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CSFV、HP-PRRSV、PEDV和ASFV等病原GeXP多重检测方法的建立和试剂盒的初步组装

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CSFV、HP-PRRSV、PEDV和ASFV等病原GeXP多重检测方法的建立和试剂...

作者：罗忠永四川农业大学

学位级别：硕士

研究目的:建立猪瘟病毒、高致病性猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒、猪流行性腹泻病毒和非洲猪瘟病毒等病原GeXP多重检测方法,组装GeXP多重检测试剂盒并通过与单病原检疫标准方法对比初步探究该试剂盒的应用价值;综合本研究成果及本实验室... 详细信息

研究目的:建立猪瘟病毒、高致病性猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒、猪流行性腹泻病毒和非洲猪瘟病毒等病原GeXP多重检测方法,组装GeXP多重检测试剂盒并通过与单病原检疫标准方法对比初步探究该试剂盒的应用价值;综合本研究成果及本实验室其他类似课题研究成果,最终建立基于GeXP技术的猪体重要疫病的高通量诊断技术。研究方法:1、选定核酸作为病原诊断的指示物,参考病原全基因组序列比对分析研究成果,遵循特异保守的原则,选定CSFV5UTR序列、HP-PRRSVNSP2基因、ASFV B646L基因、PEDV M基因作为核酸检测区段;从NCBI数据库下载各病原相应核酸序列,使用生物学软件比对分析根据毒株间保守区域设计引物;特别地,设计的HP-PRRSV诊断引物要能区分PRRSV毒株和HP-PRRSV毒株。2、根据实验设计的引物建立单病原PCR诊断方法,通过疫苗参考毒株及实验室分离鉴定毒株分析单病原单重PCR的特异性;利用体外转录合成的CSFV、HP-P RRSV、PEDVRNA标准品和构建的ASFV质粒分析单病原单重PCR的灵敏度;根据特异性和灵敏度实验结果分析引物设计是否符合设计预期。3、以鉴定符合设计预期的引物,参考GeXP实验指导建立本研究的4种病原GeXP多重检测方法,通过疫苗参考毒株及实验室分离鉴定毒株分析4种病原GeXP多重检测方法的特异性;通过RNA标准品和质粒分析4种病原GeXP多重检测方法的单病原和多病原灵敏度;根据特异性和灵敏度实验结果分析本实验建立的4种病原GeXP多重检测方法的可行性。4、根据实验成果组装GeXP多重检测试剂盒,使用单病原检疫标准方法和本实验组装的试剂盒同时检测本实验室从四川省各地区采集保存的64份临床病料;以单病原检疫标准方法作为参考,分析本实验组装的试剂盒的相对特异性、相对灵敏度、符合率;根据实验结果分析该试剂盒的临床应用价值。结果:1、单病原单重PCR实验结果显示本实验设计的引物能特异性地检出CSFV、H P-PRRSV、PEDV 参考株和 ASFV 质粒,而无法检出 PRRSV、JEV、FMDV、PP V、PCV、PRV、Mh、Er、Pm参考株;各病原单重PCR的灵敏度为102copies/μl;根据HP-PRRSV NSP2基因缺失区设计的引物能够特异性扩增HP-PRRSV参考株而无法扩增PRRSV参考株;本实验设计的引物符合实验预期,能够用于GeXP多重检测方法的建立。2、根据GeXP实验指导建立的4种病原GeXP多重检测方法能够特异性地检出CSFV、HP-PRRSV、PEDV 参考株和 ASFV 质粒,而无法检出 PRRSV、JEV、FMD V、PPV、PCV、PRV、Mh、Er、Pm参考株;设计的HP-PRRSV引物能够特异性扩增HP-PRRSV参考株而无法扩增PRRSV参考株;GeXP多重检测方法的单病原检测灵敏度在102copies/μl～103copies/μl之间,GeXP多重检测方法的多病原检测灵敏度为103copies/μl;本实验建立的GeXP多重检测方法具有很好的特异性和灵敏度,可以用于组装GeXP多重检测试剂盒,探究临床应用价值。3、基于结果3组装GeXP多重检测试剂盒;使用单病原检疫标准方法和本实验组装的试剂盒同时检测本实验室从四川省各地区采集保存的64份临床病料;本实验组装的GeXP多重检测试剂盒的相对特异性和相对灵敏度均为100%,符合率为97%～100%。结论:本实验成功建立猪瘟病毒、高致病性猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒、猪流行性腹泻病毒和非洲猪瘟病毒等病原GeXP多重检测方法,组装了检测试剂盒;通过对临床病料的检测及与单病原检疫标准方法对比证实该试剂盒具有很好的临床应用价值。

关键词： CSFV HP-PRRSV ASFV PEDV GeXP多重PCR

副猪嗜血杆菌5型galE基因缺失株HPS-YA-008ΔgalE的构建及鉴定

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中国兽医科学 2017年第2期47卷 191-196页

作者：罗忠永王印杨泽晓四川农业大学动物医学院动物检疫实验室四川成都611130

为构建副猪嗜血杆菌5型galE基因缺失株,本研究通过重叠PCR构建了galE基因的上、下游同源臂,然后将其连接到pRE112载体而构建了重组自杀性质粒pRE112ΔgalE;使重组质粒pRE112ΔgalE转化大肠杆菌X7213,与副猪嗜血杆菌接合转移,应用两步法... 详细信息

为构建副猪嗜血杆菌5型galE基因缺失株,本研究通过重叠PCR构建了galE基因的上、下游同源臂,然后将其连接到pRE112载体而构建了重组自杀性质粒pRE112ΔgalE;使重组质粒pRE112ΔgalE转化大肠杆菌X7213,与副猪嗜血杆菌接合转移,应用两步法筛选galE基因缺失株HPS-YA-008ΔgalE,用PCR方法验证galE基因的缺失突变。在此基础上进一步研究galE基因缺失株HPS-YA-008ΔgalE的生长特性、药物敏感性、对保育猪的毒力等生物学特性。结果,副猪嗜血杆菌血清5型galE基因缺失株HPS-YA-008ΔgalE构建成功,且缺失株的毒力已经被致弱,对药物的敏感性增加。本试验的研究结果为研制更加安全的副猪嗜血杆菌弱毒疫苗提供了实验材料。

关键词：副猪嗜血杆菌5型自杀性质粒pRE112 galE基因缺失株

PRRSV M蛋白基因片段的原核表达及间接ELISA检测方法的初步建立

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中国兽医科学 2017年第1期47卷 95-99页

作者：罗忠永王印杨泽晓四川农业大学动物医学院动物检疫实验室四川成都611130

利用PCR方法获得PRRSV M基因,使用原核表达系统p ET-28a(+)-BL21(DE3)诱导表达M蛋白。用表达的M蛋白建立检测PRRSV抗体的间接ELISA。通过特异性试验、阻断试验和重复性试验考查基于重组M蛋白建立的ELISA(M-ELISA)的实用性,同时使用M-EL... 详细信息

利用PCR方法获得PRRSV M基因,使用原核表达系统p ET-28a(+)-BL21(DE3)诱导表达M蛋白。用表达的M蛋白建立检测PRRSV抗体的间接ELISA。通过特异性试验、阻断试验和重复性试验考查基于重组M蛋白建立的ELISA(M-ELISA)的实用性,同时使用M-ELISA和IDEXX Herd Chek ELISA for PRRSV试剂盒检测收集的400份临床血清样品。结果,用PCR扩增到了PRRSV M基因,获得了重组M蛋白,建立了用于检测PRRSV抗体的间接ELISA(M-ELISA);该M-ELISA具有良好的特异性和重复性。400份临床血清的检测结果与IDEXX试剂盒的检测结果的符合率为95.3%。上述结果表明,本研究基于表达的重组M蛋白,成功建立了检测RRSV抗体的间接ELISA。

关键词：猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒 M蛋白基因原核表达 N-ti-ELISA

SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测PRRSV方法的建立

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动物医学进展 2016年第4期37卷 1-5页

作者：罗忠永王印杨泽晓四川农业大学动物医学院动物检疫实验室四川成都611130

根据编码PRRSV M蛋白的基因序列设计用于SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR扩增的引物,通过温度梯度法优化反应体系;以不同科属常见猪致病性RNA病毒疫苗验证该检测方法的特异性,参考国内PRRSV分子流行病学特征,选择基因型代表性的2株疫苗株... 详细信息

根据编码PRRSV M蛋白的基因序列设计用于SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR扩增的引物,通过温度梯度法优化反应体系;以不同科属常见猪致病性RNA病毒疫苗验证该检测方法的特异性,参考国内PRRSV分子流行病学特征,选择基因型代表性的2株疫苗株验证该检测方法的稳定性;以10倍梯度稀释的质粒为标准品扩增并构建标准曲线,探究该检测方法的灵敏度,随机挑取10份保存的PRRSV阳性病料和10份阴性病料同时使用农业部推荐的PRRSV RT-PCR检疫标准方法和建立的方法进行检测,以确定2种方法检测的符合率。结果显示,使用建立的方法可以在54.4℃80min内完成对PRRSV的检测,该检测方法具有特异性和稳定性;检测灵敏度为6.8×10拷贝/μL;以Ct值为横坐标,扩增序列拷贝浓度的对数值为纵坐标,得到标准曲线,方程为y=-3.411 x+39.002,R2=0.999;对随机挑取的10份PRRSV阳性病料和10份阴性病料进行检测,结果2种方法检测结果的符合率100%。结果表明,成功建立了PRRSV SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR快速检测方法,为临床提供了一种很好的检测手段。

关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒 M蛋白 SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR

猪繁殖与呼吸综合征病毒LAMP检测方法的建立

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动物医学进展 2016年第3期37卷 1-5页

作者：罗忠永王印杨泽晓四川农业大学动物医学院动物检疫实验室四川成都611130

应用通用反转录试剂盒和环介导等温核酸扩增技术(LAMP)建立了猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的快速检测方法,同时评价了该检测方法的特异性、稳定性和灵敏度。结果表明,根据猪繁殖与呼吸综合征病毒M蛋白基因保守区设计的LAMP引物能够在6... 详细信息

应用通用反转录试剂盒和环介导等温核酸扩增技术(LAMP)建立了猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的快速检测方法,同时评价了该检测方法的特异性、稳定性和灵敏度。结果表明,根据猪繁殖与呼吸综合征病毒M蛋白基因保守区设计的LAMP引物能够在64.5℃60min内实现对目标核酸片段的大量扩增,检测结果可通过直接观察反应副产物(焦磷酸镁)进行判读,该检测系统具有很高的特异性,与猪瘟病毒、猪乙型脑炎病毒等均无交叉反应;通过PRRSV不同毒株疫苗、模拟样品和临床样品确定,该检测系统具有很好的稳定性;通过质粒确定该检测系统可以检测到10拷贝/μL的病毒核酸模板。结果表明成功建立了猪繁殖与呼吸综合征病毒LAMP快速检测方法,为临床提供了一种很好的检测手段。

关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒环介导等温核酸扩增检测

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实时荧光定量PCR模板核酸提取方法的比较

动物医学进展 2016年第11期37卷 53-56页

作者：罗忠永王印杨泽晓四川农业大学动物医学院动物检疫实验室四川成都611130

对病料核酸提取前处理方法进行优化,选择酚/氯仿法、试剂盒提取法和DNA/RNA同提取法,比较提取效果,为实验室核酸提取提供参考。配制模拟样品,通过实时荧光定量PCR比较3种方法提取效果。结果表明,提取纯度为试剂盒提取法>酚/氯仿法>DNA/... 详细信息

对病料核酸提取前处理方法进行优化,选择酚/氯仿法、试剂盒提取法和DNA/RNA同提取法,比较提取效果,为实验室核酸提取提供参考。配制模拟样品,通过实时荧光定量PCR比较3种方法提取效果。结果表明,提取纯度为试剂盒提取法>酚/氯仿法>DNA/RNA同提取法。提取效率为酚/氯仿法>DNA/RNA同提取法>试剂盒提取法。表明各提取方法效果差异显著(P<0.01),为实验室核酸提取提供了参考。

关键词：核酸提取方法实时荧光定量PCR 提取效果

利用表达谱芯片分析水稻籼粳交杂种优势的分子基础

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南京农业大学学报 2015年第6期38卷 883-889页

作者：牛付安曹黎明储黄伟程灿周继华罗小金顾永平袁勤罗忠永上海市农业科学院作物育种栽培研究所上海201106 复旦大学生命科学学院上海200433 上海市崇明县良种繁育推广中心上海202150 上海农科种子种苗有限公司上海201106

[目的]本文旨在研究水稻籼粳交杂种优势的分子基础。[方法]利用Affymetrix水稻表达谱芯片分析了强优势水稻籼粳交组合‘申9A/繁31’与母本‘申9A’和父本‘繁31’在幼穗分化初期剑叶组织的基因表达差异,并对差异表达基因进行了基于生物... 详细信息

[目的]本文旨在研究水稻籼粳交杂种优势的分子基础。[方法]利用Affymetrix水稻表达谱芯片分析了强优势水稻籼粳交组合‘申9A/繁31’与母本‘申9A’和父本‘繁31’在幼穗分化初期剑叶组织的基因表达差异,并对差异表达基因进行了基于生物学过程的GO(gene ontology)功能分类和代谢通路分析。[结果]幼穗分化初期杂种与双亲的表型已经产生了明显差异;共有2 258个基因在杂种与亲本之间差异表达(差异倍数≥2或≤0.5),杂种与双亲均显示差异表达的基因有327个,杂种与父本之间的差异表达基因远多于母本。杂种差异表达基因具有多种表达模式,具有正效应基因的增强表达和具有负效应基因的抑制表达对杂种优势均有贡献。差异表达基因主要参与了磷代谢、运输、防卫反应以及碳水化合物代谢等生物学过程,并在碳固定、氨基酸代谢、糖酵解/糖原异生以及磷酸肌醇代谢等多个代谢通路富集。[结论]水稻籼粳交杂种优势存在复杂的分子基础,多种分子机制参与了杂种优势的形成,光合效率和光合产物运输分配效率的提高可能是杂种优势产生的主要原因。

关键词：水稻表达谱芯片杂种优势分子基础

父母本行比及母本株距对杂交粳稻花优14母本机插制种产量的影响

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杂交水稻 2016年第3期31卷 30-31页

作者：程灿张琦周继华牛付安储黄伟罗忠永曹黎明袁勤顾永平上海市农业科学院作物育种栽培研究所上海201403 上海富明农机服务有限公司上海崇明202177 崇明县良种繁育推广中心上海崇明202150

对杂交粳稻花优14母本机插制种中亲本行比及母本株距与制种产量的关系进行研究,结果表明:父母本栽插行比、母本栽插株距对制种产量有影响显著,在机械辅助授粉条件下,花优14母本机插制种以父母本行比2∶8、母本行株距25 cm×12 cm较为适宜。

关键词：杂交粳稻花优14 行比株距制种

杂交粳稻申优28全程机械化高产高效制种技术研究

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中国稻米 2023年第6期29卷 103-106页

作者：程灿曹黎明朱建华况慧云王在满牛付安周继华储黄伟张安鹏邓宏中罗忠永张克红孙滨上海市农业科学院作物育种栽培研究所上海201106 上海市农业技术推广服务中心上海201103 华南农业大学工程学院广州510642 袁隆平农业高科技股份有限公司长沙410125 上海桑磊蔬果种植专业合作社上海201400

申优28是以BT型不育系申21A与恢复系申恢26-28配组育成的三系杂交粳稻新组合。申优28制种时,通过调节双亲的生长发育,确保了父母本花期高度相遇。研究了父母本均机插条件下不同父母本行比及母本株距对申优28制种产量的影响,以及在父本机... 详细信息

申优28是以BT型不育系申21A与恢复系申恢26-28配组育成的三系杂交粳稻新组合。申优28制种时,通过调节双亲的生长发育,确保了父母本花期高度相遇。研究了父母本均机插条件下不同父母本行比及母本株距对申优28制种产量的影响,以及在父本机插(行距25cm)-母本机直播(行距20 cm)条件下,母本不同株距对申优28制种产量的影响。结果表明,在父母本均机插条件下,父母本行比2︰8~10、行株距25 cm×14 cm时制种产量高;父本机插-母本机直播条件下,以株距16 cm时制种产量高。通过以上优化栽培方式,确保了杂交粳稻制种高产高效。

关键词：杂交粳稻申优28 父本机插-母本机直播一体机全程机械化行株距制种产量