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猪流行性腹泻病毒锁核酸探针荧光定量PCR检测方法的建立

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广东畜牧兽医科技 2024年第2期49卷 30-36页

作者：李艳卞志标翟少伦李春玲广东省农业科学院动物卫生研究所/广东省畜禽疫病防治研究重点实验室/农业农村部兽用药物与诊断技术广东科学观测实验站广东广州510640 岭南现代农业科学与技术广东省实验室茂名分中心广东茂名525000

为建立一种快速、灵敏的猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)早期痕量检测方法,该研究以PEDV的M基因为靶基因,设计了特异性引物和锁核酸(Locked Nucleic Acid,LNA)-TaqMan探针,经过条件优化,建立了基于LNA-TaqMan... 详细信息

为建立一种快速、灵敏的猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)早期痕量检测方法,该研究以PEDV的M基因为靶基因,设计了特异性引物和锁核酸(Locked Nucleic Acid,LNA)-TaqMan探针,经过条件优化,建立了基于LNA-TaqMan探针的PEDV荧光定量PCR方法,并与常规TaqMan探针法进行了比对。结果显示,所建立的PEDV的LNA-Taq-Man探针荧光定量PCR方法最低检测限为3.2拷贝/微升,较常规TaqMan探针法提高了10倍;与猪传染性胃肠炎病毒、猪轮状病毒和猪德尔塔冠状病毒等多种病原不存在交叉反应,特异性良好;批内和批间重复性结果的变异系数均小于1%,重复性较好。应用该方法对103份临床样品进行检测,结果显示,共检出PEDV阳性样品47份,阳性率45.63%,与常规TaqMan探针法检测结果的阳性符合率为90.38%。本研究建立的基于LNA-TaqMan探针的荧光定量PCR方法为PEDV的精准检测和流行病学调查提供了一种新的技术选择。

关键词：猪流行性腹泻病毒 M基因 LNA-TaqMan探针荧光定量PCR

一株具有高病毒载量PCV2毒株的基因组特征及序列分析

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广东农业科学 2024年

作者：常鑫蒋智勇卞志标徐民生杨冬霞杨傲冰翟少伦广东省农业科学院动物卫生研究所/广东省畜禽疫病防治研究重点实验室/农业部兽用药物与诊断技术广东科学观测实验站仲恺农业工程学院动物科技学院广东永顺生物制药股份有限公司

【目的】了解广东省某猪群中猪圆环病毒2型（Porcine circovirus type 2，PCV2）流行毒株的遗传进化情况，丰富PCV2分子流行病学数据。【方法】使用qPCR方法对疑似PCV2的样品进行检测，检测到了1株具有高病毒载量的PCV2毒株，命名为GD22... 详细信息

【目的】了解广东省某猪群中猪圆环病毒2型（Porcine circovirus type 2，PCV2）流行毒株的遗传进化情况，丰富PCV2分子流行病学数据。【方法】使用qPCR方法对疑似PCV2的样品进行检测，检测到了1株具有高病毒载量的PCV2毒株，命名为GD222858。使用PCR方法进行全基因组分子克隆及遗传进化分析。使用MegAlign软件将该毒株ORF1、ORF2基因编码的氨基酸序列与PCV2同亚型参考毒株进行比对，分析氨基酸序列的相似性；DNAStar中的Protean程序预测该毒株的Cap蛋白二级结构及B细胞表位，并与四株疫苗株DBN-SX07-2(HM641752)、LG(HM038034)、SH(HM038027)、ZJ(AY686764)的Cap蛋白抗原指数进行比对分析。【结果】测序结果显示GD222858毒株基因组长度为1767bp。遗传进化树表明该毒株属于PCV2d亚型。与国内外82株参考毒株的核苷酸相似性在91.4%-99.6%，与越南毒株Han8（GenBank登录号：JQ181600）的亲缘关系最近。ORF1编码的Rep蛋白处发现多个特异性突变位点F70Y、F77L、W202R、N256S；ORF2编码的Cap蛋白相对保守。Protean预测Cap蛋白的氨基酸第5-18、24-25、39-41、48-49、57-65、99、101、112-114、139-140、145-150、162-165、175-181、188-189、205-211、227-232位置处均可能存在潜在B细胞表位。GD222858毒株的Cap蛋白抗原指数与4株疫苗株均有差异，在氨基酸45-57、124-132、223-233位置处抗原指数明显高于其它四株疫苗株，且与疫苗株LG（HM038034）差异最大。【结论】该高病毒载量的PCV2毒株为PCV2d亚型，ORF1编码的Rep蛋白处发现多个特异性突变位点F70Y、F77L、W202R、N256S；ORF2编码的Cap蛋白相对保守；B细胞表位处未发现特异性突变；GD222858的Cap蛋白抗原指数分析显示该地区流行毒株与疫苗株LG差异过大。

关键词：猪圆环病毒2型(PCV2) 遗传进化分析 ORF1基因 ORF2基因 B细胞表位抗原指数

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猪博卡病毒的研究进展

病毒学报 2012年第2期28卷 190-193页

作者：翟少伦陈胜男魏文康广东省农业科学院兽医研究所广州510640

猪博卡病毒是细小病毒科细小病毒亚科博卡病毒属的新成员,2009年发现于患仔猪断奶后多系统衰竭综合征的瑞典猪群中。目前,猪博卡病毒作为新发现的病原,已是世界各国科研人员的研究热点。本文结合已发表的文献,对猪博卡病毒的发现、分类... 详细信息

猪博卡病毒是细小病毒科细小病毒亚科博卡病毒属的新成员,2009年发现于患仔猪断奶后多系统衰竭综合征的瑞典猪群中。目前,猪博卡病毒作为新发现的病原,已是世界各国科研人员的研究热点。本文结合已发表的文献,对猪博卡病毒的发现、分类、基因组结构与复制、流行病学、与疾病的相关性、培养与检测等方面进行了阐述,为广大科研人员对猪博卡病毒的研究提供一定的理论依据。

关键词：猪博卡病毒新发病原细小病毒

2型猪链球菌脑膜炎小鼠模型的构建及其转录组学分析

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微生物学通报 2023年第12期50卷 5413-5426页

作者：施科达臧莹安李艳翟少伦徐民生刘凯李春玲仲恺农业工程学院动物科技学院广东广州510225 广东省农业科学院动物卫生研究所广东省畜禽疫病防治研究重点实验室农业农村部兽用药物与诊断技术广东科学观测实验站广东广州510640 汕尾市金瑞丰生态农业有限公司广东汕尾516400

【背景】2型猪链球菌(Streptococcus suis serotype 2,S.suis 2)可感染宿主引起严重的脑膜炎,对养猪业和人类公共卫生安全构成重大威胁。【目的】构建S.suis 2感染小鼠脑膜炎模型,并对其脑组织进行转录组学分析,为揭示S.suis 2感染宿主... 详细信息

【背景】2型猪链球菌(Streptococcus suis serotype 2,S.suis 2)可感染宿主引起严重的脑膜炎,对养猪业和人类公共卫生安全构成重大威胁。【目的】构建S.suis 2感染小鼠脑膜炎模型,并对其脑组织进行转录组学分析,为揭示S.suis 2感染宿主后引起脑膜炎的分子机制和发现潜在的治疗靶点提供理论依据。【方法】采用S.suis 2感染小鼠,并对其脑组织进行病理组织学分析确认构建脑膜炎小鼠后,对其脑组织进行转录组学分析,对比S.suis 2感染和未感染小鼠的差异表达基因,并对差异表达基因进行基因本体论(gene ontology,GO)功能、京都基因和基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)通路富集和韦恩分析。【结果】脑病理组织学分析结果显示,S.suis 2感染的小鼠脑膜中有大量的炎症细胞浸润,并且血管周围出现“袖套”现象,并能从感染小鼠的组织器官中再分离出攻毒的S.suis 2菌株,结果证明构建了S.suis 2感染脑膜炎小鼠模型。转录组学分析结果表明,感染S.suis 2与未感染的小鼠相比,存在397条差异表达基因,其中109个基因表达水平下调,288个基因表达水平上调。GO功能富集分析表明,差异表达基因主要富集于细胞成分功能中的细胞质和细胞质膜,生物过程功能中的信号传导、转录调控、凋亡过程、系统免疫和对细菌的应答,以及分子功能中的蛋白结合。KEGG通路富集分析表明差异表达基因主要富集于多个重要的信号通路,包括细胞因子-细胞因子受体相互作用、免疫应答相关通路、凋亡通路、细胞吞噬和代谢等。韦恩分析显示,脑源神经营养因子(brain derived neurotrophic factor,bdnf)基因交会于脑膜炎关联基因集、耳聋关联基因集和S.suis 2感染差异表达基因集,且表达显著下调;c4b、fas、icam1、cxcl1、csf3、lrg1和nde1基因交会于脑膜炎关联基因集和S.suis 2感染差异表达基因集,且表达均显著上调。【结论】本研究构建了S.suis 2感染的小鼠脑膜炎模型,并对脑组织进行了转录组学分析,揭示了S.suis 2感染后小鼠脑中多个重要的差异表达基因和分子信号通路,并绘制了分子信号通路网络,为S.suis 2感染引起脑膜炎的分子机制研究提供了新的理论依据和潜在的治疗靶点。

关键词： 2型猪链球菌感染脑膜炎转录组学免疫反应

副猪嗜血杆菌外膜囊泡激活caspase-11和NLRP3炎性体诱导炎性细胞因子IL-1β和IL-18分泌

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微生物学通报 2022年第12期49卷 5171-5183页

作者：李艳杨君翟少伦楚品品卞志标张昆丽李春玲广东省农业科学院动物卫生研究所广东广州510640 广东省畜禽疫病防治研究重点实验室广东广州510640 农业农村部兽用药物与诊断技术广东科学观测实验站广东广州510640 岭南现代农业科学与技术广东省实验室茂名分中心广东茂名525000

【背景】副猪嗜血杆菌可引起多种炎性反应和较高死亡率,其致炎机制目前尚不清楚。【目的】探究副猪嗜血杆菌外膜囊泡(outermembranevesicles,OMVs)诱导RAW264.7细胞caspase-11及NLRP3炎性体活化的功能,以及caspase-11在OMVs活化炎性体... 详细信息

【背景】副猪嗜血杆菌可引起多种炎性反应和较高死亡率,其致炎机制目前尚不清楚。【目的】探究副猪嗜血杆菌外膜囊泡(outermembranevesicles,OMVs)诱导RAW264.7细胞caspase-11及NLRP3炎性体活化的功能,以及caspase-11在OMVs活化炎性体诱导炎性因子表达过程中的关键作用。【方法】副猪嗜血杆菌OMVs感染RAW264.7细胞,收集6、12和24 h细胞,RT-PCR检测caspase-11、NLRP3、ASC和caspase-1 mRNA的表达;收集感染后48 h细胞,Western blotting检测caspase-11、NLRP3、ASC和caspase-1蛋白表达。收集感染后6、12、24、48和72 h细胞上清,ELISA检测interleukin(IL)-1β和IL-18表达水平;不同浓度OMVs(0、2.5、10、25、50和100μg/mL)感染RAW264.7细胞24 h,ELISA检测上清中IL-1β和IL-18水平。构建caspase-11沉默RAW264.7细胞株,收集OMVs感染后12、24和48 h细胞培养上清检测IL-1β和IL-18水平。【结果】Caspase-11mRNA转录水平在OMVs感染6、12和24h均极显著高于对照组(P<0.01);NLRP3 mRNA转录水平在感染后6、24 h极显著高于对照组(P<0.01);ASC mRNA转录水平在感染后12、24 h显著低于对照组(P<0.05);caspase-1 mRNA转录水平在感染后6、12和24 h显著高于对照组(P<0.05)。Westernblotting结果显示,与空白对照组相比,OMVs组caspase-11、NLRP3、ASC和caspase-1蛋白表达均明显升高。OMVs感染RAW264.7细胞后12、24、48和72 h,IL-1β表达量极显著高于对照组(P<0.01),而且呈现时间依赖性升高,IL-18表达水平在感染后6、12、24、48和72 h显著高于对照组(P<0.05);不同浓度OMVs感染细胞时,OMVs对细胞的致炎作用呈现剂量依赖性增强。Caspase-11沉默后,IL-1β水平在感染后12、24和48h显著低于未沉默组;Caspase-11沉默组IL-18表达量在感染后24、48h均显著低于未沉默组(P<0.05)。【结论】副猪嗜血杆菌OMVs在副猪嗜血杆菌诱导的炎症反应中发挥重要作用,OMVs可诱导RAW264.7细胞caspase-11介导的非经典NLRP3炎性体信号通路活化。

关键词：副猪嗜血杆菌外膜囊泡 caspase-11 NLRP3炎性体 IL-1β IL-18

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牛十二指肠贾第虫流行特点及基因型研究进展

中国动物传染病学报 2022年

作者：庄晓娜林森馨陈明望陈发明李逸飞陈飞李天宇翟少伦广西大学广东省农业科学院动物卫生研究所广东省畜禽疫病防治研究重点实验室农业农村部兽用药物与诊断技术广东科学观测实验站中山市动物疫病预防控制中心

十二指肠贾第虫是一种在全球广泛流行的寄生虫疾病，主要寄生在偶蹄动物肠道内，可引起动物腹泻及生长迟缓等不良症状，危害养殖业发展。由于十二指肠贾第虫具有人畜共患性，因此，加强对十二指肠贾第虫的研究及防治具有重要的公共卫生...

十二指肠贾第虫是一种在全球广泛流行的寄生虫疾病，主要寄生在偶蹄动物肠道内，可引起动物腹泻及生长迟缓等不良症状，危害养殖业发展。由于十二指肠贾第虫具有人畜共患性，因此，加强对十二指肠贾第虫的研究及防治具有重要的公共卫生意义。本文对十二指肠贾第虫的生命周期、致病机制、基因型分类及治疗进行总结，重点阐述了牛致病性十二指肠贾第虫基因型的流行情况，为十二指肠贾第虫的进一步研究提供参考。

关键词：

革兰氏阴性病原菌外膜囊泡的生物学作用与机制研究进展

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广东农业科学 2023年第7期50卷 1-10页

作者：李春玲柯海意徐民生卞志标张昆丽李艳翟少伦广东省农业科学院动物卫生研究所/广东省畜禽疫病防治重点实验室/广东省兽医公共卫生开放实验室/农业农村部兽用药物与兽医生物技术广东科学观测实验站广东广州510640 广东省高州农业学校广东茂名525000

外膜囊泡(Outer membrane vesicles,OMV)是兰氏阴性菌分泌的纳米样颗粒。OMV呈球状双层膜结构,直径为20~250 nm大小。其主要由细菌的外膜成分构成,其中病原菌分泌的OMV包括与致病相关的多种成分,如非蛋白抗原脂多糖、脂质、蛋白质粘附... 详细信息

外膜囊泡(Outer membrane vesicles,OMV)是兰氏阴性菌分泌的纳米样颗粒。OMV呈球状双层膜结构,直径为20~250 nm大小。其主要由细菌的外膜成分构成,其中病原菌分泌的OMV包括与致病相关的多种成分,如非蛋白抗原脂多糖、脂质、蛋白质粘附素、侵袭素、毒素等致病因子。病原菌OMV还含有细菌的DNA、RNA、sRNA和质粒等核酸,是革兰氏阴性菌的一种新型分泌系统,与致病性、耐药基因的存储和传播、细菌间及细菌-宿主间通信串扰等一系列功能紧密相关。病原菌OMV的分泌与应激反应有关。OMV作为毒力因子、耐药基因或质粒、抗原分子等生物活性物质的载体递送至宿主细胞,直接导致疫病的发生或加剧病情。在作用机制方面,OMV通过动力依赖性内吞将毒素转运至宿主细胞、介导耐药基因水平转移、通过增加分泌量减少噬菌体入侵病原菌,或保护来源菌、周围细菌免受膜活性物质侵害、影响,以及诱导细菌感染部位甚至远部组织免疫相关细胞的免疫反应、激活炎症反应通路、介导宿主细胞死亡及代谢重构等。鉴于OMV在细菌致病、耐药性产生、宿主生理屏障(肠黏膜屏障、肠血管屏障、血脑屏障)破坏及生态位失衡、免疫功能异常等方面发挥的多种生物学功能,深入了解其相关生物学作用和潜在的分子机制,对探索人和动物细菌病的致病机制、耐药机理、开展药物靶向递送系统研发及新型疫苗创制等防控新策略具有重要意义。重点对OMV在革兰氏阴性病原菌致病过程中的作用及分子机制相关研究进展进行综述,并对其应用进行展望。

关键词：革兰氏阴性病原菌外膜囊泡致病性生物学作用分泌系统

猪群中三种新发小DNA病毒的分子流行病学研究

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猪群中三种新发小DNA病毒的分子流行病学研究

作者：翟少伦新疆农业大学

学位级别：硕士

近年来,猪群中新发病原不断涌现,尤其是小DNA病毒,其直接或间接地给我国乃至世界养猪业造成了巨大的经济损失。圆环病毒科圆环病毒属的猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV2)、未定科的指环病毒属的猪细环病毒(Porcine torque ... 详细信息

近年来,猪群中新发病原不断涌现,尤其是小DNA病毒,其直接或间接地给我国乃至世界养猪业造成了巨大的经济损失。圆环病毒科圆环病毒属的猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV2)、未定科的指环病毒属的猪细环病毒(Porcine torque teno virus,PTTV)及细小病毒科细小病毒亚科博卡病毒属的猪博卡病毒(Porcine bocavirus,PBoV)都是小DNA病毒,其基因组在1.7kb.2kb之间。本研究主要对以上三种病毒进行分子流行病学研究,研究内容如下: 在PCV2的分子流行病学研究中,普通PCR检测结果显示PCV2在2009年送检病料中的检出率(61.3%,117/191)显著性高于2008年的检出率(19.4%,61/315)(P0.05),但其明显高于健康猪体内检出率(48.8%,20/41)(P0.05),而PRRSV在PTTV2阳性发病样品中的感染率(52.4%,54/103)显著性高于PTTV2阴性发病样品中的感染率(33%,29/88)(P0.05)。

关键词：猪圆环病毒2型猪细环病毒猪博卡病毒分子流行病学

广东省猪传染性胸膜肺炎放线杆菌分离鉴定及耐药表型和耐药基因检测与分析

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中国畜牧兽医 2022年第8期49卷 3212-3225页

作者：徐民生柯海意施科达杨冬霞翟少伦臧莹安李春玲仲恺农业工程学院动物科技学院广州510305 广东省农业科学院动物卫生研究所广东省畜禽疫病防治研究重点实验室农业农村部兽用药物与诊断技术广东科学观测实验站广州510640

【目的】了解广东省部分规模化猪场引起猪传染性胸膜肺炎(PCP)的病原菌猪传染性胸膜肺炎放线杆菌(APP)的耐药表型和耐药基因携带情况,并分析比较其相关性,为有效防控该病提供理论依据。【方法】将2019-2021年从广东省不同地区规模化猪... 详细信息

【目的】了解广东省部分规模化猪场引起猪传染性胸膜肺炎(PCP)的病原菌猪传染性胸膜肺炎放线杆菌(APP)的耐药表型和耐药基因携带情况,并分析比较其相关性,为有效防控该病提供理论依据。【方法】将2019-2021年从广东省不同地区规模化猪场采集的疑似猪传染性胸膜肺炎病死猪病料通过病原分离培养、革兰氏染色、生化试验、PCR扩增等方法进行病原菌分离鉴定和测序分析,随后对分离株进行药敏试验并通过PCR检测其耐药基因,确定其耐药表型和耐药基因的携带率,分析比较两者的一致性。【结果】分离菌需在含有血清和NAD的培养板中生长;革兰氏染色结果显示分离菌为红色,可判定为革兰氏阴性细菌,通过生化试验、PCR结果及测序分析确定分离到20株APP,且没有表现出明显的地域特性。所有菌株均呈现多重耐药且约50%菌株呈8重及以上耐药;其中对四环素类、磺胺类、氯霉素类和大环内酯类药物耐药率较高,分别为77.5%、65.0%、55.0%和48.8%;进一步分析发现,分离菌主要对四环素、磺胺异噁唑、氟苯尼考和林可霉素等抗菌药物耐药,而对头孢唑啉(先锋Ⅴ)和阿奇霉素敏感。23种主要耐药基因中共检测到bla、aph(2″)-Ⅰb、sul1、sul2、sul3、tetA、tetB、tetM、tetO、tetR和floR这11种耐药基因,携带率分别为85%、85%、50%、60%、75%、30%、100%、85%、100%、70%和80%;未检测到喹诺酮类、大环内酯类和林可胺类相关耐药基因。【结论】从广东省猪群中分离到的APP表现出广泛耐药性,且为多重耐药,耐药基因与耐药表型基本一致,表明耐药基因的携带是细菌对抗菌药物产生耐药的主要原因之一,但也可能存在其他未检测的耐药基因,或存在新的耐药机制。

关键词：猪传染性胸膜肺炎胸膜肺炎放线杆菌(APP) 分离鉴定耐药表型耐药基因