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人次级淋巴组织趋化因子（SLC）的克隆、表达和功能鉴定

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人次级淋巴组织趋化因子（SLC）的克隆、表达和功能鉴定

作者：罗福康第三军医大学

学位级别：硕士

次级淋巴组织趋化因子(Secondary Lymphoid-Tissue Chemokine ,SLC),即CCL21,是趋化因子(Chemokine)超家族成员。SLC通过其受体CCR7诱导T淋巴细胞和DC(dendritic cell)进入次级淋巴组织,并由DC提呈抗原,激活T淋巴细胞。因此SLC是引发特异性免疫反应的关键趋化因子之一。研究表明,缺乏鼠SLC的小鼠其T细胞归巢和DC定位障碍,T细胞活化延迟,次级淋巴组织结构紊乱。而SLC的过表达则密切参与了多种自身免疫性疾病的发生和发展。因此,SLC及其受体有望成为治疗移植排斥反应、自身免疫性疾病和肿瘤药物设计的新靶点。为此我们克隆了人SLC成熟蛋白基因,构建了该基因的原核表达质粒,进行了重组蛋白的诱导表达、纯化及生物学活性的鉴定,旨在为进一步研究SLC在移植排斥反应、肿瘤发展与转移和自身免疫性疾病中的作用机制及应用奠定基础。该项研究取得的主要结果如下: 1.通过从人扁桃体中提取总RNA,RT-PCR成功获得编码人SLC成熟蛋白的DNA片段(SLC起始密码子下游第70-405base),并将该片段插入原核表达质粒pET32a(+),成功构建了重组原核表达质粒pET32a(+)/SLC(+3),通过突变去掉目的基因与肠激酶位点间的三个氨基酸,经测序,与GenBank上登录的人SLC成熟蛋白cDNA序列(登录号AB002409)完全一致,获得SLC天然蛋白的重组原核表达质粒pET32a(+)/SLC。 2.将该质粒转化大肠杆菌BL21trxB(DE3),经IPTG诱导,获得了高水平表达的融合蛋白(TrxA-SLC),并确定融合蛋白在BL21trxB(DE3)中高效表达的最佳诱导条件为终浓度1mmol/L的IPTG在37℃诱导表达3小时。SDS-PAGE分析可见,表达蛋白的大小约为30kDa,占菌体总蛋白的50%以上,可溶性蛋白约占50%。用羊抗人SLC多克隆抗体进行Western blot分析显示,在30 kDa 处出现单一阳性条带,而对照的pET32a(+)/BL21trxB(DE3)诱导菌则无此反应。 3.将大量表达的融合蛋白经TALON金属亲和树脂纯化、除盐、肠激酶消化、弱阳离子交换层析,得到电泳纯的SLC重组蛋白。 4.生物学活性分析显示,所制备的重组SLC可在体外趋化外周血表达CCR7的淋巴细胞,可引起外周血表达CCR7的淋巴细胞胞内钙流明显升高。功能性重组人SLC的制备,为进一步研究SLC的作用机制及研制其受体CCR7 的拮抗剂创造了条件,同时也为相关疾病的治疗性研究奠定了物质基础。

关键词： SLC 基因克隆突变原核表达蛋白纯化活性测定

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川射干中鸢尾醛型三萜的分离与鉴定

川射干中鸢尾醛型三萜的分离与鉴定

作者：罗福康广州中医药大学

学位级别：硕士

目的:川射干是鸢尾科鸢尾属植物鸢尾(Iris tectorum Maxim.)的干燥根茎,又名土知母,蓝蝴蝶,于2005年被中国药典收载,主要产于广东、广西、四川等地。在四川省,常用川射干代替射干入药。川射干具有清热解毒、祛痰、利咽的功效。临床上用... 详细信息

目的:川射干是鸢尾科鸢尾属植物鸢尾(Iris tectorum Maxim.)的干燥根茎,又名土知母,蓝蝴蝶,于2005年被中国药典收载,主要产于广东、广西、四川等地。在四川省,常用川射干代替射干入药。川射干具有清热解毒、祛痰、利咽的功效。临床上用于治疗病毒感染、炎症、咳嗽气喘。近几年,从传统中药川射干中,发现了一系列结构新颖的鸢尾醛型三萜。鸢尾醛型三萜是鸢尾科植物特有的代谢产物,包括单环、双环、螺环三种类型,具有抗炎、抗溃疡、抗疟、抗真菌、抗肿瘤、保护神经系统等多种生物活性。本课题主要对川射干中的化学成分进行研究,期望发现更多的结构新颖而且活性较好的鸢尾醛型三萜,为药理研究奠定基础。方法:70%的乙醇水提取部位首先用D101大孔树脂来富集鸢尾醛型三萜,再用硅胶柱、ODS柱、MCI柱等多种正反柱色谱进行分离,再用凝胶柱除去黄酮,最后用液相色谱,分离纯化鸢尾醛型三萜,根据质谱、核磁、红外、紫外、旋光、Mosher反应、Snatzke法等方法,确定化合物的结构。结果:从川射干70%的乙醇水提取部位分离得到31个化合物,分别是spiroiridal A(IT-1)、spiroiridal B(IT-2)、iritectol H(IT-3)、iritectol I(IT-4)、iritectol J(IT-5)、spirioiridotectal G(IT-6)、spirioiridotectal H(IT-7)、iritectol G(IT-8)、iristectorene I(IT-9)、iristectorene H(IT-10)、isoiridogermanal(IT-11)、iridobelamal A(IT-12)、iridal(IT-13)、iridal 26(IT-14)、iritectol F(IT-15)、22-epiiritectol F(IT-16)、iridojaponal C(IT-17)、iristectorenes B(IT-18)、Iristectorenes D(IT-19)、spirioiridotectal B(IT-20)、Spirioiridotectal A(IT-21)、polycycloiridal D(IT-22)、belamcanolide A(IT-23)、5,7-dihydroxy-8-(1-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)ethyl)-3--(4-hydroxyphenyl)-6-methoxy-4H-chromen-4-one(IT-24)、5,7-dihydroxy-8-(1-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)allyl)-3--(4-hydroxyphenyl)-6-methoxy-4H-chromen-4-one(IT-25)、Irilin D(IT-26)、tectorigenin(IT-27)、6-hydroxybiochanin A(IT-28)、genistein(IT-29)、dihydrokaempferol(IT-30)、4 ’-O-methyldihydroquercetin(IT-31)结论:其中IT-1～IT-10是新的鸢尾醛型三萜,IT-1和IT-2是螺环型鸢尾醛型三萜,其C-11侧链的C-17～C-19环化形成了 2-甲氧基环己-2,5-二烯-1,4-二酮。IT-3～IT-7是3对差向异构体。IT-24,IT-25是两个新的黄酮类化合物。

关键词：川射干鸢尾属鸢尾醛型三萜化学成分

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人趋化因子SLC原核表达载体的构建与表达

第三军医大学学报 2004年第14期26卷 1231-1234页

作者：罗福康郑红何凤田第三军医大学西南医院实验研究中心重庆400038 第三军医大学基础医学部生物化学与分子生物学教研室重庆400038

目的　构建趋化因子SLC(secondarylymphoid tissuechemokine)的硫氧还蛋白融合表达载体并表达融合蛋白。方法　从人扁桃体中提取总RNA ,再进行RT PCR ,扩增SLC成熟蛋白基因 ,并在 5’和 3′分别添加NcoⅠ和EcoRⅠ酶切位点 ,通过这两个... 详细信息

目的　构建趋化因子SLC(secondarylymphoid tissuechemokine)的硫氧还蛋白融合表达载体并表达融合蛋白。方法　从人扁桃体中提取总RNA ,再进行RT PCR ,扩增SLC成熟蛋白基因 ,并在 5’和 3′分别添加NcoⅠ和EcoRⅠ酶切位点 ,通过这两个酶切位点重组于pET3 2a( +)载体上 ,转化E .coliDH5α ,筛选阳性克隆 ,酶切鉴定 ,DNA测序检测插入序列的正确性 ,经突变删除因NcoⅠ位点引入而在肠激酶位点和目的基因间多余的 3个氨基酸 ,DNA再测序检测突变结果 ,SDS PAGE分析其表达 ,并通过金属离子亲和层析、除盐、弱阳离子交换层析 ,得到纯化的融合蛋白 ,Westernblot验证纯化的融合蛋白。结果　成功构建了SLC天然蛋白的硫氧还蛋白融合表达载体 ,表达并纯化出融合蛋白 ,Westernblot证明该融合蛋白能与羊抗人SLC一抗结合。结论　构建的天然SLC硫氧还蛋白融合表达载体以可溶性蛋白的方式稳定表达SLC硫氧还蛋白。

关键词： SLC 突变融合表达载体蛋白纯化

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木棉花中的1个新的三萜苷元

中草药 2019年第7期50卷 1532-1534页

作者：罗福康陈芳廖国超吴鹏广州中医药大学中药学院中医药防治肿瘤转化医学研究国际合作联合实验室广东广州510006

目的研究木棉Bombax malabaricum花的化学成分。方法通过硅胶和凝胶柱色谱进行化合物的分离与纯化,结合波谱数据和X-ray单晶衍射的方法进行结构解析。结果从木棉花中分离得到1个新化合物,鉴定为3β-乙酰氧基-22α,30-二羟基熊果-20-烯... 详细信息

目的研究木棉Bombax malabaricum花的化学成分。方法通过硅胶和凝胶柱色谱进行化合物的分离与纯化,结合波谱数据和X-ray单晶衍射的方法进行结构解析。结果从木棉花中分离得到1个新化合物,鉴定为3β-乙酰氧基-22α,30-二羟基熊果-20-烯。结论化合物1是熊果烷型三萜类化合物,命名为木棉萜A。

关键词：木棉花木棉属三萜类木棉萜A X-ray单晶衍射

1例凝血因子Ⅺ缺乏症基因突变及临床表现分析

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国际检验医学杂志 2022年第6期43卷 762-766页

作者：张婷婷薛卫斌蒋一斓杨霞王浩园罗福康重庆市第九人民医院医学检验科重庆400700 西南大学医学研究院重庆400700

目的对1例凝血因子Ⅺ(FⅪ)缺乏症患者进行基因突变检测,结合临床表现初步探讨其发病机制,丰富FⅪ缺乏症数据库。方法检测患者凝血酶原时间(PT)、活化部分凝血活酶时间(APTT)、凝血酶时间(TT)、血浆纤维蛋白原水平(Fbg),完善APTT纠正试... 详细信息

目的对1例凝血因子Ⅺ(FⅪ)缺乏症患者进行基因突变检测,结合临床表现初步探讨其发病机制,丰富FⅪ缺乏症数据库。方法检测患者凝血酶原时间(PT)、活化部分凝血活酶时间(APTT)、凝血酶时间(TT)、血浆纤维蛋白原水平(Fbg),完善APTT纠正试验及凝血因子Ⅱ活性(FⅡ∶C)、凝血因子Ⅴ活性(FⅤ∶C)、凝血因子Ⅶ活性(FⅦ∶C)、凝血因子Ⅷ活性(FⅧ∶C)、凝血因子Ⅸ活性(FⅨ∶C)、凝血因子Ⅹ活性(FⅩ∶C)、凝血因子Ⅺ活性(FⅪ∶C)、凝血因子Ⅻ活性(FⅫ∶C)检测;采用基于二代测序技术检测FⅪ相关基因的变异,再用一代测序验证突变位点;采用生物信息学工具预测突变位点致病的可能性及突变后对蛋白质功能的影响。结果患者APTT明显延长,APTT纠正试验显示可以纠正,FⅪ∶C明显下降;基因测序结果发现与FⅪ相关的基因F11变异,变异位点为c.1550C>A/p.Thr 517Asn,序列信息上传至NCBI(SRA Accession:PRJNA763306)。生物信息学分析预测该突变是有害的,可能是患者出现凝血功能异常的原因。结论该研究发现遗传性FⅪ缺乏症致病突变位点,可能有助于今后该病的诊断和治疗。

关键词：凝血因子Ⅺ缺乏症基因突变二代测序技术生物信息学分析

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人趋化因子ELC的克隆与表达

第三军医大学学报 2005年第12期27卷 1204-1207页

作者：罗福康沈大斌郑红第三军医大学新桥医院检验科重庆400037 第三军医大学西南医院实验研究中心重庆400038

目的　克隆人趋化因子ELC基因,表达并初步纯化ELC融合蛋白。方法　从扁桃体中提取总RNA ,再进行RT PCR ,扩增ELC成熟蛋白基因,并在5′和3′分别添加NcoⅠ和EcoRⅠ酶切位点,通过这两个酶切位点重组于pET3 2a(+ )载体上,转化E .coliDH5α... 详细信息

目的　克隆人趋化因子ELC基因,表达并初步纯化ELC融合蛋白。方法　从扁桃体中提取总RNA ,再进行RT PCR ,扩增ELC成熟蛋白基因,并在5′和3′分别添加NcoⅠ和EcoRⅠ酶切位点,通过这两个酶切位点重组于pET3 2a(+ )载体上,转化E .coliDH5α,筛选阳性克隆,酶切鉴定,DNA测序检测插入序列的正确性,缺失突变获得ELC天然蛋白表达载体pET3 2a(+ ) ELC ,SDS PAGE分析其表达,Westernblot验证融合蛋白。大量表达并初步纯化ELC融合蛋白。结果　成功克隆了ELC基因,表达并初步纯化得到ELC融合蛋白。结论　构建的ELC硫氧还蛋白融合表达载体以可溶性蛋白的方式表达ELC硫氧还蛋白。

关键词： ELC 融合表达载体缺失突变 Western blotting 蛋白纯化

人趋化因子SLC在大肠杆菌中的表达与初步纯化

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重庆医学 2006年第18期35卷 1638-1640页

作者：罗福康沈大斌郑红顾涛第三军医大学新桥医院检验科重庆400037 第三军医大学西南医院综合实验研究中心重庆400038

目的确立人趋化因子SLC在大肠杆菌中的表达条件和初步纯化条件。方法将pET32a(+)/SLC分别转化大肠杆菌AD494(DE3)、BL21trxB(DE3)、BL21trxB(DE3)plusS,选择最佳宿主菌,优化诱导表达的条件,将大量表达的目的蛋白经金属离子亲和层析、除... 详细信息

目的确立人趋化因子SLC在大肠杆菌中的表达条件和初步纯化条件。方法将pET32a(+)/SLC分别转化大肠杆菌AD494(DE3)、BL21trxB(DE3)、BL21trxB(DE3)plusS,选择最佳宿主菌,优化诱导表达的条件,将大量表达的目的蛋白经金属离子亲和层析、除盐、肠激酶酶切、阳离子交换进行初步纯化。结果pET32a(+)/SLC最佳宿主菌为BL21trxB(DE3),优化的表达条件为37℃、1mmol/L IPTG诱导3h,SDS-PAGE分析可见,表达蛋白的大小约为30kd,占菌体总蛋白的50%以上,可溶性蛋白约占50%。用SLC多克隆抗体进行Western blot分析显示,在30kd处出现单一阳性条带,而对照的pET32a(+)/BL21trxB(DE3)诱导菌则无此反应。SLC经一系列纯化步骤得到初步纯化。结论初步建立pET32a(+)/SLC在宿主菌BL21trxB(DE3)中表达和纯化的方法。

关键词：融合蛋白宿主菌蛋白纯化趋化因子大肠杆菌

1例输入性罕见远期复发卵型疟原虫多重感染的实验室检测分析

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国际检验医学杂志 2022年第7期43卷 884-888页

作者：薛卫斌王浩园张婷婷蒋莉娟蒋一斓罗福康重庆市第九人民医院医学检验科重庆400700 西南大学医学研究院重庆400700

目的对1例疟疾复发患者通过实验室多种方法,并结合其临床症状,做出快速准确的诊断。方法对患者进行血常规检查、疟疾快速诊断试剂盒(RDTs)检测和形态学检查,结合其临床症状进行初步诊断;再通过巢式PCR和一代测序的方法,诊断虫种并鉴定... 详细信息

目的对1例疟疾复发患者通过实验室多种方法,并结合其临床症状,做出快速准确的诊断。方法对患者进行血常规检查、疟疾快速诊断试剂盒(RDTs)检测和形态学检查,结合其临床症状进行初步诊断;再通过巢式PCR和一代测序的方法,诊断虫种并鉴定亚型。结果通过血常规散点图和RDTs检测的结果,初步判断为疟原虫感染,且排除恶性疟疾的可能;形态学检查判断为卵形疟原虫多重感染,一代测序结果经NCBI中的核酸数据库比对后,鉴定为卵形疟原虫P.ovale curtisi亚型。结论本实验室通过3种方法在短期内明确诊断此病例为输入性罕见远期复发卵型疟原虫多重感染,并鉴定出了虫种亚型。

关键词：疟原虫卵形疟多重感染远期复发

冠心病患者外周血单个核细胞HCMV-DNA的荧光定量PCR检测

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中国病原生物学杂志 2011年第8期6卷 571-573,566页

作者：姚磊晏玲罗福康董解菊何作云第三军医大学新桥医院检验科重庆400037

目的了解冠心病（CHD）患者外周血单个核细胞（PBMCs）人巨细胞病毒（HCMV）-DNA存在情况并探讨其临床意义。方法应用实时荧光定量PCR（real time FQ-PCR）方法,对62例CHD患者,29例其他心血管疾病患者和30例健康体检者的PBMCs内HCMV-DN... 详细信息

目的了解冠心病（CHD）患者外周血单个核细胞（PBMCs）人巨细胞病毒（HCMV）-DNA存在情况并探讨其临床意义。方法应用实时荧光定量PCR（real time FQ-PCR）方法,对62例CHD患者,29例其他心血管疾病患者和30例健康体检者的PBMCs内HCMV-DNA进行定量检测。结果 CHD患者PBMCs的HCMV-DNA检出率41.9%,其他心血管疾病组10.3%,正常对照组10.0%,差异有统计学意义（P〈0.05）。CHD组HCMV-DNA载量介于103~105拷贝/ml者为12例,占阳性例数的46.1%（12/26）,介于105~106拷贝/ml者为8例,占阳性例数的30.7%（8/26）。结论 CHD患者PBMCs的HCMV感染可能在其致动脉粥样硬化性发病过程中发挥重要作用。

关键词：冠心病单个核细胞 HCMV-DNA 实时荧光定量PCR