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辣椒脉斑驳病毒外壳蛋白多克隆抗体的制备和应用

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福建农业学报 2024年第2期39卷 193-198页

作者：姜军李熙全代飞张福强鲁洲汪汉成史彩华方守国章松柏潘首慧农业农村部长江中游作物绿色高效生产重点实验室(部省共建)/长江大学湖北荆州434025 贵州省烟草公司安顺市公司贵州安顺561000 贵州省烟草科学研究院贵州贵阳550081

【目的】辣椒脉斑驳病毒(Chilli veinal mottle virus,ChiVMV)是茄科植物生产上危害最严重的病毒之一,也是口岸检疫的对象。本研究旨在制备特异性强的ChiVMV外壳蛋白的多克隆抗体并用于田间病株的检测。【方法】通过RT-PCR方法扩增ChiVM... 详细信息

【目的】辣椒脉斑驳病毒(Chilli veinal mottle virus,ChiVMV)是茄科植物生产上危害最严重的病毒之一,也是口岸检疫的对象。本研究旨在制备特异性强的ChiVMV外壳蛋白的多克隆抗体并用于田间病株的检测。【方法】通过RT-PCR方法扩增ChiVMV贵州烟草分离物外壳蛋白基因的全长(861 bp)和部分片段(396 bp),分别重组至原核表达载体pET28a中,转化Escherichia coli BL21后进行诱导表达,表达产物层析分离和透析纯化后免疫大耳兔制备多克隆抗体,最后使用酶联免疫吸附法(ELISA)、Western blot等方法检测抗体效价和特异性。【结果】成功制备了ChiVMV外壳蛋白的两种多克隆抗体antiCP^(1-287aa)、antiCP^(1-132aa),抗体效价分别为1∶6400、1∶12800;两种抗体antiCP^(1-287aa)、antiCP^(1-132aa)均能通过Western blot方法检测到抗原;田间病株的间接ELISA检测显示,antiCP^(1-132aa)能特异性检测ChiVMV病株,未能检测到马铃薯Y病毒(Potato virus Y,PVY)病株,而antiCP^(1-287aa)无法区分这两种病株。【结论】多克隆抗体antiCP^(1-132aa)的特异性较强,可用于ChiVMV田间病株的检测,也为ChiVMV外壳蛋白的功能研究奠定基础。

关键词：辣椒脉斑驳病毒外壳蛋白原核表达层析纯化多克隆抗体

玉米纹枯病菌中新减毒病毒RsHV4的特征研究

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河南农业科学 2024年第2期53卷 92-100页

作者：王鹏李笃花张绍辉杨孟宁安红柳方守国邓清超郭灵芳章松柏长江大学农业农村部长江中游作物绿色高效生产重点实验室(部省共建) 湖北荆州434025 长江大学农林病虫害预警与调控湖北省工程技术研究中心湖北荆州434025 长江大学化学与环境工程学院湖北荆州434023

寻找立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)中新的弱毒病毒,为玉米纹枯病提供新的生物防治资源。采用dsRNA技术从玉米纹枯病菌菌株ZYFG11中发现一种新的病毒RsHV4(Rhizoctonia solani hypovirus4),通过基因组克隆、系统发育分析、菌株生长特... 详细信息

寻找立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)中新的弱毒病毒,为玉米纹枯病提供新的生物防治资源。采用dsRNA技术从玉米纹枯病菌菌株ZYFG11中发现一种新的病毒RsHV4(Rhizoctonia solani hypovirus4),通过基因组克隆、系统发育分析、菌株生长特性测定及致病性测定等试验,对新病毒RsHV4的分类地位、减毒活性等生物学特征进行测定。结果表明,RsHV4的基因组全长为18702 nt,编码一个含5540个氨基酸的多聚蛋白(Polyprotein);系统发育分析显示,RsHV4与减毒病毒科(Hypoviridae)θ-减毒病毒属(Thetahypovirus)病毒聚为一支,其编码的蛋白质与该属的Sclerotium rolfsii hypovirus 1编码的蛋白质同源性最高,为59.46%;立枯丝核菌正常菌株JSJH6与含毒菌株ZYFG11的菌丝生长速度分别为0.50cm/d和0.41 cm/d,菌核大量形成的时间分别为培养5 d和7 d,培养10 d时50颗最大菌核的总质量分别为0.27 g和0.11 g,显示含毒菌株ZYFG11的菌丝生长速度减慢、菌核形成时间延迟、菌核体积和质量变小;接种到玉米植株2周后,接种含毒菌株ZYFG11的玉米植株第2叶鞘病斑面积占30%、第3叶鞘病斑面积占10%,接种无毒菌株JSJH6的植株第2叶鞘和第3叶鞘病斑面积达100%,说明含毒菌株ZYFG11的致病力显著降低。综上,在玉米纹枯病菌中发现了一种新的减毒病毒RsHV4,能够影响寄主真菌的生物学特征和致病力,为玉米纹枯病的防治提供了潜在的病毒资源。

关键词：立枯丝核菌真菌病毒减毒病毒科立枯丝核菌减毒病毒4 致病力玉米

黄芩苷通过促进Ⅰ型干扰素表达抑制鸡传染性支气管炎病毒复制

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畜牧兽医学报 2023年第11期54卷 4839-4850页

作者：贾艺泉于梦婷刘卫容方守国章松柏长江大学医学部荆州434023 长江大学农学院荆州434025 农业农村部长江中游作物绿色高效生产重点实验室(部省共建) 长江大学农学院荆州434025

本研究旨在探讨黄芩苷对鸡传染性支气管炎病毒(infectious bronchitis virus,IBV)的抑制作用及其作用机制。采用H1299和Vero细胞系作为供试细胞,分别在IBV感染前及感染后在细胞培养体系中加入黄芩苷(125μg·mL^(-1)),分析黄芩苷对IBV... 详细信息

本研究旨在探讨黄芩苷对鸡传染性支气管炎病毒(infectious bronchitis virus,IBV)的抑制作用及其作用机制。采用H1299和Vero细胞系作为供试细胞,分别在IBV感染前及感染后在细胞培养体系中加入黄芩苷(125μg·mL^(-1)),分析黄芩苷对IBV的抑制作用。进一步,将黄芩苷倍比稀释成不同浓度,观察不同浓度黄芩苷对IBV的抑制作用。将试验分为空白组、IBV组、病毒感染前加药组、病毒感染后加药组,利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)和Western blot技术检测各组干扰素(interferon,IFN)通路相关信号分子的mRNA和蛋白表达情况。用重组人IFN-α处理IBV组和加药组后分析各组IBV对IFN-α治疗的敏感性。以间接免疫荧光技术检测IBV组和加药组磷酸化STAT1(p-STAT1)的核移位。采用基因沉默试验分析IBV组和加药组沉默STAT1对病毒复制的影响。结果显示,黄芩苷对IBV的复制具有一定的抑制作用,并呈剂量依赖性。与对照组相比,黄芩苷处理促进干扰素通路信号分子p-IRF3、IFN-β、p-STAT1的表达水平(P<0.05),下调JAK-STAT信号通路负调控因子SOCS3和SOCS3刺激因子IL-6的表达水平(P<0.05),增加p-STAT1核移位,并增强IBV对IFN-α治疗的敏感性。进一步,沉默STAT1减弱了黄芩苷对IBV的抑制作用。综上所述,黄芩苷可通过诱导Ⅰ型干扰素产生来抑制IBV的复制,减轻病毒感染对宿主细胞造成的细胞病变效应。

关键词：黄芩苷传染性支气管炎病毒(IBV) 复制干扰素

番茄斑萎病毒侵染的西花蓟马酵母双杂交cDNA文库的构建和分析

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福建农业学报 2022年第9期37卷 1203-1208页

作者：叶倩卢冰心魏艳陈建斌刘勇张松柏章松柏郑立敏农林病虫害预警与调控湖北省工程技术研究中心(长江大学) 湖北荆州434025 湖南省农业科学院植物保护研究所湖南长沙410125

【目的】探明番茄斑萎病毒(Tomato spotted wilt tospovirus,TSWV)和介体西花蓟马(Frankliniella occidentalis)之间的分子互作关系,探索介体因子如何参与病毒侵染过程,以期为解析西花蓟马蛋白调控介体传毒机理奠定基础。【方法】通过... 详细信息

【目的】探明番茄斑萎病毒(Tomato spotted wilt tospovirus,TSWV)和介体西花蓟马(Frankliniella occidentalis)之间的分子互作关系,探索介体因子如何参与病毒侵染过程,以期为解析西花蓟马蛋白调控介体传毒机理奠定基础。【方法】通过若虫期饲毒获得高带毒西花蓟马群体,借助SMART技术构建TSWV侵染的西花蓟马酵母双杂交三框cDNA文库。【结果】3种读码框初级cDNA文库的库容量分别为3.0×10^(6)、2.0×10^(6)和2.0×10^(6) cfu,文库实际扩增基数大于1.5×10^(6) cfu(3种读码框均大于5×10^(5))。扩增文库平均插入片段主要分布在0.5~3.0 kb。对文库随机挑选16个克隆,测序后与GenBank数据库比对,结果显示各插入片段具有同源序列。【结论】构建的cDNA文库具有较高的库容量和重组率,可用于后续筛选西花蓟马与TSWV互作的蛋白。

关键词：番茄斑萎病毒西花蓟马酵母双杂交cDNA文库

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SGTR事故工况下射流行为模拟实验研究

工程热物理学报 2024年第4期45卷 955-961页

作者：陈松徽程辉成松柏中山大学中法核工程与技术学院珠海519082 哈尔滨工程大学核科学与技术学院哈尔滨150001

蒸汽发生器传热管破口(SGTR)事故属于铅冷快堆(LFR)中一类较为严重的事故。在SGTR事故工况下,二回路冷却剂水会与一回路中的高温熔融铅铋合金直接接触,从而发生强烈的相互作用。为了进一步研究水射流在熔融铅铋中的注入行为,本研究设计... 详细信息

蒸汽发生器传热管破口(SGTR)事故属于铅冷快堆(LFR)中一类较为严重的事故。在SGTR事故工况下,二回路冷却剂水会与一回路中的高温熔融铅铋合金直接接触,从而发生强烈的相互作用。为了进一步研究水射流在熔融铅铋中的注入行为,本研究设计和搭建了液体射流两相流动可视化实验平台,并进行了一系列模拟实验。研究中首先探讨了沸腾(包含闪蒸)和非沸腾工况下的射流流型演化过程及规律,并定量分析了射流注入速率对最大注入深度的影响规律,最后基于实验数据运用Froude数理论对非沸腾工况下注入速度与最大注入深度进行了分析,并获得了无量纲半经验关系式。

关键词：铅冷快堆蒸汽发生器破口事故射流注入深度射流行为

侵染湖北圆叶牵牛的甘薯曲叶病毒分子鉴定及遗传进化分析

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广东农业科学 2022年第10期49卷 96-103页

作者：罗婉笛王鹏莫翠萍蔡健和章松柏李战彪长江大学农学院/农林病虫害预警与调控湖北省工程技术研究中心湖北荆州434025 广西农业科学院植物保护研究所/农业农村部华南果蔬绿色防控重点实验室/广西作物病虫害生物学重点实验室广西南宁530007

【目的】明确湖北省荆州市1株表现黄脉的圆叶牵牛的病毒病原,为该类病害的防控提供理论依据。【方法】从湖北省荆州市采集1株表现黄脉、卷叶的圆叶牵牛植株叶片,采用双生病毒简并引物PA、PB进行PCR检测,通过分段克隆、核苷酸序列比对分... 详细信息

【目的】明确湖北省荆州市1株表现黄脉的圆叶牵牛的病毒病原,为该类病害的防控提供理论依据。【方法】从湖北省荆州市采集1株表现黄脉、卷叶的圆叶牵牛植株叶片,采用双生病毒简并引物PA、PB进行PCR检测,通过分段克隆、核苷酸序列比对分析和进化树构建等方法对获得的全长基因组序列进行比对及遗传进化分析。【结果】PCR检测结果显示,采集的样品中可扩增一条大小为363 bp的目的靶标序列,证实所采集的圆叶牵牛植株受到双生病毒的侵染;通过分段克隆的方法从阳性样品中拼接获得一条全长为2 827 bp的全基因组序列,核苷酸相似性比较发现,该序列与GenBank已登录序列的甘薯曲叶病毒(Sweet Potato Leaf Curl Virus,SPLCV)各分离物的相似性均在91%以上,其中与湖南分离物(GenBank登录号:KY783941)和江苏分离物(GenBank登录号:FJ176701)的核苷酸序列相似性分别为97.52%和96.81%,根据国际病毒分类委员会对菜豆金色黄花叶病毒属病毒种核苷酸相似性>91%为同一病毒的分类标准,确定侵染圆叶牵牛的双生病毒为SPLCV的一个分离物。进化树分析发现,该分离物(GenBank登录号:OM287440)与中国及多个亚洲分离物处于一个大分支,特别是与湖南分离物处于同一小分支,说明该研究获得的分离物与湖南分离物具有较近的亲缘关系。【结论】侵染湖北圆叶牵牛的病原为SPLCV,而该病毒可能通过种苗或烟粉虱经湖南传入。该研究为SPLCV侵染湖北牵牛花的首次报道。

关键词：湖北圆叶牵牛甘薯双生病毒甘薯曲叶病毒序列分析

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水稻矮缩病毒的检测及部分基因的比较分析

水稻矮缩病毒的检测及部分基因的比较分析

作者：章松柏福建农林大学

学位级别：硕士

水稻矮缩病毒(Ricedwarfvirus，RDV)是呼肠孤病毒科(Reoviridae)植物呼肠孤病毒属(phytoreovirus)的成员，引起水稻矮缩病。水稻矮缩病曾经给我国的水稻生产造成了严重损失，近年来在云南、福建、河南等局部地区持续流行。田间调查发现... 详细信息

水稻矮缩病毒(Ricedwarfvirus，RDV)是呼肠孤病毒科(Reoviridae)植物呼肠孤病毒属(phytoreovirus)的成员，引起水稻矮缩病。水稻矮缩病曾经给我国的水稻生产造成了严重损失，近年来在云南、福建、河南等局部地区持续流行。田间调查发现，云南、福建两地的水稻矮缩病症状存在差异。生物学接种实验排除了水稻品种引起这种差异的可能性，推测症状差异与病毒基因组差异密切相关。本文通过10％SDS-PAGE和RT-PCR并结合序列测定对福建、云南两地水稻矮缩病毒分离物差异明显的基因片段进行了分析，为进一步研究症状差异与病毒基因组差异之间的关系奠定基础。通过10％SDS-PAGE技术对福建、云南两地的7个RDV分离物基因组遗传多样性进行分析，结果表明基因组之间存在明显差异，主要体现在S2、S3、S11、S12四个基因片段上，其中S2、S3片段之间的差异与症状著异有地域上的一致性。推测这四个基因片段中的一个或几个与病毒的致病性相关。测定了部分分离物的S2、S3、S11、S12序列。分析结果表明，基因变异主要表现为点突变，大多是同类碱基的突变，既G-A或C-T，多数突变是无义突变，不引起氨基酸序列的改变，但S12片段例外，其有义突变占总突变的比例接50％，导致编码的氨基酸同源性小于核茁酸同源性，如禄劝分离物(RDV-LQ)总突变为32个，有义突变有15个，导致氨基酸的同源性(95.2％)小于核苷酸的同源性(97.0％);与已经报道的福州分离物(RDV-FZ)S2、S3、S11、S12比较，相应基因片断的结构组成一致，末端序列保守，与日本分离物(RDV-O)S11比较，中国分离物S11少31个碱基，缺失部分位于RDV-OS11非编码区588～618nt处;分离物相应片段之间有相似的进化关系，这说明RDV的变异与地理分布具有一定的相关性。在克隆RDV基因片段S12的基础上建立了从水稻叶片和介体昆虫体内快速检测水稻矮缩病毒的斑点杂交技术。实验结果表明，这种检测方法能从单头介体昆虫体内或20mg的水稻叶片中检测到水稻矮缩病毒，从而能批量处理样品，具有经济、灵敏、快速等优点。生物学接种和杂交检测的结果显示，本地介体二点黑尾叶蝉接种RDV不同地方分离物(RDV-SX、RDV-LQ)后带毒率相似(75％、84％)，但传播病毒的能力存在明显差异(3.8％、28.1％)，表明病毒分离物与介体昆虫之间的亲和性存在差异，从而影响介体昆虫的传播效率。

关键词：水稻矮缩病毒 S2、S3、S11、S12 10%SDS-PAGE 分子变异序列分析斑点杂交二点黑尾叶蝉

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荆州地区3种林木白粉病病原的检测鉴定

长江大学学报(自然科学版) 2023年

作者：郑郧王鹏章松柏彭小琴陈苗苗郭灵芳长江大学农学院湖北省农林病虫害预警与调控工程技术研究中心(长江大学) 长江大学化学与环境工程学院湖北省松滋市农业农村科技服务中心

为了给湖北省荆州地区臭椿(Ailanthus altissima)、枫杨(Pterocarya stenoptera)及桑(Morus alba3种林木植物白粉病的防治提供科学依据,通过闭囊壳显微形态特征、r DNA-ITS序列测定与比较以及进化关系分析鉴定了臭椿白粉病、枫杨白粉病... 详细信息

为了给湖北省荆州地区臭椿(Ailanthus altissima)、枫杨(Pterocarya stenoptera)及桑(Morus alba3种林木植物白粉病的防治提供科学依据,通过闭囊壳显微形态特征、r DNA-ITS序列测定与比较以及进化关系分析鉴定了臭椿白粉病、枫杨白粉病以及桑里白粉病和桑表白粉病的病原。结果显示:臭椿白粉菌、枫杨白粉菌和桑里白粉菌的闭囊壳形态表现为球针壳属(Phyllactinia)白粉菌有性世代特征,桑表白粉菌的闭囊壳形态表现为白粉菌属(Erysiphe)白粉菌有性世代特征;臭椿白粉病、枫杨白粉病、桑里白粉病和桑表白粉病的病原的r DNA-ITS部分序列的登录号分别为MG917729.1、MG917728.1、MG917731.1和KY910120.1。综合r DNA-ITS序列比较和进化分析,荆州地区臭椿白粉病、枫杨白粉病、桑里白粉病和桑表白粉病的病原分别鉴定为臭椿球针壳白粉菌(P.ailanthi)、胡桃球针壳白粉菌(P.juglandis)、桑生球针壳白粉菌(P.moricola)、桑白粉菌(E.mori)。

关键词：白粉病病原闭囊壳进化分析

基于基因组序列分析的烟草轻绿花叶病毒江苏辣椒分离物侵染性克隆构建

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中国农业科学 2023年第8期56卷 1494-1502页

作者：高晓晓涂丽琴杨柳刘亚楠高丹娜孙枫李硕章松柏季英华江苏省农业科学院植物保护研究所长江大学农学院/农林病虫害预警与调控湖北省工程技术研究中心

【目的】烟草花叶病毒属（Tobamovirus）是危害辣椒、烟草等茄科作物的主要病毒之一，严重影响蔬菜作物的种植和生产。本研究旨在探明侵染江苏省南京市辣椒的烟草轻绿花叶病毒（tobacco mild green mosaic virus,TMGMV）分离物（TMGMV-J... 详细信息

【目的】烟草花叶病毒属（Tobamovirus）是危害辣椒、烟草等茄科作物的主要病毒之一，严重影响蔬菜作物的种植和生产。本研究旨在探明侵染江苏省南京市辣椒的烟草轻绿花叶病毒（tobacco mild green mosaic virus,TMGMV）分离物（TMGMV-JS）的基因组结构特征、系统进化关系及其致病性，为TMGMV的防控提供科学依据。【方法】从江苏省南京市采集的辣椒病样，提取总RNA，利用TMGMV特异检测引物确认阳性后，设计病毒特异性全长引物扩增TMGMV-JS全基因序列，通过同源重组的方法克隆至pCB301植物表达载体上，获得TMGMV-JS分离物基因组序列和全长cDNA侵染性克隆。BLAST分析TMGMV-JS分离物与已报道分离物的同源性，利用MEGA7软件的邻接法进行系统进化分析。将侵染性克隆通过农杆菌浸润本氏烟和辣椒，经RT-PCR和Western blot检测验证侵染效果，测定TMGMV-JS分离物的致病性。【结果】侵染江苏省南京市辣椒的TMGMV全长序列为6 356 nt，编码4个功能蛋白，分别为126K复制相关蛋白、183K复制酶、运动蛋白MP和外壳蛋白CP。同源性分析结果显示TMGMV-JS与重庆分离物TMGMV-TN29(MF139550)同源性最高，厦门分离物（JX534224）次之，系统进化分析结果也显示TMGMV-JS与其他TMGMV聚于同一大分支，其中与重庆、厦门两个分离物在同一小分支，相对近缘。构建的pCB301-TMGMV-JS侵染性克隆载体可以系统侵染本氏烟，引起叶片黄化，植株系统性坏死；也可以系统侵染辣椒，引起叶片斑驳、卷曲和植株矮化等症状。【结论】侵染江苏省南京市辣椒的TMGMV-JS分离物基因组全长6 356 nt，与国内重庆、厦门TMGMV分离物具有较近的亲缘关系，同属于一个分支；构建的TMGMV-JS侵染性克隆可以系统侵染本氏烟和辣椒，在本氏烟上会导致系统性坏死。

关键词：烟草轻绿花叶病毒分子特征侵染性克隆致病性分析