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大鼠曲细精管生殖细胞体外共培养和精子发生过程的观察

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中国男科学杂志 2007年第12期21卷 7-10页

作者：张岩罗奋华吴应积内蒙古大学哺乳动物生殖生物学与生物技术教育部重点实验室呼和浩特010021

目的建立体外长期共培养体系和观察方法,为精子发生过程的研究提供细胞模型。方法采用大鼠曲细精管生殖细胞及支持细胞共培养的方法,对睾丸生精细胞作显微镜观察。结果共培养的支持细胞和生精细胞在体外存活超过6个月。在共培养期间,观... 详细信息

目的建立体外长期共培养体系和观察方法,为精子发生过程的研究提供细胞模型。方法采用大鼠曲细精管生殖细胞及支持细胞共培养的方法,对睾丸生精细胞作显微镜观察。结果共培养的支持细胞和生精细胞在体外存活超过6个月。在共培养期间,观察到精母细胞、圆形精子细胞和长形精子细胞。结论在不添加任何细胞因子和生长因子的情况下,大鼠曲细精管生殖细胞长期增生分化,不断产生精子细胞。这一结果暗示组织块和共生的支持细胞可为生殖细胞的增生和分化提供必需的细胞因子。该方法为体外研究精子发生过程提供了实验依据。

关键词：大鼠生殖细胞共同培养技术精子发生

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牛精原干细胞体外分化潜能的分析

中国细胞生物学学报 2014年第11期36卷 1526-1531页

作者：罗奋华萨初拉黄军就吴应积内蒙古大学哺乳动物生殖生物学及生物技术教育部重点实验室呼和浩特010070 中山大学生命科学学院有害生物控制与资源利用国家重点实验室中山大学附属第一医院广东省生殖医学重点实验室广州510275

家畜精原干细胞操作的核心技术是精原干细胞(spermatogonial stem cells,SSCs)的长期培养。至今家畜精原干细胞的长期培养方法还没有完善。其中的一个原因是缺乏简便有效的家畜精原干细胞生物活性鉴定手段。该研究的目的是建立一种牛精... 详细信息

家畜精原干细胞操作的核心技术是精原干细胞(spermatogonial stem cells,SSCs)的长期培养。至今家畜精原干细胞的长期培养方法还没有完善。其中的一个原因是缺乏简便有效的家畜精原干细胞生物活性鉴定手段。该研究的目的是建立一种牛精原干细胞生理潜能的体外分析方法,用于体外培养的牛精原干细胞的生物活性鉴定。首先培养牛精原干细胞,进而用干细胞因子(stem cell factor,SCF)对体外长期培养的牛精原干细胞进行诱导分化。在诱导分化过程中对细胞进行显微观察,并且用免疫荧光染色法鉴定分化的细胞。观察结果显示,经过诱导培养8 d后,牛精原干细胞形态发生了明显改变;细胞的运动行为显示出精母细胞特有的特征。免疫荧光染色结果显示,分化的细胞表达精母细胞的标记基因Scp3。上述结果例证了体外培养的牛精原干细胞具有分化为精母细胞的潜能。该研究建立了牛SSCs体外诱导分化的分析方法,用于鉴定体外培养的牛SSCs的生理潜能。但是体外诱导培养条件不能满足牛SSCs减数分裂的全部要求,导致出现一些不完全符合精母细胞特征的现象。诱导分化培养液尚需改进。

关键词：牛精原干细胞体外分化干细胞因子

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海藻酸微囊法冷冻保存绵羊精原干细胞

中国细胞生物学学报 2013年第11期35卷 1603-1609页

作者：刘代艳罗奋华孔群芳包佳婧吴应积内蒙古大学哺乳动物生殖生物学及生物技术教育部重点实验室呼和浩特010070

细胞冷冻保存技术是动物研究的重要组成部分。该研究首次应用海藻酸微囊冷冻保存绵羊精原干细胞(spermatogonial stem cells,SSCs),旨在提高绵羊SSCs的冷冻保存效率。冻存前后对绵羊SSCs存活率进行评估,在绵羊SSCs液氮冻存10 d后进行细... 详细信息

细胞冷冻保存技术是动物研究的重要组成部分。该研究首次应用海藻酸微囊冷冻保存绵羊精原干细胞(spermatogonial stem cells,SSCs),旨在提高绵羊SSCs的冷冻保存效率。冻存前后对绵羊SSCs存活率进行评估,在绵羊SSCs液氮冻存10 d后进行细胞培养和CDH1、PLZF、GFRα1、OCT-4、Thy-1五个精原干细胞特异分子标记蛋白的免疫荧光鉴定。结果表明,在液氮冻存1 d后,绵羊SSCs存活率从58.4%±1.4%(单细胞悬液冻存组)提高到78.7%±1.3%(海藻酸微囊包埋冻存组);液氮冻存10 d后,单细胞悬液冻存组细胞存活率降低至48.1%±0.8%,而海藻酸微囊包埋组细胞存活率仍保持在78.0%±1.5%。对液氮冻存10 d后的细胞进行体外培养,培养4 d后,海藻酸微囊包埋冻存组能形成典型的精原干细胞簇。进行细胞免疫荧光鉴定,发现在微囊包埋冻存10 d后CDH1、PLZF、GFRα1、OCT-4、Thy-1均显示阳性。海藻酸微囊的应用显著提高了绵羊SSCs的冷冻保存效率,且对绵羊SSCs的标记基因表达无显著影响。该方法的建立为其他家畜及濒危动物种质资源保存提供了依据。

关键词：海藻酸微囊绵羊精原干细胞冷冻保存活率

大鼠睾丸曲细精管组织支持细胞/生殖细胞长期共培养与精子发生分析

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中国细胞生物学学报 2012年第5期34卷 454-460页

作者：刘林洪史小芳罗奋华于泊洋张岩刘燕吴应积内蒙古大学哺乳动物生殖生物学和生物技术教育部重点实验室呼和浩特010021

睾丸体外生殖模型的发展为体外研究睾丸的精子发生分子机制和睾丸毒理学提供了实验工具。很多报道的模型都无法真正地模拟体内复杂的生化分子及功能性相互作用从而导致研究价值有限。该实验拟建立一个体外长期维持睾丸生殖细胞存在,并... 详细信息

睾丸体外生殖模型的发展为体外研究睾丸的精子发生分子机制和睾丸毒理学提供了实验工具。很多报道的模型都无法真正地模拟体内复杂的生化分子及功能性相互作用从而导致研究价值有限。该实验拟建立一个体外长期维持睾丸生殖细胞存在,并能持续产生精子细胞的支持细胞/生殖细胞共培养体系。体系中的支持细胞和生殖细胞均由曲细精管组织块迁移到培养皿上,在不添加任何生长因子的情况下维持体外精子发生至圆形精子细胞超过2个月。RT-PCR分析显示,共培养细胞稳定表达cdh1、scp3、tnp2;免疫荧光染色结果显示,CDH1、PLZF、SCP3以及SOX9阳性细胞存在。这些结果例证了体系中同时存在精原干细胞、精母细胞、精子细胞和支持细胞。简单高效的支持细胞/生殖细胞体外共培养体系可用于雄性生殖的分子机制和毒理学研究。

关键词：大鼠睾丸生殖细胞支持细胞/生殖细胞共培养体外精子发生

检测生精过程中减数分裂完成的质粒载体的构建

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生物技术通报 2012年第9期28卷 202-207页

作者：于泊洋罗奋华张岩吴应积内蒙古大学哺乳动物生殖生物学及生物技术教育部重点实验室呼和浩特010021

旨在构建在所有转染细胞中表达绿色荧光、在核分裂的次级精母细胞、圆形精子细胞及长形精子细胞中表达红色荧光蛋白的cmv-eGFP-Gsg2-DsRed载体。重组载体是以本实验室保存CMV-EGFP-pDsRed质粒载体为基础载体,在其多克隆位点插入Gsg2启动... 详细信息

旨在构建在所有转染细胞中表达绿色荧光、在核分裂的次级精母细胞、圆形精子细胞及长形精子细胞中表达红色荧光蛋白的cmv-eGFP-Gsg2-DsRed载体。重组载体是以本实验室保存CMV-EGFP-pDsRed质粒载体为基础载体,在其多克隆位点插入Gsg2启动子,期待可以启动红色荧光蛋白基因的表达。经大鼠睾丸共培养细胞转染试验证实,成功构建了含有Gsg2启动子的表达双荧光蛋白质粒载体。

关键词：小鼠 Gsg2启动子 CMV启动子精子发生

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大鼠精原干细胞的微滴培养法

中国细胞生物学学报 2014年第5期36卷 671-678页

作者：霍龙罗奋华张岩全祺玮吴应积内蒙古大学生命科学学院呼和浩特010021 内蒙古大学哺乳动物生殖生物学与生物技术教育部重点实验室呼和浩特010021 内蒙古医科大学基础医学院呼和浩特010010

精原干细胞(spermatogonial stem cells,SSCs)作为成体干细胞的一类,既具有自我更新和分化的潜能,又可向子代传递遗传信息。阐明其增殖过程及分化特性对SSCs的进一步应用具有重要意义。小鼠SSCs的微滴培养研究显示,微滴培养技术与常规... 详细信息

精原干细胞(spermatogonial stem cells,SSCs)作为成体干细胞的一类,既具有自我更新和分化的潜能,又可向子代传递遗传信息。阐明其增殖过程及分化特性对SSCs的进一步应用具有重要意义。小鼠SSCs的微滴培养研究显示,微滴培养技术与常规培养方法相比具有独特的优势。然而其他物种的SSCs能否实现微滴培养尚有待证实。该研究旨在利用微滴培养法建立大鼠SSCs体外培养技术。5、8、10、20、40个大鼠SSCs分别置于20μL微滴中培养,用丝裂霉素处理的STO细胞作为滋养层。倒置显微镜观察记录大鼠SSCs的增殖状态。一个月后,对微滴培养的SSCs进行免疫荧光双标记染色鉴定。结果显示,一个微滴内接种5个SSCs就能实现扩增培养;培养一个月后,SSC仍然表达其特异的标记基因分子如CDH1、OCT4、PLZF、Thy1和Gfra1。体外诱导分析显示,微滴培养的大鼠SSCs具有分化为精母细胞的能力。大鼠SSCs微滴培养法的建立,为其他物种SSCs的培养提供了借鉴,也为再生医学和生命科学相关领域的研究提供了技术平台。

关键词：精原干细胞微滴培养技术免疫荧光染色体外分化

绒山羊rsb66基因cDNA全编码区的克隆及序列分析

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生物技术通报 2013年第9期29卷 94-98页

作者：卜祥龙胡甜园罗奋华王珂吴应积内蒙古大学生命科学学院呼和浩特010021 内蒙古大学哺乳动物生殖生物学与生物技术教育部重点实验室呼和浩特010021

圆形精子细胞是雄性动物精子发生过程中主要的细胞之一。rsb66蛋白在生精细胞的细胞周期调控过程中发挥重要的作用。rsb66特异性地表达于圆形精子细胞中,但绒山羊rsb66基因全序列仍未见报道。为了更好地研究绒山羊圆形精子细胞的特性,... 详细信息

圆形精子细胞是雄性动物精子发生过程中主要的细胞之一。rsb66蛋白在生精细胞的细胞周期调控过程中发挥重要的作用。rsb66特异性地表达于圆形精子细胞中,但绒山羊rsb66基因全序列仍未见报道。为了更好地研究绒山羊圆形精子细胞的特性,根据已报道的其他物种rsb66基因的cDNA保守区设计引物,从成年绒山羊睾丸中提取总RNA,采用RT-PCR和分子克隆方法,克隆得到绒山羊rsb66基因cDNA全编码区。测序结果与牛相应核苷酸序列的同源性为97.0%,说明rsb66基因在进化上是高度保守的。

关键词：绒山羊圆形精子细胞 rsb66基因克隆序列分析

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牛乳腺上皮细胞的分离培养及其生物学特性

Zoological Research 2006年第3期27卷 299-305页

作者：多曙光吴应积罗奋华旭日干内蒙古大学哺乳动物生殖生物学与生物技术教育部重点实验室内蒙古呼和浩特010021

采用胶原酶消化法和胰蛋白酶选择性消化法分离、培养和纯化牛乳腺上皮细胞。形态学观察表明,培养的细胞具有典型的上皮细胞形态特征;染色体分析结果表明,培养的细胞具有正常的染色体数目。通过荧光免疫细胞染色方法鉴定了培养的细胞表... 详细信息

采用胶原酶消化法和胰蛋白酶选择性消化法分离、培养和纯化牛乳腺上皮细胞。形态学观察表明,培养的细胞具有典型的上皮细胞形态特征;染色体分析结果表明,培养的细胞具有正常的染色体数目。通过荧光免疫细胞染色方法鉴定了培养的细胞表达上皮细胞特异的角蛋白5和8。该细胞在添加胰岛素、氢化可的松以及羊催乳素的无血清培养液中诱导培养时,用RT-PCR方法检测到了β-酪蛋白基因的转录。这些结果表明,分离培养的细胞是乳腺上皮细胞,这些细胞在诱导培养的条件下能够转录表达β-酪蛋白。

关键词：牛乳腺上皮细胞细胞培养核型分析 β-酪蛋白转录

6天龄与10天龄大鼠的睾丸组织的基因差异表达

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基因组学与应用生物学 2012年第1期31卷 40-44页

作者：刘陶迪罗奋华于泊洋吴应积内蒙古大学哺乳动物生殖生物学与生物技术教育部重点实验室呼和浩特010021 内蒙古医学院基础医学院呼和浩特010050

通过基因芯片技术,利用Roche-NimbleGen公司制作的大鼠12×135K全基因组表达谱芯片,对日龄为6d和10d的大鼠睾丸组织进行全基因组表达差异分析。结果显示:具有2倍以上的差异表达基因有4298个,其中表达上调的基因共1878个,表达下调的基因... 详细信息

通过基因芯片技术,利用Roche-NimbleGen公司制作的大鼠12×135K全基因组表达谱芯片,对日龄为6d和10d的大鼠睾丸组织进行全基因组表达差异分析。结果显示:具有2倍以上的差异表达基因有4298个,其中表达上调的基因共1878个,表达下调的基因共2420个。这些差异表达的基因中有3154个基因具有基因本体注释,参与了154个生物学通路。进一步分析表明具有8倍以上差异表达的基因有13个,这些基因参与了生物学过程、细胞组分和分子功能等基因本体分类,进一步选择3个差异表达的基因,LOC686076、Cxcl6和Trib3,做了实时定量RT-PCR检测。其结果趋势与芯片数据一致。因此,我们初步认为精原干细胞的发生与增殖在大鼠早期的发育过程中已经有大量的基因参与,是一个多基因协调表达的过程。

关键词：大鼠睾丸组织精原干细胞差异表达基因芯片