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东方蜜蜂微孢子虫侵染意大利蜜蜂的分子机制初探

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东方蜜蜂微孢子虫侵染意大利蜜蜂的分子机制初探

作者：耿四海福建农林大学

学位级别：硕士

东方蜜蜂微孢子虫(Nosema ceranae)是专性寄生成年蜜蜂中肠上皮细胞的单细胞真菌病原。感染东方蜜蜂微孢子虫可引起蜜蜂的肠道破坏、消化系统紊乱、寿命缩短、免疫基因抑制、细胞凋亡抑制、采蜜量下降等。目前,世界各养蜂国家的蜂群均... 详细信息

东方蜜蜂微孢子虫(Nosema ceranae)是专性寄生成年蜜蜂中肠上皮细胞的单细胞真菌病原。感染东方蜜蜂微孢子虫可引起蜜蜂的肠道破坏、消化系统紊乱、寿命缩短、免疫基因抑制、细胞凋亡抑制、采蜜量下降等。目前,世界各养蜂国家的蜂群均伴有不同程度的东方蜜蜂微孢子虫感染。然而,东方蜜蜂微孢子虫的侵染机制迄今尚未阐明,非编码RNA在病原侵染过程的作用还不清楚。因此,本课题首先通过孢子计数和RT-qPCR等手段对东方蜜蜂微孢子虫对意大利蜜蜂(Apis mellifera ligustica,简称意蜂)工蜂的侵染性进行探究,再联用smallRNA-seq和链特异性建库的lncRNA-seq技术对东方蜜蜂微孢子虫感染的意蜂工蜂中肠及未感染中肠进行测序,从中筛滤得到病原的mRNA、miRNA和lncRNA组学数据,并结合已获得的孢子全转录组数据进行全面的分析和探讨,在mRNA、miRNA、lncRNA组学水平深入解析东方蜜蜂微孢子虫的侵染机制。获得的主要研究结果如下:1.在实验室条件下对意蜂工蜂进行东方蜜蜂微孢子虫的饲喂接种,PCR和琼脂糖凝胶电泳结果显示东方蜜蜂微孢子虫可有效侵染意蜂工蜂;孢子计数结果显示接种后1 d-4 d,工蜂中肠内孢子数呈下降趋势,在5 d-14 d表现为逐渐升高趋势;东方蜜蜂微孢子虫主要寄生工蜂中肠上皮细胞,而且病原孢子随着感染时间的延长而持续增加。2.从感染工蜂中肠的lncRNA-seq混合数据中筛滤得到5 816 465和28 501 225条东方蜜蜂微孢子虫的高质量有效读段(clean reads);从感染工蜂中肠的sRNA-seq混合数据中筛滤得到21 525 444和30316 756条东方蜜蜂微孢子虫的高质量clean reads;3.通过mRNA组学分析发现,NcCKM vs NcT1M,NcCKM vs NcT2M和NcT1M vs NcT2M比较组分别得到1 397,1 497和52个差异表达基因(differentially expressed gene,DEG),分别涉及23、23和11个GO条目,以及80、79和27条KEGG通路;NcCKM vs NcT1M分别有5个上调基因和2个下调基因富集在MAPK信号通路,NcCKM vs NcT2M中分别有2个上调基因和5个下调基因富集在MAPK信号通路;孢壁蛋白、孢壁和锚定盘复合蛋白、几丁质酶、极管蛋白和蓖麻毒素B凝集素等毒力因子的编码基因,以及己糖激酶、ATP/ADP转移酶和ABC转运体等侵染相关因子的编码基因在病原增殖中可能具有重要功能。4.通过miRNA组学分析发现,NcCKS vs NcT1S、NcCKS vs NcT2S和NcT1S vs NcT2S比较组分别包含164、122和60个差异表达miRNA(differentially expressed miRNA,DEmiRNA)。上述DEmiRNA分别预测出1 885、1 733和1 524个靶mRNA,分别注释到27、25和26个GO条目,注释数量最多的是新陈代谢进程、催化活性和细胞进程;还能到84、84和84条KEGG通路,注释数量最多的是代谢途径、核糖体和次级代谢产物生物合成;分别有35、26和12个DEmiRNA靶向结合MAPK信号通路相关靶mRNA,分别有49、40和17个DEmiRNA靶向结合糖酵解/糖异生通路相关靶mRNA;DEmiRNA可能通过调控蓖麻毒素B凝集素、细胞凋亡抑制因子、极管蛋白和孢壁蛋白等病原毒力因子的基因表达,以及己糖激酶、ATP/ADP转位酶、ABC转运体和转录因子ste12等侵染相关因子的基因表达,介导东方蜜蜂微孢子虫对意大利蜜蜂工蜂的侵染。5.通过lncRNA组学分析发现,NcCKL vs NcT1L、NcCKL vs NcT2L和NcT1L vs NcT2L分别包含19、24和4个差异表达lncRNA(differentially expressed lncRNA,DElncRNA),分别调控26、27和2个上下游基因,DElncRNA可能通过顺式作用调控东方蜜蜂微孢子虫的Argonaut等基因的表达,从而介导病原侵染;上述DElncRNA可通过trans作用分别调控30、39和8个mRNA,多数可同时调控1个正相关的mRNA和1个负相关的mRNA;DElncRNA可能通过反式作用调控ATP/ADP转移酶和孢壁蛋白基因,从而介导东方蜜蜂微孢子虫的侵染;NcCKL vs NcTL1中的15个DElncRNA可靶向结合195个miRNA及204个mRNA,NcCKL vs NcTL2中的23个DElncRNA可靶向结合211个miRNA及216个mRNA,NcTL1 vs NcTL2中的4个DElncRNA可靶向结合94个miRNA及73个mRNA;DElncRNA可能通过竞争性内源RNA(competing endogenousRNA,ce

关键词：东方蜜蜂微孢子虫长链非编码RNA 微小RNA 毒力因子侵染机制意大利蜜蜂

意大利蜜蜂工蜂中肠发育过程中长链非编码RNA的差异表达分析

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意大利蜜蜂工蜂中肠发育过程中长链非编码RNA的差异表达分析

意大利蜜蜂工蜂中肠响应Nosema ceranae胁迫的高表达基因分析

第十二届海峡两岸蜜蜂与蜂产品高峰论坛暨首届中国西安（蓝...

作者：郭睿耿四海陈大福福建农林大学蜂学学院

长链非编码RNA (lncRNA)在真核生物的基因表达、表观遗传和细胞周期调控等方面发挥重要功能。本研究旨在探究意大利蜜蜂(Apis melliera ligustica,简称意蜂)工蜂肠道发育过程中lncRNAs的表达谱及其作用。本研究利用RNA-seq技术和链特异... 详细信息

长链非编码RNA (lncRNA)在真核生物的基因表达、表观遗传和细胞周期调控等方面发挥重要功能。本研究旨在探究意大利蜜蜂(Apis melliera ligustica,简称意蜂)工蜂肠道发育过程中lncRNAs的表达谱及其作用。本研究利用RNA-seq技术和链特异性建库方法对意蜂7 d和10 d工蜂肠道(Am7,Am10)进行深度测序,下机的原始数据经过Perl脚本过滤得到高质量有效读段。利用bowtie工具将有效读段比对核糖体数据库,进一步利用TopHat2软件将未比对到核糖体数据库上的数据比对到参考基因组。利用CPC和CNCI软件对转录本的编码能力进行预测。通过RT-PCR对部分lncRNAs进行鉴定。利用edgeR软件进行差异表达lncRNAs (DElncRNAs)分析,进而预测lncRNAs的上下游基因,并对上下游基因进行GO及KEGG代谢通路富集分析。联用RNAhybrid、Miranda和TargetScan软件预测DElncRNAs靶向结合的miRNAs及miRNAs靶向结合的靶基因,并通过Cytoscape软件构建DElncRNAs-miRNAs-mRNAs的调控网络。最后,通过RT-qPCR验证测序数据的可靠性。Am7和Am10的深度测序分别获得147 051 470和134 802 058条原始读段,经严格过滤分别得到160 844 082和160 537 248条有效读段;共得到3 890个DElncRNAs,包括2 005个上调lncRNAs与1 885个下调lncRNAs。RT-PCR验证结果显示共有8个lncRNAs能扩增出符合预期的目的片段,表明预测出的lncRNAs真实存在。DElncRNAs的上下游基因数为1 793个,它们涉及42个GO条目,包括代谢进程、发育进程、细胞进程、应激反应和免疫系统进程等;这些上下游基因还涉及251条代谢通路,包括碳代谢、嘌呤代谢和脂肪酸的生物合成等物质代谢通路,硫代谢、甲烷代谢和氧化磷酸化等能量代谢通路,Hippo信号通路、Wnt信号通路和Notch信号通路等信号通路,溶酶体、内吞作用和泛素介导的蛋白水解等细胞免疫通路,以及MAPK信号通路、Jak-STAT信号通路和NF-kappa B信号通路等体液免疫通路,上述结果表明DElncRNAs在意蜂肠道发育过程中参与物质和能量代谢、细胞生命活动和免疫调控。进一步分析发现TCONS0020918可通过调控西方蜜蜂王浆主蛋白1编码基因在意蜂工蜂中肠的营养吸收、级型分化中发挥调控功能。DElncRNAs的调控网络分析结果显示DElncRNAs与miRNAs、mRNAs间存在复杂的调控关系,部分DElncRNAs处于调控网络的中心位置且能靶向结合较多的miRNAs,也有部分miRNAs可被多个DElncRNAs共同靶向,表明这些DElncRNAs可能在肠道发育中发挥重要作用。随机挑取5个DElncRNAs进行RT-qPCR验证,结果显示它们的表达量变化趋势与测序结果一致,证实了本研究测序数据的可靠性。本研究率先对意蜂工蜂肠道发育过程中的lncRNAs及其功能进行深入分析,研究结果提供了意蜂工蜂肠道发育过程中的DElncRNA信息,揭示了DElncRNAs广泛参与意蜂工蜂肠道的新陈代谢、细胞活动和免疫调控以及作为竞争性内源RNA (ceRNA)发挥作用,也为关键lncRNA的筛选和功能研究提供了必要的数据支持。

关键词：意大利蜜蜂肠道发育长链非编码RNA 上下游基因

来源： cnki会议评论

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环境昆虫学报 2018年第5期40卷 1106-1112页

作者：郭睿刀晨熊翠玲郑燕珍付中民耿四海陈大福福建农林大学蜂学学院福州350002

东方蜜蜂微孢子虫Nosema ceranae是专性寄生蜜蜂中肠上皮细胞的单细胞真菌,对意大利蜜蜂(意蜂)具有较强的侵染性。本研究利用RNA-seq技术对正常10 d (Apis mellifera ligustica control group,Am CK)和N. ceranae胁迫10 d的意蜂工蜂中肠... 详细信息

东方蜜蜂微孢子虫Nosema ceranae是专性寄生蜜蜂中肠上皮细胞的单细胞真菌,对意大利蜜蜂(意蜂)具有较强的侵染性。本研究利用RNA-seq技术对正常10 d (Apis mellifera ligustica control group,Am CK)和N. ceranae胁迫10 d的意蜂工蜂中肠(Apis mellifera ligustica treatment group,Am T)进行测序,共得到160 847 237 100条原始读段,过滤后得到1 066 955 298条有效读段。主成分分析结果显示Am CK与Am T测序样品的组内重复性较好,组间的基因表达模式差异明显。GO分类结果显示,Am CK与Am T的前100位高表达基因(HEGs)分别分布于32和33个GO terms,基因富集数最多的均为代谢进程。KEGG代谢通路(pathway)富集分析结果显示,Am CK的前100位HEGs富集在21个pathways,基因富集数最多的是内吞作用、信号通路和嘌呤代谢; Am T的前100位HEGs富集在26个pathways,基因富集数最多的是内吞作用、RNA转运和蛋白质的内质网加工。前100位HEGs的Venn分析结果显示Am CK与Am T的共有HEGs为87个,特有HEGs分别均为13个。研究结果揭示了N. ceranae胁迫意蜂工蜂中肠过程中的基因表达谱信息,也为解析N. ceranae致病的分子机理提供了有益信息和线索。

关键词： RNA-seq 意大利蜜蜂中肠 Nosemaceranae 高表达基因

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意大利蜜蜂工蜂中肠发育过程中长链非编码RNA的差异表达分析

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中国农业科学 2018年第18期51卷 3600-3613页

作者：郭睿耿四海熊翠玲郑燕珍付中民王海朋杜宇童新宇赵红霞陈大福福建农林大学蜂学学院广东省生物资源应用研究所

【目的】长链非编码RNA(lncRNA)在真核生物的基因表达、表观遗传和细胞周期调控等方面发挥重要功能。本研究旨在探究意大利蜜蜂(Apis mellifera ligustica,简称意蜂)工蜂中肠发育过程中lncRNA的表达谱及其作用。【方法】利用RNA-seq技... 详细信息

【目的】长链非编码RNA(lncRNA)在真核生物的基因表达、表观遗传和细胞周期调控等方面发挥重要功能。本研究旨在探究意大利蜜蜂(Apis mellifera ligustica,简称意蜂)工蜂中肠发育过程中lncRNA的表达谱及其作用。【方法】利用RNA-seq技术和链特异性建库方法对意蜂7和10日龄工蜂中肠(Am7、Am10)进行深度测序,下机的原始数据经过Perl脚本过滤得到高质量有效读段。利用bowtie工具将有效读段比对核糖体数据库,进一步利用Top Hat2软件将未比对到核糖体数据库上的数据比对到参考基因组。利用CPC和CNCI软件对转录本的编码能力进行预测。通过RT-PCR对部分lncRNA进行鉴定。利用edgeR软件进行差异表达lncRNA(DElncRNA)分析,进而预测lncRNA的上下游基因,并对上下游基因进行GO及KEGG代谢通路富集分析。联用RNAhybrid、Miranda和Target Scan软件预测DElncRNA靶向结合的mi RNA及mi RNA靶向结合的靶基因,并通过Cytoscape软件构建DElncRNAs-mi RNAs-m RNAs的调控网络。最后,通过RT-qPCR验证测序数据的可靠性。【结果】Am7和Am10的深度测序分别获得134 802 058和147 051 470条原始读段,经严格过滤分别得到134 166 157和146 293 288条有效读段;共得到3 890个DElncRNA,包括2 005个上调lncRNA与1 885个下调lncRNA。RT-PCR验证结果显示共有8个lncRNA能扩增出符合预期的目的片段,表明预测出的lncRNA真实存在。DElncRNA的上下游基因数为1 793个,它们涉及42个GO条目,包括代谢进程、发育进程、细胞进程、应激反应和免疫系统进程等;这些上下游基因还涉及251条代谢通路,包括碳代谢、嘌呤代谢和脂肪酸的生物合成等物质代谢通路,硫代谢、甲烷代谢和氧化磷酸化等能量代谢通路,Hippo信号通路、Wnt信号通路和Notch信号通路等信号通路,溶酶体、内吞作用和泛素介导的蛋白水解等细胞免疫通路,以及MAPK信号通路、Jak-STAT信号通路和NF-kappa B信号通路等体液免疫通路,上述结果表明DElncRNA在意蜂中肠发育过程中参与物质和能量代谢、细胞生命活动和免疫调控。进一步分析发现TCONS0020918可通过调控西方蜜蜂王浆主蛋白1编码基因在意蜂工蜂中肠的营养吸收、级型分化中发挥功能。DElncRNA的调控网络分析结果显示DElncRNA与mi RNA、m RNA间存在复杂的调控关系,部分DElncRNA处于调控网络的中心位置且能靶向结合较多的mi RNA,也有部分mi RNA可被多个DElncRNA共同靶向,表明这些DElncRNA可能在中肠发育中发挥重要作用。随机挑取5个DElncRNA进行RT-qPCR验证,结果显示它们的表达量变化趋势与测序结果一致,证实了本研究测序数据的可靠性。【结论】差异表达长链非编码RNA(DElncRNA)广泛参与意蜂工蜂中肠的新陈代谢、细胞活动和免疫调控并作为竞争性内源RNA(ce RNA)发挥作用,研究结果为关键lncRNA的筛选和功能研究提供了必要的数据支持。

关键词：意大利蜜蜂中肠发育长链非编码RNA 上下游基因

意大利蜜蜂幼虫肠道在球囊菌侵染前期的差异表达microRNA及其调控网络

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中国农业科学 2019年第1期52卷 166-180页

作者：郭睿杜宇童新宇熊翠玲郑燕珍徐国钧王海朋耿四海周丁丁郭意龙吴素珍陈大福福建农林大学蜂学学院

【目的】微小RNA(microRNA,miRNA)是一类重要的基因表达调控因子,可影响宿主与病原间的互作过程。蜜蜂球囊菌(Ascosphaera apis)是一种特异性侵染蜜蜂幼虫的致死性真菌病原。本研究旨在对意大利蜜蜂(Apis mellifera ligustica,简称意蜂... 详细信息

【目的】微小RNA(microRNA,miRNA)是一类重要的基因表达调控因子,可影响宿主与病原间的互作过程。蜜蜂球囊菌(Ascosphaera apis)是一种特异性侵染蜜蜂幼虫的致死性真菌病原。本研究旨在对意大利蜜蜂(Apis mellifera ligustica,简称意蜂)幼虫肠道在球囊菌胁迫前期的差异表达miRNA(differentially expressed miRNA,DEmiRNA)及其靶基因进行深入分析,在miRNA组学水平探究意蜂幼虫在球囊菌侵染前期的胁迫应答,并通过构建显著DEmiRNA的调控网络筛选出与宿主应答相关的关键miRNA。【方法】利用small RNA-seq(sRNA-seq)技术对正常及球囊菌侵染的意蜂4日龄幼虫肠道(AmCK和AmT)进行高通量测序,首先对原始数据进行质控和评估,随后将过滤后的数据与西方蜜蜂(Apis mellifera)参考基因组进行比对;将比对上的序列标签(tags)注释到miRBase数据库,得出已知miRNA的表达量;通过TPM(tags per million)算法对各样本中miRNA的表达量进行归一化处理,以|logfold change|≥1且P≤0.05作为标准筛选得到显著DEmiRNA;利用TargetFinder软件预测显著DEmiRNA的靶基因,并对其进行GO和KEGG代谢通路(pathway)富集分析。利用Cytoscape软件对miRNA-mRNA调控网络进行可视化。最后,利用茎环反转录PCR(Stem-loop RT-PCR)和荧光定量PCR(qPCR)验证测序数据的可靠性。【结果】AmCK和AmT样品的测序分别得到13 553 302和10 777 534条原始读段(raw reads),经严格过滤后得到的有效读段(clean reads)数分别为13 186 921和10 480 913条。各样品的生物学重复间的Pearson相关性系数分别在0.9822和0.9508以上。共有10个显著DEmiRNA,包括4个上调miRNA和6个下调miRNA。显著DEmiRNA在AmT的整体表达水平低于AmCK。10个显著DEmiRNA可靶向结合3 788个靶基因,其中上调miRNA的1 240个靶基因可注释到GO数据库中的39个GO条目,主要富集在结合、细胞进程、代谢进程和应激反应等;下调miRNA的749个靶基因可注释到34个GO条目,主要富集在细胞进程、结合、代谢进程和应激反应等。KEGG数据库注释结果显示,上调miRNA和下调miRNA的靶基因分别注释到95和66条代谢通路,富集基因数最多的分别是Wnt信号通路、Hippo信号通路、光传导以及内吞作用、磷脂酰肌醇信号系统、嘌呤代谢。对于上调和下调miRNA,分别有31和52个靶基因注释到内吞作用,15和7个靶基因注释到泛素介导的蛋白水解,11和5个靶基因注释到Jak-STAT信号通路,1和3个靶基因注释到MAPK信号通路。显著DEmiRNA与靶mRNA之间形成复杂的调控网络,7个显著DEmiRNA靶向结合96个与Wnt信号通路相关的mRNA,8个显著DEmiRNA靶向结合55个与内吞作用相关的mRNA。Stem-loop RT-PCR和qPCR结果验证了测序数据的可靠性。【结论】对意蜂幼虫肠道在球囊菌侵染前期的DEmiRNA及其靶基因进行预测和分析,并构建和分析了DEmiRNA-mRNA调控网络,研究结果提供了宿主miRNA的表达谱和差异表达信息,揭示了DEmiRNA通过调控细胞生命活动、新陈代谢以及部分细胞和体液免疫等生物学过程参与宿主的胁迫应答。miR-4331-y、miR-4968-y、miR-8440-y、novel-m0023-5p和novel-m0025-3p共同参与了宿主的Wnt信号通路和内吞作用的调控,可作为白垩病治疗的潜在分子靶标。

关键词：意大利蜜蜂幼虫肠道发育差异表达微小RNA 调控网络

意大利蜜蜂工蜂中肠发育过程中的差异表达环状RNA及其调控网络分析

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中国农业科学 2018年第23期51卷 4575-4590页

作者：郭睿陈华枝熊翠玲郑燕珍付中民徐国钧杜宇王海朋耿四海周丁丁刘思亚陈大福福建农林大学蜂学学院

【目的】环状RNA(circular RNA,circRNA)在可变剪接、转录调控和来源基因的表达调控等方面具有重要功能。本研究旨在探究意大利蜜蜂(Apis mellifera ligustica,简称意蜂)工蜂中肠发育过程中circRNA的表达谱及其发育过程中的差异表达circ... 详细信息

【目的】环状RNA(circular RNA,circRNA)在可变剪接、转录调控和来源基因的表达调控等方面具有重要功能。本研究旨在探究意大利蜜蜂(Apis mellifera ligustica,简称意蜂)工蜂中肠发育过程中circRNA的表达谱及其发育过程中的差异表达circRNA(differentially expressed circRNA,DEcircRNA),进而在转录组水平探究DEcircRNA在中肠发育中的作用。【方法】基于前期获得的意蜂7和10日龄工蜂中肠样品(Am7和Am10)的全转录组数据,利用findirc软件从质控后的数据中预测circRNA。采用RPM算法归一化处理得到circ RNA的表达量。利用DEGseq软件对circ RNA进行差异分析,按照差异倍数(fold change)≥2、P<0.05及错误发现率(false discovery rate,FDR)<0.05条件筛选DEcircRNA。通过BLAST比对GO和KEGG数据库,对DEcircRNA的来源基因进行功能和代谢通路注释。利用TargetFinder软件预测DEcircRNA-miRNA及DEcircRNA-miRNA-mRNA调控网络,通过Cytoscape v.3.2.1软件对调控网络进行可视化。通过实时荧光定量PCR(RT-qPCR)验证测序数据的可靠性。【结果】意蜂中肠各样品比对上参考基因组的短序列读段数平均为19 616 356条。Am7与Am10的组内Pearson相关系数均≥0.950。共预测出256个DEcircRNA,包括105个上调circRNA和151个下调circRNA。Novelirc09675和novelirc13879分别在Am7和Am10中高量表达。DEcircRNA的来源基因可注释到包括结合、单组织进程及细胞进程在内的32个GO条目,其中分别有35、35和7个来源基因注释到催化活性、代谢进程和应激反应。上述来源基因还可注释到35条KEGG代谢通路,其中分别有5、5和4个来源基因注释到Hippo信号通路、内吞作用和吞噬体;进一步分析发现分别有1、2和2个来源基因注释到磷酸肌醇代谢、淀粉和蔗糖代谢和半乳糖代谢等物质代谢通路,5、4、3、1和1个来源基因注释到内吞作用、吞噬体、溶酶体、泛素介导的蛋白水解和MAPK信号通路等免疫通路。上述结果表明相应的DEcircRNA广泛参与意蜂工蜂中肠的生长发育、新陈代谢和免疫防御。DEcircRNA-miRNA调控网络分析结果显示,141个DEcirc RNA可靶向结合107个mi RNA,其中多数仅能结合1—2个mi RNA,但novelirc11577和novelirc10719结合的靶miRNA数可达32和28个;此外,mir-136-y、ame-miR-6001-3p及mir-136-y结合的circRNA数最多,分别为15、14和14个,表明相应的DEcircRNA可作为竞争性内源RNA在意蜂中肠发育过程发挥作用。进一步构建DEcircRNAs-ame-miR-6001-3p-mRNA调控网络,分析结果显示14个DEcircRNA可共同靶向结合ame-miR-6001-3p,表明它们可能通过调控ame-miR-6001-3p对意蜂中肠干细胞的分裂和分化进行间接调控。随机选取6个DEcircRNA进行RT-qPCR验证,结果显示5个DEcircRNA的表达量变化趋势与测序结果一致,证实了本研究测序结果的可靠性。【结论】通过对意蜂工蜂中肠发育过程中的DEcircRNA深入分析,提供了circRNA在意蜂工蜂中肠发育过程中的表达谱和差异表达信息,揭示了DEcircRNA在中肠发育过程中的作用,为中肠发育相关的关键circRNA的筛选和功能研究打下了基础。

关键词：意大利蜜蜂中肠环状RNA 调控网络发育

中华蜜蜂工蜂中肠响应东方蜜蜂微孢子虫胁迫的高表达基因分析

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四川大学学报（自然科学版） 2020年第1期57卷 191-198页

作者：付中民周丁丁陈华枝耿四海陈大福郑燕珍熊翠玲徐国钧张曦郭睿福建农林大学动物科学学院蜂学学院福州350002 枣庄职业学院枣庄277100

为探究高表达基因(highly expressed gene,HEG)在中华蜜蜂(Apis cerana cerana,简称中蜂)工蜂中肠响应东方蜜蜂微孢子虫(Nosema ceranae)胁迫过程的表达谱及作用,利用RNA-seq技术对正常中蜂工蜂中肠(Ac7CK和Ac10CK)及N.ceranae胁迫7 d和10 d的中肠(Ac7T和Ac10T)进行深度测序、生物信息学分析和分子生物学验证.共测得1809736786条raw reads,经质控得到1562162742条clean reads.Ac7CK、Ac7T、Ac10CK和Ac10T的共有HEG为2074个,特有HEG分别为89、283、156和78个.Ac7T和Ac10T的特有HEG分别涉及35和28个功能条目,以及39和37条代谢通路.RT-PCR结果证实了8个共有HEG的真实表达.上述结果表明,宿主的物质和能量代谢、细胞和体液免疫均受到不同程度的激活,二者间存在密切的相互作用.研究结果解析了中蜂工蜂中肠响应N.ceranae胁迫的HEG表达谱及潜在作用.

关键词：中华蜜蜂高表达基因东方蜜蜂微孢子虫中肠胁迫

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意大利蜜蜂幼虫肠道发育过程中的差异表达microRNA及其调控网络

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中国农业科学 2018年第21期51卷 4197-4209页

作者：郭睿杜宇熊翠玲郑燕珍付中民徐国钧王海朋陈华枝耿四海周丁丁石彩云赵红霞陈大福福建农林大学蜂学学院广东省生物资源应用研究所

【目的】微小RNA(microRNA,miRNA)是一类在转录后水平对mRNA进行负调控的关键调控因子。本研究旨在通过分析意大利蜜蜂(Apis mellifera ligustica,简称意蜂)幼虫肠道发育过程中差异表达miRNA(differentially expressed miRNA,DEmiRNA)及其调控网络,提供miRNA的表达谱和差异表达信息,揭示DEmiRNA在幼虫肠道发育中的作用。【方法】利用small RNA-seq(sRNA-seq)技术对意蜂4、5和6日龄幼虫肠道样品(Am4、Am5和Am6)进行测序,将质控后的数据与西方蜜蜂(Apis mellifera)参考基因组进行比对,然后将比对上的序列标签(tags)注释到miRBase数据库,并利用TPM(tags per million)算法归一化处理所得miRNA的表达量,再通过相关生物信息学软件对miRNA进行表达量聚类、前体二级结构预测及差异表达分析。利用TargetFinder软件预测DEmiRNA的靶基因,使用Blast软件对靶基因进行GO和KEGG数据库注释,进而通过Cytoscape软件构建mi RNA-m RNA的调控网络。采用茎环实时荧光定量PCR(Stem-loop RT-qPCR)验证测序数据的可靠性。【结果】意蜂幼虫肠道样品的测序分别得到10 841 644、12 037 678和9 230 496条有效序列标签;Am4 vs Am5比较组包含16个上调和10个下调mi RNA,Am5 vs Am6比较组包含5个上调和7个下调mi RNA。其中,novel-m0031-3p为两个比较组所共有,并结合5个与蜕皮激素诱导蛋白相关的靶基因;二者的特有DEmi RNA数分别为25和11个。Am4 vs Am5的26个DEmi RNA结合5 742个靶基因,其中2 725个靶基因可注释到GO数据库中的46个GO term,并主要富集在结合、细胞进程、代谢进程和单组织进程等;Am5 vs Am6的12个DEmi RNA结合3 733个靶基因,且其中2 725个靶基因富集在结合、细胞进程、单组织进程和代谢进程等41个GO term;此外,两个比较组中的DEmi RNA分别有1 046和676个靶基因可注释到116和92条KEGG代谢通路,且Am4 vs Am5比较组的DEmi RNA的靶基因富集在Wnt信号通路、Hippo信号通路、嘌呤代谢和内吞作用等通路上的数量均高于Am5 vs Am6比较组。进一步分析结果显示Am4 vs Am5中的上调和下调mi RNA可分别结合611和85个靶基因,其中ame-mi R-6052结合的靶基因数最多,可通过结合5个靶基因,参与对细胞色素P450的调控;mi R-281-x结合49个靶基因,并间接调控组氨酸代谢、TGF-β信号通路以及Hippo信号通路;Am5 vs Am6中的上调和下调mi RNA可分别结合43和431个靶基因,其中mi R-iab-4-x结合靶基因数量最多,并广泛参与调控背腹轴的形成、Hippo信号通路、Wnt信号通路、Fox O信号通路、Notch信号通路以及m TOR信号通路等与生长发育相关的通路。调控网络分析结果表明,DEmi RNA与靶基因间形成较为复杂的调控网络,DEmi RNA居于调控网络的中心位置,而m RNA位于调控网络的外周。最后,通过茎环实时荧光定量PCR对随机选取的3个DEmiRNA进行验证,结果证实了测序数据的可靠性。【结论】在全基因组水平对意蜂幼虫肠道的DEmi RNA及其靶基因进行预测和分析,并对DEmi RNA的调控网络进行构建及分析,发现意蜂幼虫通过调节包括ame-mi R-6052、miR-iab-4-x、mi R-281-x和novel-m0031-3p在内的多个mi RNA的表达水平对肠道生长和发育进行调控,研究结果不仅提供了意蜂肠道发育过程的mi RNA表达谱及差异表达信息,也为阐明意蜂幼虫肠道的发育机理打下基础。

关键词：意大利蜜蜂幼虫肠道发育微小RNA 靶基因调控网络

微小RNA介导东方蜜蜂微孢子虫侵染意大利蜜蜂工蜂的分子机制

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中国农业科学 2020年第15期53卷 3187-3204页

作者：耿四海石彩云范小雪王杰祝智威蒋海宾范元婵陈华枝杜宇王心蕊熊翠玲郑燕珍付中民陈大福郭睿福建农林大学动物科学学院(蜂学学院)

【目的】通过对东方蜜蜂微孢子虫(Nosema ceranae)纯化孢子与侵染意大利蜜蜂(Apis mellifera ligustica,简称意蜂)工蜂的东方蜜蜂微孢子虫的差异表达miRNA(DEmiRNA)及其靶mRNA进行系统分析,筛选、分析和探讨病原毒力因子和侵染因子相关... 详细信息

【目的】通过对东方蜜蜂微孢子虫(Nosema ceranae)纯化孢子与侵染意大利蜜蜂(Apis mellifera ligustica,简称意蜂)工蜂的东方蜜蜂微孢子虫的差异表达miRNA(DEmiRNA)及其靶mRNA进行系统分析,筛选、分析和探讨病原毒力因子和侵染因子相关的DEmiRNA及调控网络,在miRNA组学层面揭示东方蜜蜂微孢子虫对意蜂的侵染机制。【方法】利用small RNA-seq(sRNA-seq)技术对东方蜜蜂微孢子虫感染7 d和10 d的意蜂工蜂中肠和东方蜜蜂微孢子虫纯化孢子(NcCK)进行深度测序,通过连续比对rRNA数据库、西方蜜蜂(Apis mellifera)基因组和东方蜜蜂微孢子虫基因组筛滤出处于侵染过程的东方蜜蜂微孢子虫(NcT1和NcT2)数据和东方蜜蜂微孢子虫孢子的测序数据。根据P≤0.05,|log2 fold change|≥1的标准,通过比较分析筛选出各比较组中的差异表达miRNA(differentially expressed miRNA,DEmiRNA)。通过相关生物信息学软件对DEmiRNA进行表达谱分析,靶mRNA预测及功能和代谢通路注释,以及调控网络的构建与分析。通过Stem-loop RT-qPCR验证DEmiRNA的差异表达趋势及测序数据的可靠性。【结果】NcCK vs NcT1、NcCK vs NcT2和NcT1 vs NcT2比较组分别包含164、122和60个DEmiRNA。Venn分析结果显示,3个比较组共有的上调和下调miRNA分别为5和6个。上述DEmiRNA分别预测出1 885、1 733和1 524个靶mRNA。这些靶mRNA分别注释到27、25和26个功能条目,其中注释数量最多的是新陈代谢进程、催化活性、细胞进程、结合和细胞。上述靶mRNA可分别注释到84、84和84条代谢通路,其中注释数量最多的是代谢途径、核糖体和次级代谢产物生物合成。此外,对于NcCK vs NcT1、NcCK vs NcT2和NcT1 vs NcT2中的DEmiRNA,分别有35、26和12个靶向结合MAPK信号通路相关靶mRNA,分别有49、40和17个DEmiRNA靶向结合糖酵解/糖异生通路相关靶mRNA。进一步分析发现,东方蜜蜂微孢子虫的DEmiRNA参与调控蓖麻毒素B凝集素、细胞凋亡抑制因子、极管蛋白和孢壁蛋白等病原毒力因子的基因表达,以及己糖激酶、ATP/ADP移位酶、ABC转运蛋白和转录因子ste12等侵染因子的基因表达。【结论】通过对东方蜜蜂微孢子虫纯化孢子与侵染意蜂工蜂的东方蜜蜂微孢子虫进行深入细致的miRNA组学分析和探讨,解析了病原侵染过程的miRNA差异表达谱,揭示了东方蜜蜂微孢子虫可能通过调节相应miRNA的表达水平对蓖麻毒素B凝集素、细胞凋亡抑制因子、极管蛋白和孢壁蛋白等毒力因子及己糖激酶、ATP/ADP移位酶、ABC转运蛋白和转录因子ste12等侵染因子基因表达进行调控,从而适应宿主细胞内的环境并促进自身的增殖与侵染。

关键词：东方蜜蜂微孢子虫意大利蜜蜂微小RNA 侵染机制调控网络