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作者：纪奇峰中国人民解放军空军军医大学

学位级别：硕士

肝癌是一种常见的恶性肿瘤,发病率高,死亡率高,50%的肝癌发病和死亡发生在中国,而70～90%的原发性肝癌属于肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)。外泌体(exosome)是一种可由包括肿瘤细胞在内的多种细胞分泌的膜性囊泡,直径约为30～1... 详细信息

肝癌是一种常见的恶性肿瘤,发病率高,死亡率高,50%的肝癌发病和死亡发生在中国,而70～90%的原发性肝癌属于肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)。外泌体(exosome)是一种可由包括肿瘤细胞在内的多种细胞分泌的膜性囊泡,直径约为30～150 nm,内容物丰富,包括蛋白质、脂质和microRNA(miRNA),广泛参与了细胞间物质和信息交流。肿瘤发生时,肿瘤细胞可比正常细胞分泌更多的外泌体,并且外泌体miRNA的表达谱与正常生理条件下有较大区别,细胞可通过外泌体传递物质信息,调节肿瘤的微环境,进而影响肿瘤的发生发展。因此,外泌体中的miRNA不仅与疾病发生发展的机制相关,还可能会成为较好的早期诊断肿瘤的生物标志物。本研究旨在筛选肝细胞癌细胞系外泌体中差异表达的miRNA,探索外泌体中差异表达的miRNA对肝癌细胞功能的影响及其在肝癌诊断中的临床应用价值,本研究进行了如下四部分实验。第一部分:肝癌细胞系外泌体中差异表达microRNA的筛选目的:高通量筛选肝细胞癌细胞上清外泌体中差异表达的miRNA,为探索外泌体miRNA在肝癌发生发展中的生理病理功能及可能的生物学标志作用奠定基础。方法:收集人正常肝细胞系HL-7702、HBV阴性肝细胞癌细胞系Hep G2和HBV阳性肝细胞癌细胞系Hep 3B细胞上清,提取外泌体,流式细胞术鉴定外泌体表面标志物CD63和CD81的表达,透射电镜观察外泌体的大小与形态。通过高通量测序技术筛选差异表达的miRNAs。通过实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR,qRT-PCR)检测特定miRNAs在细胞内及外泌体中的表达。结果:透射电镜下观察到外泌体具有完整的膜结构,直径为30～150 nm。流式细胞术检测到外泌体表面标志物CD63和CD81呈阳性表达。高通量测序筛选到HCC细胞外泌体中差异表达的miRNA共28种,26种表达下调。选择其中6种差异miRNAs进行实时定量PCR验证,结果显示,此6种分子在细胞上清外泌体及细胞内的差异表达趋势与测序结果一致。结论:通过对培养细胞外泌体中的miRNA进行高通量测序,获得了一组在肝癌细胞外泌体中差异表达的miRNA分子。第二部分:差异表达miRNA对肝癌细胞生物学行为的影响目的:研究肝癌细胞外泌体中低表达的miR-98-5p、let-7f-5p和miR-196a-5p在过表达情况下对肝癌细胞增殖、迁移和侵袭能力及细胞凋亡的影响。方法:CCK8实验检测miRNAs过表达对肝癌细胞增殖的影响,划痕愈合实验检测miRNAs过表达对肝癌细胞迁移的影响,transwell实验检测miNRA过表达对肝癌细胞迁移和侵袭的影响,流式细胞技术检测miNRA过表达对肝癌细胞凋亡的影响。结果:与对照组相比,let-7f-5p过表达组的肝癌细胞增殖能力减弱,迁移和侵袭能力降低,但凋亡分数增多。结论:let-7f-5p过表达可以抑制肝癌细胞的增殖、侵袭与转移并促进肝癌细胞的凋亡。第三部分:let-7f-5p的靶基因及靶基因的生物学功能目的:预测let-7f-5p的靶基因并对其进行验证,并观察改变靶基因表达后HCC细胞的生物学行为变化。方法:利用生物信息学技术预测let-7f-5p的靶基因并从中筛选目标靶基因,通过qRT-PCR和蛋白印记(Western blot,WB)在mRNA和蛋白水平验证let-7f-5p对靶基因表达的影响。通过双荧光素酶基因检系统对靶基因进行验证。HCC细胞中敲降靶基因,通过CCK8实验、transwell实验对其增殖、迁移和侵袭进行检测,观察干扰靶基因表达后是否产生与上调let-7f-5p相似的作用。HCC细胞中共转染let-7f-5p与靶基因重组表达载体质粒,通过CCK8实验、transwell实验对其增殖、迁移和侵袭进行检测,观察共转染let-7f-5p与靶基因重组表达载体质粒后是否可以逆转let-7f-5p对HCC细胞的增殖、迁移和侵袭能力的影响。结果:利用生物信息学技术预测散乱蛋白3(dishevelled segment polarity protein 3,DVL3)为let-7f-5p靶基因。HCC细胞中过表达let-7f-5p,qRT-PCR和WB结果显示let-7f-5p在mRNA和蛋白水平抑制DVL3基因的表达。双荧光素酶基因检测系统对DVL3进行验证,结果显示let-7f-5p过表达可抑制野生型DVL3 3’-UTR报告载体的荧光活性,但是对突变型载体的荧光活性基本无明显影响。CCK8实验发现敲降DVL3后HCC细胞的增殖能力受到抑制,共转染let-7f-5p与靶基因重组表达载体质粒后HCC细胞的增殖能力得到恢复;transewell实验结果表明敲降DVL3后HCC细

关键词：肝细胞癌外泌体 miRNA let-7f-5p DVL3

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OFDM系统中峰均比降低技术的研究

OFDM系统中峰均比降低技术的研究

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作者：纪奇峰东华大学

学位级别：硕士

多载波传输系统已经应用于有线通信中,并且也是未来移动通信的候选方案。在这些多载波传输系统中,最常使用的是正交频分复用(OFDM)系统。此项技术能够有效地抵抗多径效应现象,已经成功地应用于许多高速无线数据传输系统中,但是OFDM系统... 详细信息

多载波传输系统已经应用于有线通信中,并且也是未来移动通信的候选方案。在这些多载波传输系统中,最常使用的是正交频分复用(OFDM)系统。此项技术能够有效地抵抗多径效应现象,已经成功地应用于许多高速无线数据传输系统中,但是OFDM系统有着一个主要的缺点,那就是传输信号拥有相当大的峰均功率比(PAPR)。本文首先详细描述了OFDM的发展、对OFDM的基本原理和降低其峰均比的理论进行了深入的研究,然后对限幅类、编码类以及非畸变类,这些不同的降低OFDM系统PAPR技术的性能进行了研究和比较对照,分析了它们的优缺点。在对现有的降低峰均功率比技术上深入研究的基础上,本文对于基于分组变换核方法抑制OFDM系统PAPR的算法提出了改进。基于分组变换核方法抑制OFDM系统PAPR的算法是首先对子载波进行分组,然后在进行IFFT变换后进行变换核运算,用多个信号点的幅度均值来替代某一信号点的幅值,从而降低OFDM系统的PAPR。论文在对分组变换算法中的变换核T的逆变换分析的基础上,理论证明了该变换核并不是在任何情况下都存在逆变换,由此引入了广义逆的概念,改进了这种算法,也为进一步寻找合适的变换核提出了新思路。文中给出了采用此方法的MATLAB算法仿真,结果也证明了这种算法能够有效的降低OFDM的PAPR。本文在对矩阵变换算法的深入研究的基础上,将正交Jacket矩阵、CAZAC序列和构造的矩阵T应用于矩阵变换算法,通过降低输入OFDM序列的非周期子相关性,从而降低信号的PAPR值,并将使用的三种新矩阵和现有的Hadamard矩阵和P4矩阵进行了MATLAB性能仿真比较;接着,继续提出了矩阵变换和限幅的混合算法,用MATLAB性能仿真证明了,采用此算法在不增加系统计算复杂度的基础上提高了PAPR的性能;然后,在此基础上,本文又进一步提出了基于多矩阵变换的新算法,新算法在经过IFFT变换后,将数据序列多个变换矩阵相乘,选择PAPR性能最好的一组数据序列用于传输,由于选择传送的数据符号都是PAPR最优的,从而改进了系统整体的PAPR值。仿真结果表明,采用这种新的算法能更好的抑制输入OFDM信号的PAPR值,同时也避免了采用其他算法的复杂计算。最后,本文给出了矩阵变换算法在Simulink平台下的仿真实现,并分析了其BER性能。

关键词：正交频分复用峰均功率比广义逆矩阵 Jacket矩阵 CAZAC

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基于ARM7TDMI的无线多媒体播放器

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微计算机信息 2007年第29期23卷 115-116,27页

作者：纪奇峰张宁军仇润鹤东华大学信息科学与技术学院上海201620

系统以LPC2134(核为ARM7TDMI)为核心,采用EasyARM2131开发实验板和ET44M210实验板为硬件开发平台,移植μC/OS-II操作系统进行任务调度,既可以使用2.4GHz无线模块RFW102进行无线传输,也可以使用ET44M210实验板提供的USB接口进行USB下载,... 详细信息

系统以LPC2134(核为ARM7TDMI)为核心,采用EasyARM2131开发实验板和ET44M210实验板为硬件开发平台,移植μC/OS-II操作系统进行任务调度,既可以使用2.4GHz无线模块RFW102进行无线传输,也可以使用ET44M210实验板提供的USB接口进行USB下载,然后在ARM7TDM的移动平台上实现音频和视频的播放,具有很强的移动性和实用性。

关键词： ARM7TDMI μC/OS-Ⅱ 无线传输 USB下载音频视频播放

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APOBEC3A-HBc融合蛋白的表达及活性鉴定

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细胞与分子免疫学杂志 2017年第11期33卷 1521-1528页

作者：杜娟成珊白换换纪奇峰郭晏海空军军医大学药学系药物基因组学教研室陕西西安710032 空军军医大学唐都医院输血科陕西西安710038

目的构建载脂蛋白B mRNA编辑酶催化多肽3A(APOBEC3A)与不同长度和序列的乙型肝炎病毒核心蛋白(HBc)的融合蛋白真核表达载体,研究其表达能力及融合蛋白的细胞内定位及胞嘧啶脱氨基活性。方法采用In-Fusion重组克隆方法,将含有APOBEC3A的... 详细信息

目的构建载脂蛋白B mRNA编辑酶催化多肽3A(APOBEC3A)与不同长度和序列的乙型肝炎病毒核心蛋白(HBc)的融合蛋白真核表达载体,研究其表达能力及融合蛋白的细胞内定位及胞嘧啶脱氨基活性。方法采用In-Fusion重组克隆方法,将含有APOBEC3A的PCR产物分别和含有全长HBc、四种C端截短体HBc的PCR扩增片段连接克隆入真核表达载体pc DNA3.0。将重组载体分别转染HEK293 T细胞,用免疫荧光细胞化学染色法检测融合蛋白在HEK293 T细胞中的定位,Western blot法检测融合蛋白的表达水平;尿素变性PAGE法分析融合蛋白的胞嘧啶脱氨基活性。结果构建的五种融合蛋白表达载体,可在HEK293T细胞中表达五种融合蛋白,4种含HBc截短体编码的融合蛋白表达载体比含全长HBc编码的融合蛋白载体的表达能力强;含全长HBc的融合蛋白APOBEC3A-HBc主要定位于细胞质,而含HBc截短体的融合蛋白APOBEC3AHBc144 S、APOBEC3 A-HBc144 E、APOBEC3 A-HBc144 AAA和APOBEC3 A-HBc144 A均主要定位于细胞核中;HBc截短体融合蛋白的胞嘧啶脱氨基活性高于全长HBc融合蛋白。结论成功构建APOBEC3A与不同长度和序列HBc的融合蛋白真核表达载体,APOBEC3A与全长HBc及截短体HBc的融合蛋白在表达能力、细胞内定位以及胞嘧啶脱氨基活性具有明显差异。

关键词：乙型肝炎病毒核心蛋白(HBc) 载脂蛋白B mRNA编辑酶催化多肽3A(APOBEC3A) 脱氨基活性

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PLCE1基因及rs2274223和rs3765524单体型的克隆与表达

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中国生物工程杂志 2016年第12期36卷 1-7页

作者：李达代鹏王伟张文涛汪钦束毅祝春来纪奇峰梁平颜真第四军医大学药学院西安710032

目的：克隆人PLCE1基因,构建PLCE1 rs2274223和rs3765524 GT（PLCE1 Minor）和AC（PLCE1 Major）单体型真核表达重组载体,研究PLCE1基因多态性及单体型与基因表达的相关性。方法：利用重叠延伸PCR、In-Fusion技术构建PLCE1真核表达载体... 详细信息

目的：克隆人PLCE1基因,构建PLCE1 rs2274223和rs3765524 GT（PLCE1 Minor）和AC（PLCE1 Major）单体型真核表达重组载体,研究PLCE1基因多态性及单体型与基因表达的相关性。方法：利用重叠延伸PCR、In-Fusion技术构建PLCE1真核表达载体;基于同源重组的双点突变技术改造目的基因;利用基因转染、实时定量PCR和蛋白印迹等技术实现PLCE1表达载体在真核细胞中的过表达及表达水平的鉴定。结果：成功扩增并获得了全长6 927bp的人PLCE1 cDNA并经过DNA测序证实,与NCBI数据库PLCE1参考序列（NM_016341）比较,发现编码区3 554～3 572bp处存在18bp连续碱基插入,其余序列基本匹配。成功构建了PLCE1 Minor和PLCE1 Major两种单体型重组真核表达载体,转染细胞揭示PLCE1 Minor型的mRNA转录和蛋白质表达水平均高于Major型。结论：发现了一种新的PLCE1 mRNA转录本,成功构建了2种单体型真核表达载体;发现PLCE1 rs2274223G-rs3765524T单体型能够促进自身mRNA和蛋白质表达,为进一步揭示PLCE1 SNPs与癌症易感性的关系奠定了基础。

关键词：磷脂酶C-ε1 单核苷酸多态性重叠延伸PCR 基因克隆基因表达

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Alu RNA及其突变体真核表达质粒构建以及对A549细胞活性氧簇产生的影响

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南京医科大学学报（自然科学版） 2018年第5期38卷 577-581页

作者：雷恩宇毛壮纪奇峰束毅王伟颜真空军军医大学药学院药物基因组学教研室陕西西安710032

目的:从氧化应激的A549细胞鉴定Alu RNA表达,构建Alu RNA及其2种功能缺失突变体的真核表达质粒,探讨过表达Alu RNA及其突变体对细胞氧化应激的影响。方法:设计Alu RNA特异性引物,H2O2应激A549细胞,RT-PCR扩增目的片段,通过定向克隆、点... 详细信息

目的:从氧化应激的A549细胞鉴定Alu RNA表达,构建Alu RNA及其2种功能缺失突变体的真核表达质粒,探讨过表达Alu RNA及其突变体对细胞氧化应激的影响。方法:设计Alu RNA特异性引物,H2O2应激A549细胞,RT-PCR扩增目的片段,通过定向克隆、点突变等方法构建pc DNA3.0-Alu(p Alu)重组质粒、右臂缺失突变体pc DNA3.0-Alu-left arm(p Alu-LA)、G25C突变体pc DNA3.0-Alu G25C(p Alu-M);转染A549细胞,DCFH-DA检测活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)产生水平。结果:从应激的A549细胞成功扩增了Alu分子,重组的真核表达质粒p Alu、p Alu-LA、p Alu-M经酶切及DNA测序鉴定符合预期;p Alu、p Alu-LA转染显著促进A549细胞ROS产生;与p Alu相比,p Alu-M转染诱导产生的ROS显著降低。结论:成功克隆了氧化应激刺激下A549细胞产生的Alu RNA及其2种功能缺失突变体的真核表达质粒,体外实验显示Alu RNA通过翻译水平调控促进A549细胞ROS产生。

关键词： Alu RNA 氧化应激 A549细胞基因重组活性氧簇

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肝癌患者体内乙型肝炎病毒基因组BCP/Pre C区基因突变多样性分析

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病毒学报 2017年第1期33卷 36-43页

作者：束毅王伟代鹏张文涛成珊李达纪奇峰邱荣鹤刘浩林赵文亮颜真第四军医大学药学院药物基因组学教研室西安710032 第四军医大学学员一旅五营十七连西安710032

为研究肝癌患者组织样本中HBV DNA核心启动子区(BCP区)和前C区(Pre C区)的基因突变多样性及其突变规律。收集第四军医大学附属西京医院2015年收治的192例HBV阳性的肝癌患者组织样本,PCR扩增HBV BCP/Pre C区DNA片段并进行测序分析,从测... 详细信息

为研究肝癌患者组织样本中HBV DNA核心启动子区(BCP区)和前C区(Pre C区)的基因突变多样性及其突变规律。收集第四军医大学附属西京医院2015年收治的192例HBV阳性的肝癌患者组织样本,PCR扩增HBV BCP/Pre C区DNA片段并进行测序分析,从测序失败的样本中随机抽取21例,采用构建单克隆文库后测序的方法进行分析。结果显示37.89%(72/190)的HBV阳性肝癌患者体内HBV病毒因呈现多种突变株混合感染的特点而导致PCR产物直接测序失败,经单克隆测序揭示,每一例失败样本的HBV DNA准种池中至少有2~11种突变株共同存在;突变株中缺失突变和插入突变的发生率高达80.95%;其它突变形式按照频率从高到低分别为A1762T/G1764A双突变90.48%,G1756C/T1803A/Δ(1 757~1 765)/Δ(1 824~1 832)四联突变80.95%,T1753C/A1762T/G1764A三联突变57.14%,A1762T/G1764A/G1896A三联突变42.86%,G1756C/Δ(1 757~1 765)双突变28.57%,T1753C/A1762T/G1764A/G1896A四联突变23.81%。由此可见,肝癌患者体内HBV病毒具有BCP/Pre C区DNA突变的多样性,这些缺失与插入突变是导致序列移码与PCR产物测序失败的直接原因。研究结果为HBV持续感染及基因突变检测、相关机制研究和个体化防治奠定了基础。

关键词：乙型肝炎病毒基因突变 BCP/Pre C 肝癌

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PLCE1基因及rs2274223和rs3765524单体型的克隆与表达

PLCE1基因及rs2274223和rs3765524单体型的克隆与表达

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中国生物工程学会第十届学术年会暨2016年全国生物技术大会

作者：李达代鹏王伟张文涛汪钦束毅祝春来纪奇峰颜真第四军医大学药学院药物基因组学教研室

目的:克隆人PLCE1基因,构建PLCE1 rs2274223和rs3765524 GT(PLCE1Minor)和AC(PLCE1 Major)单体型真核表达重组载体,研究PLCE1基因多态性及单体型与基因表达的相关性。方法:利用重叠延伸PCR、In-Fusion技术构建PLCE1真核表达载体;基于同... 详细信息

目的:克隆人PLCE1基因,构建PLCE1 rs2274223和rs3765524 GT(PLCE1Minor)和AC(PLCE1 Major)单体型真核表达重组载体,研究PLCE1基因多态性及单体型与基因表达的相关性。方法:利用重叠延伸PCR、In-Fusion技术构建PLCE1真核表达载体;基于同源重组的双点突变技术改造目的基因;利用基因转染、实时定量PCR和蛋白印迹等技术实现PLCE1表达载体在真核细胞中的过表达及表达水平的鉴定。结果:成功扩增并获得了全长6 927bp的人PLCE1 c DNA并经过DNA测序证实,与NCBI数据库PLCE1参考序列(NM16341)比较,发现编码区3 554-3 572bp处存在18bp连续碱基插入,其余序列基本匹配。成功构建了PLCE1 Minor和PLCE1 Major两种单体型重组真核表达载体,转染细胞揭示PLCE1 Minor型的m RNA转录和蛋白质表达水平均高于Major型。结论:发现了一种新PLCE1 m RNA转录本,成功构建了2种单体型真核表达载体;发现PLCE1rs2274223G-rs3765524T单体型能够促进自身m RNA和蛋白质表达,为进一步揭示PLCE1 SNPs与癌症易感性的关系奠定了基础。

关键词：磷脂酶C-ε1 单核苷酸多态性重叠延伸PCR 基因克隆基因表达

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茶与咖啡源性水溶性多酚的HUVEC细胞内抗氧化活性实验

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心脏杂志 2019年第2期31卷 139-143页

作者：彭子殷杨鑫张煜珅纪奇峰王伟西安交通大学附属中学陕西西安710061 空军军医大学基础医学院学员四大队陕西西安710032 空军军医大学附属一院骨科陕西西安710032 空军军医大学药学系生物制药学教研室陕西西安710032 空军军医大学药学系药剂学与药事管理学教研室陕西西安710032

目的探讨茶叶和咖啡在常饮方式下水溶性多酚对细胞氧化损伤可能的保护和修护作用。方法建立人脐静脉内皮细胞(HUVEC)、胃黏膜GES-1和胃癌SGC7901细胞的H_2O_2损伤细胞氧化应激模型,二氯荧光素二乙酸酯探针(DCFH-DA)实验检测细胞内活性氧... 详细信息

目的探讨茶叶和咖啡在常饮方式下水溶性多酚对细胞氧化损伤可能的保护和修护作用。方法建立人脐静脉内皮细胞(HUVEC)、胃黏膜GES-1和胃癌SGC7901细胞的H_2O_2损伤细胞氧化应激模型,二氯荧光素二乙酸酯探针(DCFH-DA)实验检测细胞内活性氧簇(ROS)的水平,四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法测定细胞活力,每种细胞设阴性对照组和3种茶叶两种咖啡水溶性多酚的3个浓度梯度组,评价多酚提取物对细胞氧化损伤的保护和修护作用。结果测试的3种茶叶和两种咖啡均具有HUVEC细胞内的抗ROS生成与抗细胞氧化损伤能力,活性随着浓度的增加而增强(P<0.01)。绿茶的抗氧化性能最强,其次是两种咖啡,最后是红茶与黑茶。此种细胞内抗氧化活性在GES-1和SGC7901细胞中得到重复;5种多酚类饮料均不具备修复氧化损伤细胞的能力。结论茶和咖啡的水溶性抗氧化成分可以有效进入血管内皮和胃黏膜上皮细胞,发挥清除ROS和抗细胞氧化的能力,但对于已经氧化损伤的细胞不具备修复能力。

关键词：氧化应激茶叶咖啡抗氧化内皮细胞

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肝细胞癌患者血清外泌体microRNA表达鉴定

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现代生物医学进展 2018年第22期18卷 4213-4218页

作者：纪奇峰祝春来王伟毛壮汪钦成珊颜真第四军医大学药学院药物基因组学教研室陕西西安710032 肿瘤生物学国家重点实验室陕西西安710032 第四军医大学药学院药事管理与药物信息学教研室陕西西安710032 第四军医大学学员一旅一营三连陕西西安710032

目的:探讨肝癌细胞外泌体中差异表达的microRNAs(miRNAs)在肝细胞癌(HCC)诊断中的应用价值。方法:通过高通量测序筛选肝癌细胞外泌体中差异表达的miRNAs。实时定量PCR验证差异表达分子;检测差异表达的miRNAs在健康人(Health)、慢性乙型... 详细信息

目的:探讨肝癌细胞外泌体中差异表达的microRNAs(miRNAs)在肝细胞癌(HCC)诊断中的应用价值。方法:通过高通量测序筛选肝癌细胞外泌体中差异表达的miRNAs。实时定量PCR验证差异表达分子;检测差异表达的miRNAs在健康人(Health)、慢性乙型肝炎患者(CHB)、肝硬化患者(LC)及乙型肝炎病毒阳性的肝细胞癌患者(HCC)血清外泌体中的表达。结果:高通量测序筛选到肝癌细胞外泌体中差异表达的miRNA共88种,其中58种表达上调,30种表达下调。选择其中8种差异表达的miRNAs进行q RT-PCR验证,结果显示,此8种miRNAs在细胞上清外泌体、细胞内、癌与癌旁组织中的表达趋势与测序结果一致。miR-221-3p和miR-224-5p在HCC组外泌体中的表达水平显著高于Health组、CHB组和LC组(P0.05)。结论:血清外泌体中的miR-221-3p、miR-224-5p、miR-124-3p和let-7a-5p可能成为肝细胞癌的候选标志物。

关键词：肝细胞癌外泌体 miRNAs 肿瘤标志物

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