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葛根多糖对葛根素降尿酸作用的影响及葛根饮料的研发

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葛根多糖对葛根素降尿酸作用的影响及葛根饮料的研发

作者：翟永贞华南理工大学

学位级别：硕士

高尿酸血症（Hyperuricemia,HUA）是一种由人体内嘌呤代谢紊乱而引起的血液中尿酸水平偏高的常见代谢性疾病,是慢性肾脏疾病、高血压、痛风性关节炎和代谢综合征发病机制的关键危险因素。目前,临床上常使用黄嘌呤氧化酶抑制剂或排尿剂... 详细信息

高尿酸血症（Hyperuricemia,HUA）是一种由人体内嘌呤代谢紊乱而引起的血液中尿酸水平偏高的常见代谢性疾病,是慢性肾脏疾病、高血压、痛风性关节炎和代谢综合征发病机制的关键危险因素。目前,临床上常使用黄嘌呤氧化酶抑制剂或排尿剂以降低机体尿酸水平,但长期服用这些药物会引发一系列副作用。相较而言,膳食干预是近年兴起的一种成本低廉、接受度高且副作用小的方法。实现膳食干预缓解HUA的基础是膳食活性成分具有抑制黄嘌呤氧化酶（Xanthine Oxidase,XO）活性、缓解炎症、修复肾脏组织和恢复肾脏功能等作用。葛根是药食同源的天然植物,其主要活性成分葛根素（Puerarin,PUE）具有降尿酸作用,因此,葛根是开发功能性食品的优质原料。然而,以PUE为核心的葛根膳食体系是一个复杂的多组分体系,其中PUE可能会与其他组分（如葛根多糖）发生相互作用,进而影响PUE的生理活性和生物利用度。因此,明晰膳食体系中多组分的相互作用对PUE功效特性的影响有利于进一步指导HUA患者的膳食干预。因此,本文首先采用紫外分光光度计、荧光光谱仪并结合分子模拟技术系统地探究了PUE对XO的抑制作用和分子机制,初步确定葛根素具有降尿酸作用;进一步探讨了葛根多糖（Polysaccharide from Pueraria lobata,PLP）与PUE相互作用对PUE抑制XO能力和机制的影响。基于此,以葛根为原料,研发了一种葛根饮料,并通过HUA小鼠模型评估了葛根饮料缓解HUA的机制,以期为HUA患者提供膳食干预指导。本文主要结果如下:（1）PUE具有抑制XO的能力,其半抑制浓度IC值为82.41μg/mL。采用酶促动力学、荧光猝灭和分子对接技术探究了PUE与XO结合的机制。PUE在XO上存在一个或一种结合位点,受到氢键和疏水作用的共同驱动,自发地与XO进行结合,静态猝灭XO的内源性荧光,是一种可逆的竞争型XO抑制剂,其抑制常数为25.15μg/mL。分子对接进一步表明PUE与XO活性空腔的氨基酸残基形成氢键,占据了底物进入催化中心的通道,从而抑制XO活性。（2）PLP对XO几乎没有抑制作用,但可将PUE对XO的抑制类型变为混合型抑制。FT-IR和ITC结果表明,PUE和PLP以疏水相互作用为驱动力自发地非共价结合,可减少PUE在小肠阶段的降解损失,损失率从16.47%降低至13.82%。（3）通过单因素试验、正交试验联合模糊数学感官评价法优化了葛根饮料的配方,并评价了其品质。结果表明,葛根饮料的最优配方为葛根提取液添加量为40%、三氯蔗糖添加量为0.020 g/100 mL、柠檬酸添加量为0.030 g/100 mL,其感官品质最佳。电子舌及其PCA主成分分析表明,电子舌不能有效区分葛根饮料和市售三种产品的味觉差异,葛根饮料与市售的三种产品风味相近。葛根饮料酸味及涩味的分析表明,三氯蔗糖和柠檬酸可以较好的掩蔽葛根饮料中的苦涩味,提高葛根饮料的感官风味。葛根饮料中黄酮和PUE含量分别为547.28μg/mL和144.85μg/mL。在4℃、25℃和37℃下贮藏28天后,黄酮含量分别降低至508.08μg/mL、504.93μg/mL和501.50μg/mL,较第0天分别下降了7.07%、7.89%和8.36%。葛根饮料具有较强的XO抑制能力,抑制率为25.73%。葛根饮料能通过抑制XO活性减少O自由基的生成,对酶促和非酶促体系O自由基的IC值分别为379.72μL/mL和423.06μL/mL。（4）构建氧嗪酸钾联合次黄嘌呤诱导的HUA小鼠模型,评估了葛根饮料对HUA小鼠的影响。葛根饮料从抑制尿酸生成和促进尿酸排泄两方面降低HUA小鼠尿酸水平。与模型组相比,葛根饮料0.5、1和2 g/kg/d的给药组均能显著降低HUA小鼠血液中尿酸水平,分别降低了16.42%、38.89%和59.92%,表明葛根饮料具有降尿酸作用。葛根饮料各剂量组显著抑制了HUA小鼠肝脏的XO活性,抑制率分别为13.83%、19.52%和45.75%。葛根饮料各剂量组均能显著降低了HUA小鼠血液中肌酐和尿素氮水平,恢复肾小球过滤功能。葛根饮料各剂量组均能显著降低小鼠肾脏UTAR1、GLUT9、IL-1β、IL-6和TNF-α的表达水平,抑制肾小管重吸收作用,缓解肾脏炎症。葛根饮料各剂量组均能缓解肾小球萎缩、肾小管水肿、肾小管颗粒管型、间质纤维化。本文研发了一种具有降尿酸作用的葛根饮料,以期为HUA进行膳食干预提供理论参考。

关键词：高尿酸血症黄嘌呤氧化酶葛根素葛根多糖葛根饮料

增强自噬的乙型脑炎重组DNA疫苗促进BALB/c小鼠树突状细胞功能

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中华微生物学和免疫学杂志 2021年第3期41卷 209-215页

作者：朱君瑶藏鑫翟永贞中国医科大学附属盛京医院感染科沈阳110022

目的探讨自噬介导的乙型脑炎重组DNA疫苗对BALB/c小鼠体内树突状细胞(dendritic cells,DCs)免疫相关功能的影响。方法取健康BALB/c雌性小鼠,随机分配成5组,分别用pcDNA3.1(+)空载体、pJME质粒、pJME-LC3重组质粒肌注免疫小鼠,并使用无菌... 详细信息

目的探讨自噬介导的乙型脑炎重组DNA疫苗对BALB/c小鼠体内树突状细胞(dendritic cells,DCs)免疫相关功能的影响。方法取健康BALB/c雌性小鼠,随机分配成5组,分别用pcDNA3.1(+)空载体、pJME质粒、pJME-LC3重组质粒肌注免疫小鼠,并使用无菌PBS肌注作为空白对照组,乙型脑炎减毒活疫苗腹腔注射作为阳性对照组,免疫注射共3次,每次间隔2周,末次免疫2周后无菌取小鼠脾脏,研磨后从单细胞悬液中分离DCs,使用免疫荧光技术观察重组质粒在DCs中的表达水平;利用流式细胞术检测DCs表面主要组织相容性复合体Ⅱ(major histocompatibility complex Ⅱ,MHCⅡ)的表达水平以及小鼠脾脏DCs摄取FITC-Dextran后的平均荧光强度;CCK8法检测分析不同免疫组DCs对同种异体小鼠脾脏淋巴细胞的刺激增殖效果。结果相对于其他免疫组,pJME-LC3实验组大量DCs胞质中可见质粒编码蛋白表达;pJME-LC3实验组免疫鼠脾脏DCs摄取FITC-Dextran的能力明显强于其他免疫组(P<0.05);pJME-LC3组小鼠成熟DCs表面MHCⅡ分子的表达水平明显升高(P<0.05);进一步研究发现pJME-LC3组小鼠脾脏DCs对同种异体小鼠脾脏淋巴细胞刺激增殖能力高于其他免疫组(P<0.05)。结论pJME-LC3重组质粒可以促进免疫鼠脾脏DCs抗原提呈以及刺激淋巴细胞增殖的能力,提示自噬介导的乙型脑炎重组DNA疫苗可能通过影响BALB/c小鼠DCs功能促进免疫效应。

关键词：乙型脑炎 DNA疫苗树突状细胞自噬

肝衰竭的营养代谢异常与营养支持治疗的研究进展

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世界华人消化杂志 2012年第23期20卷 2167-2172页

作者：王岩翟永贞冯国和中国医科大学附属盛京医院感染科辽宁省沈阳市110004

营养和代谢损害是严重肝病的重要表现,并已成为影响患者预后的明确危险因素.本文对肝衰竭患者的营养代谢异常与营养支持治疗作一综述,总结了肝脏疾病营养代谢状况评价的指标,以及肝衰竭患者营养物质及能量代谢特点,指出利用CCM-D营养代... 详细信息

营养和代谢损害是严重肝病的重要表现,并已成为影响患者预后的明确危险因素.本文对肝衰竭患者的营养代谢异常与营养支持治疗作一综述,总结了肝脏疾病营养代谢状况评价的指标,以及肝衰竭患者营养物质及能量代谢特点,指出利用CCM-D营养代谢测试系统可以测定肝衰竭患者的静息能量消耗,慢性肝衰竭患者能量供给以脂肪氧化为主、呼吸商明显低于预测值,并进一步讨论了不同阶段肝衰竭营养支持干预的方式及摄入量等.目的在于提高临床医师对肝衰竭患者营养代谢异常的认知程度,制定个体化的营养支持治疗,从而为提高肝衰竭的抢救成功率、改善患者的中远期预后提供条件.

关键词：营养治疗能量代谢静息能量消耗呼吸商肝衰竭

GM-CSF基因增强HCV核心蛋白基因DNA疫苗的免疫应答

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世界华人消化杂志 2012年第35期20卷 3424-3430页

作者：翟永贞王岩冯国和中国医科大学附属盛京医院感染科辽宁省沈阳市110004

目的:研究粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor,GM-CSF)编码基因对丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)核心(core,C)蛋白编码基因重组质粒诱导的免疫应答有无增强作用.方法:人工合成HCV核心蛋白基因至克隆载体pUC 119上,酶切后与真核表达质粒pCMH6K连接,测序正确后将重组质粒pCMH6K/HCV-C转染中华仓鼠卵巢(China hamster ovary,CHO)细胞.免疫荧光检测转染的CHO细胞中HCVC蛋白分布与表达.将已构建成功的GM-CSF编码基因重组子(pGM-CSF)联合pCMH6K/HCV-C肌注免疫Balb/c鼠,ELISA法检测免疫小鼠血清抗HCV C特异性抗体水平,经流式细胞仪检测不同免疫原免疫鼠后脾T淋巴细胞亚群及Th细胞内细胞因子[干扰素-(interferon-,IFN-)、白介素-4(interleukin-4,IL-4)]变化,LDH法测定CTL活性.结果:pCMH6K/HCV-C经鉴定构建正确.所编码的蛋白主要分布于胞膜,少量分布于胞浆.pGM-CSF+pCMH6K/HCV-C联合免疫组和pCMH6K/HCV-C单独免疫组均产生抗HCVC特异性抗体,两组间比较差异无统计学意义;联合免疫组CD4+T淋巴细胞比例为44.90%±5.99%,明显高于其他组(P0.05).联合免疫组CTL活性为56.48%±4.68%,明显高于其他组(P<0.05).联合免疫组IFN-/IL-4比值为18.20±2.36,明显高于其他组(P<0.05).结论:GM-CSF编码基因可增强HCV C基因DNA疫苗的细胞免疫应答,并能够诱导Th1型免疫应答.

关键词：丙型肝炎病毒核心蛋白 DNA疫苗粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子

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细胞自噬参与病毒免疫关键环节

中国免疫学杂志 2020年第10期36卷 1271-1274,1278页

作者：朱君瑶翟永贞中国医科大学附属盛京医院感染科沈阳110004

细胞自噬作为哺乳动物细胞内的一个具有高度保守性的活动过程,是维持细胞稳态的基本代谢活动,也是细胞面临不利条件时确保细胞自身生存的重要手段。面对病毒的入侵,根据病毒种类、细胞种类以及细胞应激反应的不同,自噬既可以发挥抗病毒... 详细信息

细胞自噬作为哺乳动物细胞内的一个具有高度保守性的活动过程,是维持细胞稳态的基本代谢活动,也是细胞面临不利条件时确保细胞自身生存的重要手段。面对病毒的入侵,根据病毒种类、细胞种类以及细胞应激反应的不同,自噬既可以发挥抗病毒作用,也可能会被病毒利用。因此,了解自噬在病毒免疫过程中发挥的作用对于发展新型抗病毒治疗和预防有着重要的意义。在此基础上,本文旨在介绍自噬参与的病毒免疫环节来探讨自噬的抗病毒免疫作用。

关键词：自噬病毒感染病毒免疫

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血清前白蛋白对肝功能评估的研究进展

世界华人消化杂志 2013年第15期21卷 1387-1393页

作者：韦丽娅翟永贞冯国和中国医科大学附属盛京医院感染科辽宁省沈阳市110022

血清前白蛋白(prealbumin,PA)主要由肝脏合成,可反映肝脏合成及储备能力及营养状况,具有检测方便、准确、干扰因素少等优点.长期以来由于一直把血清PA以独立因素作为肝脏功能状态的评价指标,缺乏以一种系统、关联、前瞻的临床思维方法... 详细信息

血清前白蛋白(prealbumin,PA)主要由肝脏合成,可反映肝脏合成及储备能力及营养状况,具有检测方便、准确、干扰因素少等优点.长期以来由于一直把血清PA以独立因素作为肝脏功能状态的评价指标,缺乏以一种系统、关联、前瞻的临床思维方法去分析血清PA,虽然临床应用由来已久,但是广大临床医生在肝病的诊治过程中仍不足以重视血清PA的变化特点,作者结合近年来对血清PA生化特性、结构、功能新变化以及与血清白蛋白、胆固醇、胆碱酯酶、总胆汁酸、凝血酶原时间、肝功能评分及终末期肝病模型评分系统等指标相关性研究作一综述.

关键词：血清前白蛋白肝功能评估肝功能Child—Turcotte—Pugh 终末期肝病模型

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输入性恶性疟疾1例报告并文献复习

中国实用内科杂志 2013年第11期33卷 904-906页

作者：王岩张琳韩冰翟永贞冯国和中国医科大学附属盛京医院感染科沈阳110004

疟疾（malaria）是一个严重的公共卫生问题，在我国以间日疟为主，随着与疟疾特别是恶性疟疾流行国家和地区的交流活动增加，罹患输入性恶性疟疾的几率也增大，其临床表现复杂多样，极易造成误诊或漏诊而延误治疗。近几年来辽宁省也有... 详细信息

疟疾（malaria）是一个严重的公共卫生问题，在我国以间日疟为主，随着与疟疾特别是恶性疟疾流行国家和地区的交流活动增加，罹患输入性恶性疟疾的几率也增大，其临床表现复杂多样，极易造成误诊或漏诊而延误治疗。近几年来辽宁省也有输人性疟疾的散发发病，但凶险型疟疾的诊治尚未有报道，本文报道我科收治的1例我省重症输人性恶性疟疾患者，并复习相关文献及分析诊治体会。

关键词：疟疾,恶性溶血尿毒综合征床旁血液滤过

壳聚糖-pJME/GM-CSF纳米DNA疫苗肌注BALB/c鼠诱导细胞免疫效应的研究

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病毒学报 2014年第4期30卷 423-428页

作者：翟永贞周言马力冯国和中国医科大学附属盛京医院感染科沈阳市110004

探讨载有日本脑炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)prME蛋白与粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor,GM-CSF)编码基因重组子(命名为pJME/GM-CSF)的壳聚糖纳米颗粒的免疫佐剂效应及其机制。本研究采用复凝聚法制备壳聚糖-pJME/GM-CSF纳米颗粒;免疫组化法检测肌肉注射部位浸润细胞的类型,流式细胞仪检测不同免疫原免疫鼠后脾脏DC表型和功能的变化;乳酸脱氢酶释放法检测CTL活性。结果显示制备的壳聚糖-pJME/GM-CSF纳米颗粒鉴定正确;pJME/GM-CSF募集包括非成熟树突状细胞、巨噬细胞、粒细胞到注射部位,增加脾脏树突状细胞表面MHCII的表达,抗原摄取和递呈功能,增强疫苗诱导的细胞免疫反应,壳聚糖-pJME/GM-CSF纳米颗粒可进一步扩大pJME/GM-CSF的上述作用。这些结果表明壳聚糖可作为DNA疫苗肌注免疫时的传送载体,能够增强pJME/GM-CSF疫苗的细胞免疫应答。

关键词：脑炎病毒,日本壳聚糖 GM-CSF 树突状细胞纳米颗粒 T淋巴细胞细胞毒性T淋巴细胞

ICAM-1编码基因对乙型脑炎DNA疫苗树突状细胞功能的影响

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中国免疫学杂志 2013年第2期29卷 148-153,167页

作者：翟永贞马力冯国和中国医科大学附属盛京医院感染科沈阳110004

目的:研究细胞间粘附分子1(ICAM-1)编码基因对日本脑炎(JE)DNA疫苗脾脏树突状细胞功能的影响。方法:套式RT-PCR法获取BALB/c鼠ICAM-1编码基因,构建重组子pJME/ICAM-1和pICAM-1,脂质体法转染上述质粒于CHO细胞,Western blot法检测转染的... 详细信息

目的:研究细胞间粘附分子1(ICAM-1)编码基因对日本脑炎(JE)DNA疫苗脾脏树突状细胞功能的影响。方法:套式RT-PCR法获取BALB/c鼠ICAM-1编码基因,构建重组子pJME/ICAM-1和pICAM-1,脂质体法转染上述质粒于CHO细胞,Western blot法检测转染的CHO细胞中目的蛋白表达。实验分5组,包括:pJME/ICAM-1、pJME+PICAM-1、pJME、JE灭活疫苗和pcDNA3.1(+)免疫组,以不同免疫原肌注免疫BALB/c小鼠,流式细胞仪检测经不同免疫原免疫鼠后脾脏DC表型、抗原吞噬功能以及混合淋巴细胞反应。结果:融合表达重组质粒pJME/ICAM-1和单质粒pICAM-1经鉴定构建正确。pJME/ICAM-1组CD11c+CD86+DC和CD11c+ICAM-1+DC比例分别为(6.92±1.40)%、(7.18±0.57)%,高于其它免疫组(均P0.05);pJME/ICAM-1与pJME+pICAM-1组内吞能力明显增强,平均荧光强度分别为437.11±47.60、416.67±29.12,显著高于其它组(P<0.05)。比较不同免疫原对细胞分裂的作用,以pJME/ICAM-1组最强,(73.69±7.32)%CD4+T细胞发生分裂,(45.40±2.57)%CD8+T细胞发生分裂,显著高于对照组(P<0.05)。结论:ICAM-1编码基因能够促进JE DNA疫苗脾脏树突状细胞的成熟,能够提供独立或放大B7分子的协同刺激信号。

关键词：脑炎,日本 DNA疫苗细胞间粘附分子1 树突状细胞共刺激分子