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双歧杆菌原生质体的制备及serpin缺失株的构建

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双歧杆菌原生质体的制备及serpin缺失株的构建

作者：章昭琳南昌大学

学位级别：硕士

Serpin （serine protease inhibitor）是一种多肽类丝氨酸蛋白酶抑制剂的总称,出350至500个氨基酸组成。2006年研究发现长双歧杆菌的菌体表面存在着Serpin,能够保护菌体抵抗外源蛋白酶的消化,为其粘附定植肠道提供前提条件。目前,Serpi... 详细信息

Serpin （serine protease inhibitor）是一种多肽类丝氨酸蛋白酶抑制剂的总称,出350至500个氨基酸组成。2006年研究发现长双歧杆菌的菌体表面存在着Serpin,能够保护菌体抵抗外源蛋白酶的消化,为其粘附定植肠道提供前提条件。目前,Serpin蛋白对双歧杆菌物质代谢,繁殖扩增等方面的影响不甚清楚。在前期研究中,本实验室筛选到一株产Serpin蛋白的婴儿双歧杆菌,证实原核克隆表达的Serpin蛋白能有效抑制糜蛋白酶和胰弹性蛋白酶的活性,并促进双歧杆菌体外粘附细胞;本研究拟通过导入置换型打靶载体,构建基因缺失株的方法,进一步研究表面蛋白Serpin的功能。然而由于双歧杆菌的细胞壁过厚,外源基因导入困难,导致转化效率极其低下,因此本研究一方面要获得高活力的双歧杆菌原生质体,另一方面通过原生质体转化及同源重组获得serpin基因缺失株。双歧杆菌原生质体制备的文献报道甚少,本文分别评价了多种因素（生长状态、酶解浓度、时长、温度以及不同渗透压稳定剂等）对长双歧杆菌原生质体制备的影响,获得了长双歧杆菌WBL001原生质体制备及再生的优化条件：菌体处于对数中期（OD600为2.0）,以棉子糖溶液（SMM）为原生质体稳定液,5mg/L变溶菌素,37℃孵育30min,原生质体生成率和再生率分别达到81%和48%,目前报道中革兰氏阳性菌的原生质体再生率在30%左右。在此基础上,通过原生质体的PEG介导转化,将构建的双歧杆菌serpin的置换型打靶载体UPD导入双歧杆菌,成功构建了serpin缺失株,并对缺失株的体外细胞粘附能力进行了分析研究,发现serpin缺失对双歧杆菌的黏附没有明显影响。综上所述,本文通过构建原生质体转化体系,成功实现了serpin的敲除,为研究益生菌的功能蛋白提供了方法学参考。

关键词：双歧杆菌 Serpin 基因敲除原生质体

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双歧杆菌原生质体的制备及其转化系统的建立

食品与发酵工业 2012年第6期38卷 61-65页

作者：万翠香章昭琳王报贵魏华南昌大学食品科学与技术国家重点实验室江西南昌330047 南昌大学中德联合研究院江西南昌330047

考察了长双歧杆菌WBL001菌体生长状态、酶解浓度、时长、温度以及不同渗透压稳定剂等因素,获得长双歧杆菌WBL001原生质体制备及再生的优化条件:长双歧杆菌以3%接种量活化至MRS培养基,培养至对数中期(OD600∶1),5μg/mL变溶菌素,37℃孵育... 详细信息

考察了长双歧杆菌WBL001菌体生长状态、酶解浓度、时长、温度以及不同渗透压稳定剂等因素,获得长双歧杆菌WBL001原生质体制备及再生的优化条件:长双歧杆菌以3%接种量活化至MRS培养基,培养至对数中期(OD600∶1),5μg/mL变溶菌素,37℃孵育30 min,以原生质体稳定液SMM为反应缓冲液,原生质体生成率达到81%,其再生率达到48%;在此基础上,通过聚乙二醇PEG融合,将穿梭表达载体pBAX转入双歧杆菌原生质体,成功建立双歧杆菌转化体系。

关键词：双歧杆菌原生质体再生变溶菌素转化

(E)-N-取代亚甲基-3-[4-(吡啶-4-基)嘧啶-2-基]氨基苯甲酰肼衍生物的设计、合成及抗结肠癌活性研究

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中国药学杂志 2023年第23期58卷 2145-2156页

作者：彭琴玮盛含晶何凤明赵俊明邵玲莉章昭琳胡鸿雨浙江师范大学行知学院浙江兰溪321100 厦门大学药学院福建厦门361102 金华职业技术学院浙江金华321007

目的设计合成(E)-N-取代亚甲基-3-[4-(吡啶-4-基)嘧啶-2-基]氨基苯甲酰肼衍生物,并对其抗癌的活性进行研究。方法3-氨基苯甲酸乙酯为起始原料,通过4步反应合成了一系列目标化合物7a~7p,并通过^(1)H-NMR、^(13)C-NMR和HRMS对所有目标化... 详细信息

目的设计合成(E)-N-取代亚甲基-3-[4-(吡啶-4-基)嘧啶-2-基]氨基苯甲酰肼衍生物,并对其抗癌的活性进行研究。方法3-氨基苯甲酸乙酯为起始原料,通过4步反应合成了一系列目标化合物7a~7p,并通过^(1)H-NMR、^(13)C-NMR和HRMS对所有目标化合物进行了结构鉴定。采用MTT法、免疫印迹法、细胞侵袭实验、损伤愈合实验和EdU染色试剂检测了合成化合物对于结肠癌细胞生长的抑制作用。结果目标化合物对于结肠癌细胞的生长具有一定的抑制活性,其中化合物7m活性最优,其抑制结肠癌细胞系HT-29和RKO的IC50值分别为(1.04±0.16)和(1.54±0.20)μmol·L^(-1),且7m对正常结肠上皮细胞的毒性较小(IC_(50)>100μmol·L^(-1))。此外,7m能与Nur77结合,并以浓度依赖的方式抑制结肠癌细胞中Nur77和p-mTOR蛋白的表达。进一步研究表明化合物7m能以Nur77依赖的方式抑制结肠癌细胞的EMT进程。结论该系列化合物具有较好的抗结肠癌的活性,具有进一步研究的意义。

关键词：苯甲酰肼衍生物结肠癌上皮间质转化细胞增殖孤儿核受体磷酸化雷帕霉素靶蛋白

两歧双歧杆菌中serpin基因的克隆、表达与功能分析

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中国生物工程杂志 2011年第2期31卷 38-42页

作者：叶若松黎鹏章昭琳万翠香崔佳魏华南昌大学食品科学与技术国家重点实验室南昌330047

从Bifidobacterium bifidum WBBI02基因组中克隆了serpin基因片段,构建了重组Serpin蛋白的原核表达体系,实现了Serpin的表达与纯化。纯化的Serpin蛋白进行了抑制肠道蛋白酶活性检测,以及对双歧杆菌粘附作用影响的显微观察研究。结果表明... 详细信息

从Bifidobacterium bifidum WBBI02基因组中克隆了serpin基因片段,构建了重组Serpin蛋白的原核表达体系,实现了Serpin的表达与纯化。纯化的Serpin蛋白进行了抑制肠道蛋白酶活性检测,以及对双歧杆菌粘附作用影响的显微观察研究。结果表明:WBB I02中长度为768 bp的serpin基因序列,与GENEBANK中Bifidobacterium longum NCC2705serpin序列同源性为99.9%。原核表达载体pBX2-WBBI02表达的Serpin能有效地抑制糜蛋白酶和胰弹性蛋白酶的活性,最高抑制率分别为90%和97%,显微观察结果证实Serpin能促进双歧杆菌对HT-29细胞的粘附。

关键词：双歧杆菌 Serpin 克隆表达粘附

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高黏附力双歧杆菌的筛选与鉴定

中国乳品工业 2012年第5期40卷 13-15,33页

作者：万翠香章昭琳王报贵魏华甘艳云南昌大学食品科学与技术国家重点实验室南昌330047 南昌大学中德联合研究院南昌330047 江西省新余市农业局江西新余338000

利用体外细胞培养法,从实验室现有的10株双歧杆菌中筛选具有较强粘附能力的菌株。采用革兰氏染色法和平板计数法,评价了这10株双歧杆菌对HT-29细胞的粘附性能,通过测定这10株双歧杆菌的16S rRNA基因序列(16S rDNA)进行分类学鉴定。结果... 详细信息

利用体外细胞培养法,从实验室现有的10株双歧杆菌中筛选具有较强粘附能力的菌株。采用革兰氏染色法和平板计数法,评价了这10株双歧杆菌对HT-29细胞的粘附性能,通过测定这10株双歧杆菌的16S rRNA基因序列(16S rDNA)进行分类学鉴定。结果显示,WBBI01,WBBI02,WBIN03,WBBI06具有极强的黏附力,其黏附指数分别达1.97×103,2.17×103,3.57×103,1.88×103。经16S rDNA测序鉴定WBBI01,WBIN03,WBBI06均与两歧双歧杆菌S17有极高的同源性,而WBBI02属于长双歧杆菌。结果表明,双歧杆菌黏附性能具有明显的种属特异性,不同种属双歧杆菌的粘附能力相差极大,以两歧双歧杆菌的黏附性能最强,婴儿长双歧杆菌为最弱。

关键词：益生菌 16S rDNA 黏附双歧杆菌黏附指数

(E)-N′-芳基亚甲基-4-(4-苯基嘧啶-2-基氨基)苯甲酰肼衍生物作为CDK9抑制剂的设计合成及抗HIV-1活性研究

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中国药学杂志 2022年第19期57卷 1601-1610页

作者：祝科宇赵胜贤何凤明郑筱翔阳学文章昭琳胡鸿雨浙江师范大学行知学院浙江兰溪321100 浙江普洛得邦制药有限公司浙江东阳322118 厦门大学药学院福建厦门361102 浙江师范大学化学与生命科学学院浙江金华321004

目的设计合成(E)-N′-芳基亚甲基-4-(4-苯基嘧啶-2-基氨基)苯甲酰肼衍生物,并对其抗HIV-1的活性进行研究。方法4-氨基苯甲酸乙酯为起始原料,通过5步反应合成了目标化合物,采用荧光素酶(luciferase)报告基因检测了合成化合物对于HIV-1转... 详细信息

目的设计合成(E)-N′-芳基亚甲基-4-(4-苯基嘧啶-2-基氨基)苯甲酰肼衍生物,并对其抗HIV-1的活性进行研究。方法4-氨基苯甲酸乙酯为起始原料,通过5步反应合成了目标化合物,采用荧光素酶(luciferase)报告基因检测了合成化合物对于HIV-1转录抑制活性。结果目标化合物对于HIV-1的转录具有一定的抑制活性。其中化合物7p活性最优,在2μmol·L^(-1)浓度下HIV-1转录抑制率为(73±0.05)%,在20μmol·L^(-1)浓度下HIV-1转录活性为(90±0.01)%。进一步研究表明,化合物7p以浓度依赖性在NH1和NH2细胞中抑制HIV-1的转录活性以及下调RNA聚合酶ⅡCTD二号位丝氨酸磷酸化。最后,分子对接表明化合物7p与CDK9有很强的结合作用。结论该系列化合物具有较好的抗HIV-1的活性,具有进一步研究的意义。

关键词：苯甲酰肼衍生物 CDK9抑制剂抗HIV活性

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独立学院实验室安全管理的探索与实践

山东化工 2021年第16期50卷 225-227页

作者：章昭琳陶剑波盛含晶浙江师范大学行知学院浙江金华321109

阐述了独立院校进行实验室安全管理的重要性和必要性,针对管理体系、实验室管理制度、安全常态化、仪器设备管理、危险化学品管理和废弃物管理6个方面探索了本院实验室的安全管理体系。目前,各大高校都在实验室安全管理方面进行了研究... 详细信息

阐述了独立院校进行实验室安全管理的重要性和必要性,针对管理体系、实验室管理制度、安全常态化、仪器设备管理、危险化学品管理和废弃物管理6个方面探索了本院实验室的安全管理体系。目前,各大高校都在实验室安全管理方面进行了研究和实践,但是独立学院的相关研究实践还比较少,本文这一探索和实践不仅具备新颖性,在运行该体系后,确实有效地降低了实验室的安全风险,减少了安全事故隐患,为本院的科研与人才培养工作提供了保障。

关键词：独立学院实验室安全管理

Serpin多抗制备和产Serpin的双歧杆菌菌株的初步筛选

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食品与生物技术学报 2011年第6期30卷 934-939页

作者：崔佳万翠香杨友均黎鹏魏华章昭琳徐迪徐锋李波食品科学与技术国家重点实验室南昌大学江西南昌330047 南昌大学中德联合研究院江西南昌330047

从长双歧杆菌WBL001基因组中克隆了serpin基因,构建重组Serpin蛋白的原核表达体系pBX2-serpin,纯化表达产物作为抗原,免疫小鼠制备Serpin的多克隆抗体。采用偶联Serpin的磁珠纯化多克隆抗体,并探究了不同溶剂对抗体洗脱效率的影响。纯... 详细信息

从长双歧杆菌WBL001基因组中克隆了serpin基因,构建重组Serpin蛋白的原核表达体系pBX2-serpin,纯化表达产物作为抗原,免疫小鼠制备Serpin的多克隆抗体。采用偶联Serpin的磁珠纯化多克隆抗体,并探究了不同溶剂对抗体洗脱效率的影响。纯化的多抗用于斑点杂交筛选产Serpin蛋白的菌株。结果表明:磁珠纯化多克隆抗体以1 mol/L NaOH的洗脱率最高,达50%;纯化后的Serpin抗体消除了与部分乳酸菌和致病菌的非特异性反应;采用斑点杂交方法从11株双歧杆菌中筛选到婴儿双歧杆菌WBAN07具有类Serpin蛋白。

关键词：长双歧杆菌WBL001 serpin 纯化抗血清斑点杂交

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基于单元知识结构化的小学语文群文阅读教学

语文建设 2024年第18期 29-33页

作者：刘腾琳童文昭福建省长汀县汀州小学福建省长汀县第一中学

群文阅读教学是单元整体教学在语文阅读教学中的一种重要应用形式，其目标之一是促进语文知识的结构化，提高学生的语言文字综合理解水平和运用能力，落实语文阅读素养的培育要求。基于知识的学习是一个由内化到外显的过程，知识的结构... 详细信息

群文阅读教学是单元整体教学在语文阅读教学中的一种重要应用形式，其目标之一是促进语文知识的结构化，提高学生的语言文字综合理解水平和运用能力，落实语文阅读素养的培育要求。基于知识的学习是一个由内化到外显的过程，知识的结构化过程也可据此划分为本体结构化、认知结构化和实践结构化三个阶段。在这三个阶段的结构化过程中，知识从客体化向主体化、素养化逐步进阶，最终完成由知识到素养的转化。为有效促进这三个阶段的结构化，根据群文阅读教学的一般流程，本文从议题设置、文本组织和集体建构三个方面提出了相应的结构化教学策略。

关键词：小学语文单元教学知识结构化群文阅读阅读教学