检索结果-南通市图书馆

作者：章绍延海南大学

学位级别：硕士

马铃薯Y病毒属(Potyvirus)属于马铃薯Y病毒科(Potyviridae),是最大的RNA病毒属。根据ICTV最新分类标准,Potyvirus包含确定种146个、暂定种32个,是十分重要的植物病原,引起很多农作物和经济作物严重病害。自20世纪90年代初,陆续有文章报... 详细信息

马铃薯Y病毒属(Potyvirus)属于马铃薯Y病毒科(Potyviridae),是最大的RNA病毒属。根据ICTV最新分类标准,Potyvirus包含确定种146个、暂定种32个,是十分重要的植物病原,引起很多农作物和经济作物严重病害。自20世纪90年代初,陆续有文章报道该属病毒通用检测方法的建立及运用。但近年来,随着该属病毒种类的不断发现及其基因组测序的相继完成,原先用于设计引物的保守序列并不能适用于所有potyviruses,而使某些病毒无法检出,使检测准确度和适用性大大降低和减小。为了建立快速、灵敏、适用性广的Potyvirus通用RT-PCR检测方法,本研究对具有代表性的该属病毒进行序列同源比对,在NIb中部和CP末端分别搜索到一处保守位点,设计简并引物PotyF:5'-GTITGYGTKGAYAYTTYAAYAA-3';PotyR:5'-GTRT GBCKYTCIGTRTYYTC-3'.利用设计的引物,结合引物比例、浓度优化,建立了基于Touch-down PCR技术的检测方法。检测方法评估结果表明,该检测方法能对8种供试的potyviruses进行检测,与13种供试的常见植物无交叉反应,通用性好、特异性高,具有一定的灵敏性。利用建立的检测方法,对15个病毒疑似样品进行检测,检测出阳性样品5个。对阳性检测结果进行克隆测序,并利用BLAST比对进行病毒鉴定,从而鉴定出1种新病毒、2种病毒新寄主、3个病毒新株系和1个重组事件等。具体研究结果如下：1.感染澄迈水茄的potyvirus为水茄花叶病毒(Wild tomato mosaic virus, WTMV),与越南水茄上的WTMV-Laichau同源性最高,核苷酸、氨基酸序列同源性分别为91.1%、93.3%。感染贵州水茄的potyvirus为烟草脉带花叶病毒(Tobacco veinal binding mottle virus, TVbMV),与云南烟草上的TVbMV-YN9.1同源性最高,核苷酸、氨基酸序列同源性均为99%。这是TVbMV自然侵染水茄的首次报道。2.感染澄迈曼陀罗的potyvirus为辣椒环斑病毒(Chilli ringspot virus, ChiRSV)的2个新株系。2株系均与ChiRSV-HN/14分离物同源性最高,核苷酸同源性分别为80%、83%,氨基酸同源性依次为88%、91%。这是ChiRSV自然侵染曼陀罗的首次报道。利用ChiRSV CP简并引物对两株系CP及其侧翼序列进行测序,发现2株系CP3’末端倒数6-8位3碱基存在缺失而引起的移码,并终止于TGA。通过构建进化树、RDP分析,首次发现ChiRSV存在重组。2株系中与ChiRSV-HN/14同源性较高的ChiRSVRec是由另一个株系ChiRSVD和黄灯笼辣椒上的ChiRSVC株系重组产生的。3.该曼陀罗样品还同时感染Chilli veinal mottle virus (ChiVMV).利用分段克隆和RACE技术对该ChiVMV分离物进行了全基因组克隆,获得具有典型Potyvirus特征的部分基因组序列8067bp(不计PolyA尾)。通过CP核苷酸和氨基酸序列BLAST分析、CP和全基因组进化树构建表明该分离物是一个与已报道的ChiVMV株系差异较大的新株系。4.感染海口茉莉的potyvirus为茉莉T病毒(Jasmine virus T, JaVT)。利用分段克隆和RACE技术对该JaVT分离物进行全基因组克隆,获得具有典型Potyvirus特征的部分基因组序列8749bp(不计PolyA尾)。CP基因BLAST分析表明,该分离物与JaVT的同源性最高,核苷酸、氨基酸序列同源性分别为91%和96%。通过构建CP进化树,发现该病毒与薤花叶病毒(Scallion mosaic virus,ScaMV)和水仙晚期黄化病毒(Narcissus late season yellows virus, NLSYV)亲缘关系最近。5.感染海口长春花的potyvirus为一种新病毒,暂命名为长春花脉斑驳病毒(Catharanthus veinal mottle virus, CaVMV)。利用分段克隆和RACE技术对该新病毒进行全基因组克隆,获得接近全基因组序列9243bp(不计PolyA尾)。该序列具有典型的Potyvirus特征,但与病毒系统侵染和长距离运输相关的CCC保守结构域被ISC所替代。进化树分析表明该病毒与已报道的Potyvirus亲缘关系较远,其中CP氨基酸进化树分析表明,该病毒与鸭茅线条病毒(Cocksfoot streak virus, CSV)亲缘最较近,CP氨基酸同源性为52.98%;接近全基因组

关键词：马铃薯Y病毒属简并引物长春花脉斑驳病毒茉莉T病毒辣椒环斑病毒辣椒脉斑驳病毒水茄花叶病毒烟草脉带花叶病毒

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应用实时荧光定量PCR研究BBTV DNA1在香蕉不同组织中的含量

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热带作物学报 2014年第7期35卷 1388-1392页

作者：周朋余乃通章绍延胡加谊刘志昕海南大学农学院海南海口570228 中国热带农业科学院热带生物技术研究所农业部热带作物生物学与遗传资源利用重点实验室海南海口571101

为准确定量香蕉束顶病毒(Banana bunchy top virus,BBTV)DNA1组分在香蕉组织中的分布和含量,建立以SYBR Green-I荧光染料为标记的实时荧光定量PCR(Real Time Fluorescence Quantitative PCR)方法。利用B1-F/B1-R引物扩增海南BBTV DNA1组分并构建到pMD18T sample载体,再以B2-F/B2-R引物测定该质粒的标准曲线,其线性方程为Y=-3.247×LOG(X)+8.01,相关系数r2=0.997,扩增效率为103.2%,标准质粒检测灵敏度约为214 copies/μL。分别选取染病香蕉的嫩叶、叶鞘、假茎和球茎各100 mg,提取DNA并进行实时荧光定量PCR检测。结果表明:病株各部位均含BBTV病毒,但含量有明显差异,其中嫩叶(3.08×108 copies/mg)>叶鞘(2.50×108 copies/mg)>假茎(1.29×108 copies/mg)>球茎(1.67×107 copies/mg),呈依次递减。

关键词：香蕉束顶病毒实时荧光定量PCR 病毒含量

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辣椒环斑病毒分子检测方法的建立及应用

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热带作物学报 2012年第2期33卷 342-345页

作者：王健华章绍延龚殿张雨良刘志昕海南大学环境与植物保护学院海南儋州571737 中国热带农业科学院热带生物技术研究所农业部热带作物生物技术重点开放实验室海南海口571101

辣椒环斑病毒(Chilli ringspot virus,ChiRSV)是2007年在辣椒上发现的病毒新种,是马铃薯Y病毒属(Potyvirus)的确定种。笔者于2009年首次在海南黄灯笼辣椒上检测发现ChiRSV。根据ChiRSV保守区域设计和筛选PCR特异引物,优化退火温度,对PC... 详细信息

辣椒环斑病毒(Chilli ringspot virus,ChiRSV)是2007年在辣椒上发现的病毒新种,是马铃薯Y病毒属(Potyvirus)的确定种。笔者于2009年首次在海南黄灯笼辣椒上检测发现ChiRSV。根据ChiRSV保守区域设计和筛选PCR特异引物,优化退火温度,对PCR产物进行序列测定,建立了ChiRSV的RT-PCR检测方法。通过灵敏度测定,结果表明该方法最低可检出12.5 pg病毒RNA,灵敏度高。通过对来自海南田间的疑似辣椒病样的RT-PCR检测,证实了该方法有良好的反应特异性,亦表明ChiRSV可能已在海南扩散。

关键词：辣椒环斑病毒分子检测黄灯笼辣椒

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感染BBTV香蕉叶片cDNA文库的构建及评价

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植物研究 2013年第6期33卷 713-717页

作者：谭老喜张雨良周朋章绍延王健华张秀春刘志昕中国热带农业科学院热带生物技术研究所农业部热带作物生物学与遗传资源利用重点实验室海口571101 海南大学环境与植物保护学院海口570228

为了研究香蕉束顶病毒与香蕉寄主致病的互作分子机制，本文报道利用Make Your Own＂Mate＆Plate＂ Library System试剂盒成功构建感染BBTV香蕉叶片的cDNA文库。通过改良CTAB法提取感染BBTV香蕉叶片的总RNA，采用SMART法反转录合成双链c... 详细信息

为了研究香蕉束顶病毒与香蕉寄主致病的互作分子机制，本文报道利用Make Your Own＂Mate＆Plate＂ Library System试剂盒成功构建感染BBTV香蕉叶片的cDNA文库。通过改良CTAB法提取感染BBTV香蕉叶片的总RNA，采用SMART法反转录合成双链cDNA，经靳，酶切并去除短片段之后，与经同样酶切的pGADT7-SfiI载体连接，利用电转法将重组载体转化到大肠杆菌宿主细胞中，获得初级cDNA文库，最后以初级文库100万克隆为基数扩增，得到扩增文库并提取质粒。结果得到库容量大于2．0X10。的初级文库，检测表明文库cDNA插入片段长度主要分布在700—2000bp，文库重组率为87．5％。结果表明，该文库质量较好，可用于后续酵母双杂交互作蛋白筛选试验，本研究为开展病毒与寄主互作的研究奠定基础。

关键词：香蕉束顶病毒香蕉叶片酵母双杂交cDNA文库

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中国海南野番茄上的一种新病毒-野番茄花叶病毒

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生物技术 2015年第4期25卷 359-363页

作者：张真章绍延余乃通王健华龚殿刘志昕海南大学农学院海南海口570228 中国热带农业科学院热带生物技术研究所农业部热带作物生物学与遗传资源利用重点实验室海南海口571101

[目的]鉴定引起海南水茄叶片呈典型皱缩和轻微花叶症状的病原物。[方法]对该病样提取总RNA,反转录成第一链c DNA,然后设计WTMV(Wild tomato mosaic virus)cp基因的特异引物,再利用常规PCR方法鉴定其病原是否为WTMV。[结果]通过PCR扩增... 详细信息

[目的]鉴定引起海南水茄叶片呈典型皱缩和轻微花叶症状的病原物。[方法]对该病样提取总RNA,反转录成第一链c DNA,然后设计WTMV(Wild tomato mosaic virus)cp基因的特异引物,再利用常规PCR方法鉴定其病原是否为WTMV。[结果]通过PCR扩增获得一段约900 bp的DNA序列,包含WTMV全部CP(813 bp)蛋白基因编码区。分析表明该片段编码270个氨基酸,与WTMV-Laichua分离物核酸序列同源性为89%,氨基酸序列同源性为94%,且在所有的WTMV分离物中保守,可形成一个小的group。与其它马铃薯Y病毒属病毒的同源关系依次是PVMV、Chi VMV-Ⅰ、其它16个potyviruses(包括8个属于Chi VMV-Ⅱ的Chi VMV)。[结论]确定了引起海南水茄叶片皱缩和轻微花叶症状的病原物为野番茄花叶病毒(WTMV)。海南WTMV该分离物CP蛋白基因的Gen Bank登录号为KR781519。据我们所知,这是国内首次发现WTMV自然侵染水茄。

关键词：反转录 PCR 水茄番茄花叶病毒

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甜椒脉斑驳病毒(PVMV)在海南的发现与检测

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热带作物学报 2015年第5期36卷 966-971页

作者：梁洁王健华章绍延余乃通张雨良王祥刘志昕海南大学环境与植物保护学院海南海口570228 中国热带农业科学院热带生物技术研究所农业部热带作物生物学与遗传资源利用重点实验室海南海口571101 海南大学农学院海南海口570228

2014年在海南辣椒病毒病调查过程中发现了一种疑似病毒感染的辣椒样品,主要表现为叶片黄化、绿斑驳、叶脆易折断,且在田间发生较多。利用马铃薯Y病毒属的简并引物对其叶片总RNA进行RT-PCR检测,并将约1 700 bp目的片段克隆到p MD18-T载... 详细信息

2014年在海南辣椒病毒病调查过程中发现了一种疑似病毒感染的辣椒样品,主要表现为叶片黄化、绿斑驳、叶脆易折断,且在田间发生较多。利用马铃薯Y病毒属的简并引物对其叶片总RNA进行RT-PCR检测,并将约1 700 bp目的片段克隆到p MD18-T载体上进行测序和BLAST分析。结果表明:该条带序列(包含部分NIb和部分cp基因)与已收录的甜椒脉斑驳病毒(Pepper veinal mottle virus,PVMV)(Gen Bank登录号:FM202327)序列相似性最高,达99%。设计cp基因的特异引物,对上述样品进行cp基因扩增并构建以cp基因序列为基础的系统进化树,发现海南辣椒上的PVMV与台湾的PVMV分离物ns1株同源性最高。田间检测结果表明:海南黄灯笼辣椒上PVMV的检出率高达74.07%,说明PVMV可能成为海南辣椒生产上的潜在威胁。

关键词：辣椒病毒病 PVMV 系统进化树分析

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香蕉分化芽BBTVDAS-ELISA检测方法的建立和应用

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植物保护 2014年第5期40卷 117-120页

作者：周朋余乃通章绍延王健华胡加谊王祥梁洁刘志昕中国热带农业科学院热带生物技术研究所农业部热带作物生物学与遗传资源利用重点实验室海口571101 海南大学农学院海口570228

为了解海南海口香蕉分化芽携带香蕉束顶病毒(Banana bunchy top virus,BBTV)的情况,本研究建立了双抗夹心酶联免疫反应(DAS-ELISA)检测法,对来自海南地区组培厂的香蕉分化芽进行检测。检测结果表明,6个品种1 852个香蕉分化芽平均带毒率... 详细信息

为了解海南海口香蕉分化芽携带香蕉束顶病毒(Banana bunchy top virus,BBTV)的情况,本研究建立了双抗夹心酶联免疫反应(DAS-ELISA)检测法,对来自海南地区组培厂的香蕉分化芽进行检测。检测结果表明,6个品种1 852个香蕉分化芽平均带毒率为2.1%,其中‘皇帝蕉’为1.98%,‘粤科1号’为2.07%,‘广粉蕉’为1.98%,‘大蕉’为6.25%,‘218’为1.89%,‘巴西蕉’为2.25%。为了进一步验证ELISA结果的可靠性,随机选取12个阳性样品提取总DNA进行PCR鉴定。鉴定结果显示,12个样品中11个检测出有BBTV,表明DAS-ELISA方法的准确率较高,与分子检测结果基本一致,可以胜任日常香蕉组培苗BBTV的检测。

关键词：香蕉束顶病毒 DAS-ELISA 病毒检测

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海南辣椒病毒种类调查及分子鉴定

海南辣椒病毒种类调查及分子鉴定

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中国植物病理学会第十二届青年学术研讨会

作者：余乃通梁洁章绍延王健华刘志昕中国热带农业科学院热带生物技术研究所

＜正＞辣椒是海南冬季瓜菜主要产业之一,也是南菜北运蔬菜的主要品种之一。病毒病的发生制约海南辣椒种植业的发展。为此,我们对海南辣椒病毒病的发生情况进行调查。通过RT-PCR方法对采集的114份疑似病毒辣椒样品进行了检测,共鉴定出5...

＜正＞辣椒是海南冬季瓜菜主要产业之一,也是南菜北运蔬菜的主要品种之一。病毒病的发生制约海南辣椒种植业的发展。为此,我们对海南辣椒病毒病的发生情况进行调查。通过RT-PCR方法对采集的114份疑似病毒辣椒样品进行了检测,共鉴定出5种主要病毒,包括

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辣椒环斑病毒提纯及抗血清制备

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热带作物学报 2013年第3期34卷 534-537页

作者：章绍延王健华谭老喜周朋张雨良刘志昕海南大学环境与植物保护学院海南海口570228 中国热带农业科学院热带生物技术研究所农业部热带作物生物学与遗传资源利用重点开放实验室海南海口571101 海南大学农学院海南海口571101

为获得高效、灵敏的辣椒环斑病毒(Chilli ringspot virus,ChiRSV)多克隆抗体,通过差速离心、密度梯度离心等方法首次对辣椒环斑病毒进行了分离纯化,并将获得的高纯度病毒粒子用于免疫新西兰大白兔,制备了该病毒的多克隆抗血清。获得的... 详细信息

为获得高效、灵敏的辣椒环斑病毒(Chilli ringspot virus,ChiRSV)多克隆抗体,通过差速离心、密度梯度离心等方法首次对辣椒环斑病毒进行了分离纯化,并将获得的高纯度病毒粒子用于免疫新西兰大白兔,制备了该病毒的多克隆抗血清。获得的抗血清经间接法酶联免疫吸附测定(ID-ELISA),效价高达1∶125 000,且特异性高,与黄灯笼辣椒中另一种亲缘关系很近的同属病毒辣椒脉斑驳病毒(Chilli veinal mottle virus,ChiVMV)不发生血清交叉反应、可有效鉴别这2种Potyvirus病毒。获得的抗血清可用于ChiRSV的检测及后续实验,最适工作浓度在1∶5 000～1∶25 000之间。

关键词：辣椒环斑病毒提纯多克隆抗体酶联免疫吸附测定

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海南辣椒上Potyviruses的株系多样性分析

海南辣椒上Potyviruses的株系多样性分析

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中国植物病理学会2015年学术年会

作者：梁洁王健华章绍延余乃通张真王祥刘志昕中国热带农业科学院热带生物技术研究所农业部热带作物生物技术重点开放实验室

为澄清侵染海南辣椒的马铃薯Y病毒属病毒的株系和亲缘关系,我们克隆了多个辣椒样品上的ChiRSV、PVMV和ChiVMV 3种Potyviruses的CP基因,进行了序列多态性分析。以CP基因为基础,结合GenBank中已登录的各病毒CP基因序列,运用最大似然法,构...

为澄清侵染海南辣椒的马铃薯Y病毒属病毒的株系和亲缘关系,我们克隆了多个辣椒样品上的ChiRSV、PVMV和ChiVMV 3种Potyviruses的CP基因,进行了序列多态性分析。以CP基因为基础,结合GenBank中已登录的各病毒CP基因序列,运用最大似然法,构建各病毒的系统进化树。结果表明:ChiVMV各分离物能分成4组,分别命名为Group 1、Group 2、Group 3和Group 4,ChiVMV海南分离物之间的CP基因序列一致性大于98%,是一个株系,且属于其中的ChiVMV Group 1株系;根据系统进化树,ChiRSV海南分离物的CP基因分成两个有差异的簇,各簇内的ChiRSV CP基因序列一致性高,但簇与簇的分离物之间的CP基因序列与CP氨基酸序列一致性分别为91.6%00%,92.9%00%,因此海南辣椒上存在两个ChiRSV株系,暂命为ChiRSVⅠ组与ChiRSVⅡ组;PVMV海南分离物CP基因序列一致性大于98%,聚为一簇,属于一个PVMV株系,暂命为PVMV亚洲组。

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