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实时荧光定量PCR检测斑点热立克次体方法的建立

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安徽医科大学学报 2020年第7期55卷 1008-1013页

作者：罗婉蓉刘伯玉陈振任翠平高越杨莉朱禹余东阳柳燕安徽医科大学微生物学教研室合肥230032

目的建立斑点热群立克次体(SFGR)TaqMan实时荧光定量PCR(qPCR)快速检测方法。方法根据日本斑点热立克次体外膜蛋白A(ompA)基因序列设计特异性引物和探针,建立基于TaqMan探针的实时荧光定量PCR检测方法,对其特异性、灵敏性、重复性进行检... 详细信息

目的建立斑点热群立克次体(SFGR)TaqMan实时荧光定量PCR(qPCR)快速检测方法。方法根据日本斑点热立克次体外膜蛋白A(ompA)基因序列设计特异性引物和探针,建立基于TaqMan探针的实时荧光定量PCR检测方法,对其特异性、灵敏性、重复性进行检测,用建立的此检测方法和常规的巢式PCR方法同时对临床收集的80份患者血标本进行检测并比较两者结果。结果成功建立了检测SFGR的实时荧光定量PCR方法,标准曲线的循环阈值与模板拷贝数均呈良好的线性关系(r>0.99),且在检测SFGR核酸样本时具有良好的灵敏度、特异性和重复性。结论该研究建立了基于TaqMan探针检测SFGR的实时荧光定量PCR检测方法,为临床实验室快速确诊SFGR疾病提供了快速、有效的技术手段。

关键词：斑点热立克次体 ompA TaqMan探针实时荧光定量PCR

安徽省2021—2024年度流感病毒流行株NA分子特征及耐药分析

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中国热带医学 2024年

作者：俞俊岭孙永何军罗婉蓉方惟希周雪桂红芽李卫东安徽省疾病预防控制中心病原微生物分子生物学实验室

目的了解安徽省流感病毒流行株耐药情况，并分析病毒神经氨酸酶（neuraminidase, NA）基因变异和分子进化特征，为安徽省流感防控及临床用药提供参考。方法采集2021—2024年度安徽省流感样病例咽拭子标本，进行核酸检测和病毒分离；... 详细信息

目的了解安徽省流感病毒流行株耐药情况，并分析病毒神经氨酸酶（neuraminidase, NA）基因变异和分子进化特征，为安徽省流感防控及临床用药提供参考。方法采集2021—2024年度安徽省流感样病例咽拭子标本，进行核酸检测和病毒分离；随机选择70株分离获得的流感病毒流行株，采用NA活性抑制实验检测病毒对神经氨酸酶抑制剂（neuraminidase Inhibitor, NAI）的敏感性，采用病毒基因组测序和分子生物学软件，分析病毒NA基因分子进化特征。结果 70株流感病毒流行株中仅有一株H1N1pdm亚型甲型流感病毒对扎那米韦敏感性降低(IC50=1.252 nmol/L)，其余流行株均对奥司他韦和扎那米韦敏感，未发现NAI敏感性高度降低毒株，同时氨基酸序列分析也未发现NA催化活性及辅助区域关键氨基酸位点的突变，但不同型别流感病毒对不同NAI药物的IC50存在极显著差异；NA基因遗传进化树显示，20株乙型流感病毒与当年的疫苗株共同归属于Clade A.1分支，40株甲型流感病毒（H3N2亚型）中仅有一株流行株与疫苗株不同，聚为Clade A.2分支，其余39株与疫苗株共同分属Clade B分支。结论安徽省2021—2024年度流感病毒流行株中，98.6%（69/70）的毒株对NAI药物保持敏感，但病毒NA基因存在持续变异风险，随着药物的广泛使用，应不断加强流感病毒耐药性监测工作，以便更好地指导传染病防控和临床用药。

关键词：流感病毒神经氨酸酶耐药性分析分子特征

日本斑点热立克次体安徽120株ompB基因及其编码蛋白的生物信息学和B细胞抗原表位分析

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安徽医科大学学报 2020年第6期55卷 819-824页

作者：刘伯玉罗婉蓉陈振余冬阳高越朱禹洪颖杨莉柳燕安徽医科大学微生物学教研室合肥230032 马鞍山疾病预防控制中心马鞍山243000

目的对从我国临床患者血液中新发现和分离出的日本斑点热立克次体安徽120株ompB基因及其编码蛋白进行系统的结构与功能预测,为深入了解其在立克次体致病机制中的作用、研发斑点热临床诊断试剂和疫苗提供理论基础。方法基于日本斑点热立... 详细信息

目的对从我国临床患者血液中新发现和分离出的日本斑点热立克次体安徽120株ompB基因及其编码蛋白进行系统的结构与功能预测,为深入了解其在立克次体致病机制中的作用、研发斑点热临床诊断试剂和疫苗提供理论基础。方法基于日本斑点热立克次体安徽120株ompB基因及其编码的氨基酸序列,应用生物信息学方法预测其信号肽、跨膜区、疏水性等性质和可能的B细胞抗原表位。结果日本斑点热立克次体安徽120株ompB基因在3 297~3 311处存在连续15个碱基的缺失,除此之外,该分离株还有4个碱基突变。该基因编码的氨基酸数目为1 651个,蛋白质分子量为167.69 ku,共由20种氨基酸组成,其中含量较多的氨基酸是Gly;理论等电点pI为5.15,消光系数为58 805或58 680,蛋白不稳定指数为7.15,脂肪指数为88.86,总平均亲水性(GRAVY)为0.06,为疏水性蛋白;Signal peptide (Sec/SPI) Likelihood为0.567 7,有信号肽序列;存在一个Pfam区域和自转运体区,分别与细菌黏附宿主和蛋白质转运有关;蛋白二级结构中以无规卷曲为主,其次为β-折叠和α-螺旋,分别占到53.73%、30.83%和15.45%。同源模建蛋白的三级结构中,第1 308~1 651氨基酸部分在蛋白表面形成桶状结构,可能具有丝氨酸蛋白酶的作用;蛋白分子内抗原表位较丰富,共有159个可能的抗原表位,预测分数最高(0.94)的为1 269~1 284位序列。结论成功分析和预测了日本斑点热立克次体安徽120株ompB基因及其编码蛋白的组成、蛋白质的二级结构、三级结构和B细胞抗原表位,为研究日本斑点热立克次体的致病机制、临床诊断试剂和亚单位疫苗的研发提供了理论支持。

关键词：日本斑点热立克次体安徽120株 ompB B细胞抗原表位生物信息学

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新型冠状病毒变异株的演化与研究进展

安徽预防医学杂志 2023年第4期29卷 317-323,331页

作者：何军罗婉蓉夏艺丹吴家兵安徽省疾病预防控制中心安徽合肥230601 安徽省公共卫生研究院安徽合肥230601 安徽医科大学公共卫生学院安徽合肥230032

新型冠状病毒(SARS-CoV-2)具有高突变率,在全球范围内广泛流行,其变异株也在全世界蔓延。SARS-CoV-2刺突蛋白的突变会增加病毒的传播速度和疾病严重程度,增强病毒逃逸宿主免疫保护反应、单克隆抗体治疗或现有疫苗的保护效力的能力。本... 详细信息

新型冠状病毒(SARS-CoV-2)具有高突变率,在全球范围内广泛流行,其变异株也在全世界蔓延。SARS-CoV-2刺突蛋白的突变会增加病毒的传播速度和疾病严重程度,增强病毒逃逸宿主免疫保护反应、单克隆抗体治疗或现有疫苗的保护效力的能力。本综述按照世界卫生组织(WHO)对SARS-CoV-2的分类定义与追踪监测,系统归纳了其变异株的演化过程和应对措施,为进一步做好新型冠状病毒感染防控提供科学依据。

关键词： SARS-CoV-2 变异株病毒防控策略

2019-2021年安徽省外环境H9N2亚型禽流感病毒分子进化分析

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疾病监测 2024年第1期39卷 79-84页

作者：黄鑫儿周雪杨思天胡敏昊俞峻岭罗婉蓉方惟希何军安徽医科大学公共卫生学院安徽合肥230032 安徽省疾病预防控制中心安徽合肥230601 安徽省公共卫生研究院安徽合肥230601

目的分析安徽省2019—2021年外环境监测中H9N2亚型禽流感病毒的遗传进化特征。方法选取禽流感外环境病原学监测H9N2亚型禽流感病毒阳性样本383份,使用鸡胚分离培养收获21株病毒,采用实时荧光定量PCR方法扩增后进行全基因组测序,用生物... 详细信息

目的分析安徽省2019—2021年外环境监测中H9N2亚型禽流感病毒的遗传进化特征。方法选取禽流感外环境病原学监测H9N2亚型禽流感病毒阳性样本383份,使用鸡胚分离培养收获21株病毒,采用实时荧光定量PCR方法扩增后进行全基因组测序,用生物信息学软件构建基因进化树分析其遗传进化特征。结果21株H9N2亚型禽流感病毒均为G57基因型,血凝素(HA)基因片段属于JN/99基因型,神经氨酸酶(NA)基因属于G9基因型,基质蛋白(MP)基因属于G1基因型,内部核蛋白(NP)、非结构蛋白(NS)、酸性聚合酶蛋白(PA)、碱性聚合酶蛋白1(PB1)基因属于F/98基因型,碱性聚合酶蛋白2(PB2)基因片段属于ST/7488基因型毒株。HA裂解位点显示低致病性分子特征,存在重要氨基酸位点突变,HA蛋白发生了Q226L、H183N、T189D、A190T氨基酸突变;NA蛋白茎部均发生了62~64位点缺失;大部分毒株未发生PB2-E627K突变,所有毒株均未发生D701N突变;所有毒株PA蛋白具有356R和409N氨基酸突变,M2蛋白均发生S31N氨基酸突变。结论2019—2021年安徽省外环境分离得到的H9N2亚型禽流感病毒为多源重配病毒,且具有逐渐适应哺乳动物宿主相关的分子特征,需密切关注病毒的病原学演化。

关键词： H9N2亚型禽流感遗传特征分子特征

基于血管生成相关lncRNAs的肝细胞癌预后风险模型的构建及验证

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岭南现代临床外科 2024年第1期24卷 7-13页

作者：罗婉蓉张文岳罗葆明中山大学孙逸仙纪念医院超声科广州510120

目的构建并验证基于血管生成相关长非编码RNA评估肝细胞癌患者的预后风险模型。方法利用Pearson相关分析筛选出与血管生成相关lncRNA,提取差异表达的血管生成相关lncRNA。通过多因素Cox回归联合LASSO回归建立风险预后模型,并通过生存分... 详细信息

目的构建并验证基于血管生成相关长非编码RNA评估肝细胞癌患者的预后风险模型。方法利用Pearson相关分析筛选出与血管生成相关lncRNA,提取差异表达的血管生成相关lncRNA。通过多因素Cox回归联合LASSO回归建立风险预后模型,并通过生存分析、独立预后分析、风险分析等进行验证。利用列线图模型进行预后预测、分析风险评分与免疫细胞、免疫微环境及免疫检查点表达的关系对预后模型进行评估。结果筛选出的血管生成相关的lncRNA构建的风险预后模型中,风险评分越高的HCC患者预后越差,巨噬细胞及Treg细胞的浸润也证明风险评分与免疫微环境改变相关。结论该模型对预测肝细胞癌患者的预后有较好的信度和效度。

关键词：肝细胞癌血管生成长非编码RNA 预后

2016-2020年安徽省手足口病流行病学特征及CVA6基因进化分析

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病毒学报 2023年第2期39卷 445-452页

作者：傅荔艳葛盈露马婉婉冯明子王鹏罗婉蓉孙永史永林安徽医科大学公共卫生学院合肥230032 安徽省疾病预防控制中心、安徽省公共卫生研究院、安徽省医疗卫生重点专科病原微生物分子生物学实验室合肥230601

为了解安徽省2016-2020年手足口病(Hand, foot and mouth disease,HFMD)流行特征与病原谱构成,及分析CVA6(Coxsackievirus A6, CVA6)VP1区基因进化情况。本研究收集2016-2020年安徽省HFMD病例流行病学资料,描述性流行病学方法分析病例... 详细信息

为了解安徽省2016-2020年手足口病(Hand, foot and mouth disease,HFMD)流行特征与病原谱构成,及分析CVA6(Coxsackievirus A6, CVA6)VP1区基因进化情况。本研究收集2016-2020年安徽省HFMD病例流行病学资料,描述性流行病学方法分析病例三间分布情况。随机选取480份HFMD其他肠道病毒阳性咽拭子样本,RT-PCR扩增肠道病毒VP1基因片段,测定基因序列并鉴定其他肠道病毒基因型别。生物软件分析部分代表性CVA6基因序列相似性并构建系统发育树。流行病学结果显示,2016-2020年安徽省HFMD发病率仍处于较高水平,但重症病例与死亡病例数有所减少,5个年度均以其他肠道病毒流行为主,五岁以下散居儿童为主要患病人群,男女性别比为1.50∶1。2016-2019年度发病均呈现为双峰流行模式。病原分型鉴定结果为CVA6 215例(215/245,87.76%),CVA1016例(16/245,6.53%),CVA412例(12/245,4.90%),CVA51例(1/245,0.41%),CVA21例(1/245,0.41%)。选取的60株代表性CVA6 VP1区序列相似性分析表明,各序列间VP1核苷酸序列相似性为91.6%~100%,氨基酸序列相似性为97.4%~100%;与D3基因型代表株之间核苷酸序列相似性为90.7%~98.9%,氨基酸序列相似性为96.7%~100%;与CVA6原型株核苷酸序列相似性为82.3%~83.9%,氨基酸序列相似性为95.1%~96.7%。进化分析显示,CVA6划分为A-D四个基因型,60株CVA6毒株均属于D3基因亚型中的D3a分支,为中国内地地区优势流行型别。应加强对安徽省CVA6及其他肠道病毒监测,这对制定减轻HFMD疾病负担以及防控HFMD策略具有重要意义。

关键词：手足口病柯萨奇病毒A组6型基因进化流行特征

悬浮与贴壁MDCK细胞在流感病毒分离培养中的应用评价

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中华实验和临床病毒学杂志 2023年第6期37卷 637-642页

作者：周雪俞俊岭杨思天夏艺丹罗婉蓉方惟希胡敏昊何军安徽省疾病预防控制中心(安徽省公共卫生研究院) 合肥230601 安徽医科大学公共卫生学院合肥230000

目的比较悬浮细胞MDCK和贴壁细胞MDCK两种培养体系对流感病毒分离培养的差异,探讨悬浮细胞的应用前景。方法通过细胞计数记录两种细胞的活细胞密度和细胞特定生长速率,使用WHO推荐疫苗株进行病毒感染实验,连续传代5次后观察血凝效价并... 详细信息

目的比较悬浮细胞MDCK和贴壁细胞MDCK两种培养体系对流感病毒分离培养的差异,探讨悬浮细胞的应用前景。方法通过细胞计数记录两种细胞的活细胞密度和细胞特定生长速率,使用WHO推荐疫苗株进行病毒感染实验,连续传代5次后观察血凝效价并对HA和NA基因进行测序,观察基因突变情况。结果悬浮细胞的24 h、48 h活细胞密度较贴壁细胞更稳定;病毒连续传代培养至第三代时悬浮细胞培养的病毒HA滴度可达1∶256以上,而贴壁细胞则无滴度;悬浮细胞培养的H3N2和BV亚型流感病毒第四代和第五代HA基因各发生1个氨基酸位点突变,贴壁细胞两个代次内未发现基因突变,NA基因均未发现基因突变。结论悬浮MDCK细胞较贴壁细胞生长更为稳定,且病毒分离培养效率高,连续传代病毒突变率低,在基于细胞培养技术的流感疫苗生产工艺中具备一定的可行性。

关键词：流感病毒悬浮MDCK细胞贴壁MDCK细胞病毒分离

2013—2022年安徽省人感染H9N2亚型禽流感病毒分子进化分析

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中华实验和临床病毒学杂志 2024年第5期38卷 527-532页

作者：夏艺丹杨思天胡敏昊周雪俞俊岭罗婉蓉方惟希何军安徽医科大学公共卫生学院合肥230032 安徽省疾病预防控制中心安徽省公共卫生研究院合肥230601

目的分析2013—2022年安徽省人感染的H9N2亚型禽流感病毒与外环境毒株的遗传进化特点及分子特征,为人感染禽流感防控提供了监测经验。方法选取安徽省流感监测网络实验室中的外环境样本和人源样本,通过鸡胚分离得到63株病毒,采用RT-PCR... 详细信息

目的分析2013—2022年安徽省人感染的H9N2亚型禽流感病毒与外环境毒株的遗传进化特点及分子特征,为人感染禽流感防控提供了监测经验。方法选取安徽省流感监测网络实验室中的外环境样本和人源样本,通过鸡胚分离得到63株病毒,采用RT-PCR法扩增后进行全基因组测序,对其生物信息进行分析,构建基因进化树并分析其遗传进化特征以及潜在糖基化位点。结果血凝素(HA)基因属于9.***.4.5支系,蛋白裂解位点绝大部分为"PSRSSR\GL",神经氨酸酶(NA)、碱性蛋白1(PB1)、酸性蛋白(PA)、非结构蛋白(NS)和核蛋白(NP)基因属于F/98支系,基质蛋白(MP)基因属于G1/97支系,碱性蛋白2(PB2)基因属于ST/7488支系。HA蛋白发生了T155N、R164Q、H183N、T189D/V、A190V/T和Q226L突变,NA蛋白发生了62~64位点缺失,PB2蛋白发生了T271A、I292V/M和E627V/L突变,PA蛋白发生了K356R和S409N突变。63株分离株存在6个潜在糖基化位点。结论2013—2022年安徽省外环境和人源采集的H9N2亚型禽流感病毒属于同一进化分支,氨基酸位点突变提示了病毒呈现出一种逐渐适应哺乳动物宿主环境的趋势,因而需进一步研究病毒的适应性进化情况以及开展相关的监测工作。

关键词： H9N2 禽流感系统进化分子特征