子改造工程,首次将PHB合成基因置于5个串联重复的PMtac启动子下游,使改造后的菌株合成PHB的能力提高了5倍,为对该菌株的进一步遗传操作以提高PHB的产量提供了理论指导,从而为构建稳定的PHB颗粒表面表达系统奠定了理论和技术基础。

关键词：聚羟基脂肪酸酯聚羟基丁酸酯重组人组织纤溶酶原激活剂大肠杆菌 PhaP蛋白

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好氧发酵生产琥珀酸工程菌株的构建

生物工程学报 2008年第12期24卷 2081-2085页

作者：康振耿艳平张园园祁庆生山东大学微生物技术国家重点实验室济南250100 山东大学国家糖工程技术研究中心济南250100

通过分析大肠杆菌的碳源代谢途径,利用基因敲除手段,以Escherichia coli MG1655为出发菌株,成功构建了琥珀酸好氧发酵生产工程菌***1111(MG1655ΔptsGΔpoxBΔptaΔiclRΔsdhA)。检测结果表明该菌株能以葡萄糖为碳源,在好氧发酵且不表... 详细信息

通过分析大肠杆菌的碳源代谢途径,利用基因敲除手段,以Escherichia coli MG1655为出发菌株,成功构建了琥珀酸好氧发酵生产工程菌***1111(MG1655ΔptsGΔpoxBΔptaΔiclRΔsdhA)。检测结果表明该菌株能以葡萄糖为碳源,在好氧发酵且不表达任何异源基因的条件下大量积累琥珀酸。摇瓶试验证明,琥珀酸发酵产量达到26.4g/L,乙酸盐作为唯一检测到的副产物产量为2.3g/L。二者浓度比达到11.5:1。

关键词：大肠杆菌琥珀酸代谢工程

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有效把握课堂生成促进学生实际获得

有效把握课堂生成促进学生实际获得

大肠杆菌突变株QQS101发酵生产琥珀酸初步研究

作者：耿艳平北京市延庆区刘斌堡中心小学

"课堂生成"是生态课堂框架下一道靓丽的思维风景,如果课堂生成被教师有效的把握住,学生的学习活动就真正的发生了,学生的思维也就随即达到一个高度。关于"生成",无论是《标准(实验稿)》还是《标准(2011年版)》,都是始终如一地坚持:"教...

"课堂生成"是生态课堂框架下一道靓丽的思维风景,如果课堂生成被教师有效的把握住,学生的学习活动就真正的发生了,学生的思维也就随即达到一个高度。关于"生成",无论是《标准(实验稿)》还是《标准(2011年版)》,都是始终如一地坚持:"教学活动是师生积极参与、交往互动、共同发展的过程。有效的教学活动是学生学习与教师的教的统一,学生是学习的主体。"而且《标准(2011年版)》进一步强调"学生的数学学习活动应当是一个生动活泼的、主动的和富有个性的过程。"足以见得,学生

关键词：

来源： cnki会议评论

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中国生物工程杂志 2010年第10期30卷 39-43页

作者：李宜奎康俊华康振耿艳平王义华祁庆生山东大学微生物技术国家重点实验室济南250100 江西农业大学理学院南昌330045

琥珀酸是一种具有重要应用价值的生物基平台化合物。对大肠杆菌focA-pflBldhA突变株QQS101在严格厌氧条件下生长和葡萄糖代谢能力进行了考察,比较分析了葡萄糖与大肠杆菌混合酸发酵产物的单位碳的还原程度,认为非严格厌氧条件有利于QQS... 详细信息

琥珀酸是一种具有重要应用价值的生物基平台化合物。对大肠杆菌focA-pflBldhA突变株QQS101在严格厌氧条件下生长和葡萄糖代谢能力进行了考察,比较分析了葡萄糖与大肠杆菌混合酸发酵产物的单位碳的还原程度,认为非严格厌氧条件有利于QQS101发酵葡萄糖积累琥珀酸,进一步对有氧生长碳源进行了对比试验的结果表明,以木糖支持有氧生长,QQS101摇瓶发酵39h消耗葡萄糖37.6g/L,琥珀酸的产量达到31.01g/L,摩尔产率为1.258molSuccinate/molGlucose。发酵过程中,丙氨酸的添加能够提高琥珀酸的摩尔产率。

关键词：大肠杆菌琥珀酸木糖丙氨酸

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几种不同药剂防治小麦赤霉病药效试验

湖北植保 2006年第3期 24-25页

作者：王鹏杨瑞清耿艳平袁泽惠丽湖北省枣阳市植保站枣阳441200 湖北省枣阳市植检站枣阳441200

小麦赤霉病,在枣阳市原属偶发性病害,但2000年后持续偏重发生,每年发生面积约3.24万hm2,每年造成小麦损失约1 00 t,多菌灵在我市防治小麦赤霉病已使用20多年了,病原物已产生抗药性,防效大大地降低.2005年又是一个发生偏重年份,进行了筛... 详细信息

小麦赤霉病,在枣阳市原属偶发性病害,但2000年后持续偏重发生,每年发生面积约3.24万hm2,每年造成小麦损失约1 00 t,多菌灵在我市防治小麦赤霉病已使用20多年了,病原物已产生抗药性,防效大大地降低.2005年又是一个发生偏重年份,进行了筛选防治小麦赤霉病的药剂筛选,结果报道如下:

关键词：小麦赤霉病药剂防治药效试验药剂筛选发生面积 100t 偶发性枣阳市多菌灵抗药性

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三波长法测定超临界萃取九州虫草总黄酮含量

北方园艺 2017年第2期 132-135页

作者：朱建民张国英窦培培耿艳平冯婧凌建亚山东大学微生物技术国家重点实验室山东济南250100 山东省轻工工程学校海洋经济系山东青岛266112 山东中医药大学药学院山东济南250014

以九州虫草为试材,采用三波长-紫外分光光度法,测定了九州虫草超临界流体萃取物中的总黄酮含量。结果表明:以芦丁为标准品,选定244、272、302nm为测定波长,标准曲线回归方程为y=0.025 3x-0.090 4(r2=0.999 7);在浓度16~56μg·mL^(-1)内... 详细信息

以九州虫草为试材,采用三波长-紫外分光光度法,测定了九州虫草超临界流体萃取物中的总黄酮含量。结果表明:以芦丁为标准品,选定244、272、302nm为测定波长,标准曲线回归方程为y=0.025 3x-0.090 4(r2=0.999 7);在浓度16~56μg·mL^(-1)内,△A与浓度之间呈良好的线性关系,表明该方法稳定性好,回收率为94.80%~97.75%,精密度RSD<0.67%(n=6),超临界提取获得的虫草黄酮含量为1.89mg·g^(-1)。

关键词：九州虫草黄酮类化合物三波长-紫外分光光度法超临界萃取

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马克思精神生产理论视域下的文化领导权概念

浙江学刊 2025年第1期 116-125+240页

作者：文学平西南政法大学马克思主义学院

精神生产就是“思想、观念、意识的生产”;精神生产活动就是文化生产活动，精神产品就是文化产品，精神生产受“生产的普遍规律的支配”。马克思有一种奠基于“精神生产”概念的发生性文化概念；文化领导权就是精神生产过程的领导权，... 详细信息

精神生产就是“思想、观念、意识的生产”;精神生产活动就是文化生产活动，精神产品就是文化产品，精神生产受“生产的普遍规律的支配”。马克思有一种奠基于“精神生产”概念的发生性文化概念；文化领导权就是精神生产过程的领导权，它由生产支配权、话语主导权、理论建构权和价值引领权四项权能构成。精神生产上的无政府主义和千篇一律是坚持党的文化领导权过程中要避免出现的两种极端状态。

关键词：文化领导权精神生产生产支配权话语主导权理论建构权价值引领权

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出版行业市场型人才特质与成长路径研究

中国编辑 2025年第1期 53-58页

作者：蒋艳平北京开卷信息技术有限公司

人才是出版行业高质量发展的关键要素。通过对当前出版行业人才基本情况的调查研究发现，当前出版行业人才结构性短缺问题较为突出。面对当前出版行业面临的行业保护与政策依赖、价格战、图书销售困境等问题，出版行业亟须培养大量的市... 详细信息

人才是出版行业高质量发展的关键要素。通过对当前出版行业人才基本情况的调查研究发现，当前出版行业人才结构性短缺问题较为突出。面对当前出版行业面临的行业保护与政策依赖、价格战、图书销售困境等问题，出版行业亟须培养大量的市场型人才，这样的人才要对市场有信仰，能够贴近和研究消费者，拥有良好的人文素养，时刻关注最新信息，学会练习和复盘，能够经受磨炼，同时具备互联网用户思维。

关键词：出版行业市场型人才营销能力产品价值人文素养互联网用户思维

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原位激发产脲酶微生物固化尾矿砂试验

硅酸盐学报 2025年

作者：赖永明孔秋平龙岩学院资源工程学院福建永强岩土股份有限公司

尾矿砂力学性质差，重金属含量高，故其治理需要兼顾力学性能的提升和重金属的固定，实际工程中还需考虑成本及适用性。设计并优化尾矿砂原位激发方案，筛选富集本土微生物中的产脲酶菌固化尾矿砂，通过一系列试验评价比较本土产脲酶菌... 详细信息

尾矿砂力学性质差，重金属含量高，故其治理需要兼顾力学性能的提升和重金属的固定，实际工程中还需考虑成本及适用性。设计并优化尾矿砂原位激发方案，筛选富集本土微生物中的产脲酶菌固化尾矿砂，通过一系列试验评价比较本土产脲酶菌和巴氏芽孢杆菌固化尾矿砂效果及经济环境效益。结果表明：1) 相同固化轮次下，本土产脲酶菌具有更强的重金属固定能力和更好的固化深度和均匀性。2) 本土产脲酶菌固化15轮与巴氏芽孢杆菌固化10轮的尾矿砂力学性能相当，同时成本下降2/3。3) 原位激发诱导碳酸钙沉淀填充了砂颗粒间的孔隙，并将可交换态的重金属转变为金属碳酸盐沉淀、金属–碳酸钙共沉淀或被铁、铝氧化物吸附，在提升力学性能的同时实现了原位固定尾矿砂中重金属。原位激发产脲酶微生物固化尾矿砂改善了砂土肥力，有利于矿山植被修复，具有良好的工程适用性和经济环境效益。

关键词：原位激发微生物诱导碳酸钙沉淀尾矿砂重金属固定