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植物病原真菌拮抗菌株的筛选与几丁质酶基因的克隆

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植物病原真菌拮抗菌株的筛选与几丁质酶基因的克隆

作者：窦桂铭海南大学

学位级别：硕士

植物病害,尤其是由真菌病原菌引起的真菌病害,一直都是农林业生产中的一个非常棘手的问题,给人类造成了巨大的损失。目前,对植物真菌病害防治还没有行之有效和安全的方法。研究发现,植物内生菌对植物病原菌有较好的抑制作用,并且已引起... 详细信息

植物病害,尤其是由真菌病原菌引起的真菌病害,一直都是农林业生产中的一个非常棘手的问题,给人类造成了巨大的损失。目前,对植物真菌病害防治还没有行之有效和安全的方法。研究发现,植物内生菌对植物病原菌有较好的抑制作用,并且已引起生物防治研究者的高度关注。本实验以药用植物内生菌为研究对象,通过平板对峙等抑菌实验,筛选对植物真菌病害病原菌有抑制作用的拮抗菌株,检测拮抗菌株的几丁质酶等几种酶的活性,并对植物内生菌的几丁质酶基因进行克隆、序列分析及外源表达载体构建,以期为植物真菌病害的生物防治和为植物基因工程育种提供多元化的外源功能基因方面提供丰富的微生物资源。实验的结果如下：1、采用选择性分离法,从27种药用植物材料中分离获得了412株植物内生菌。利用平板"cross-plug"法,检测了分离获得的412株植物内生菌对栗疫菌(板栗疫病病原菌)、小穴壳菌(苹果轮纹病病原菌)的抑菌活性。结果表明,其中94株菌对两种病原菌表现出不同程度的抑菌活性,占分离总菌株的22.82%。其中有48株表现出很好的抑菌效果(抑菌半径≥1.Ocm),而且有1株菌(1号菌)的抑菌半径达到了2.0cm,表现出很强的抑菌效果。抑菌谱分析表明,其中有18株对一种指示菌有抑制效果,19株对两种指示菌有抑制效果,11株对三种指示菌有抑制效果,12株对四种指示菌有抑制效果,5株对五种指示菌均有抑制效果。为生物防治和基因工程育种提供了丰富的菌种资源。2、16SrDNA序列分析结果表明：本实验分离得到的植物内生菌显示出来很丰富的多样性。94株拮抗菌株中链霉菌属Streptomyces,总共51株,占拮抗菌株的54.26%;芽孢杆菌属Bacillus共有14株,占拮抗菌株的14.89%;假单胞菌属Pseudomonas共有11株,占拮抗菌株的11.70%;棒状杆菌属Microbacterium共有5株,占拮抗菌株的5.32%;募养单胞菌属Stenotrophomonas和赖氨酸芽孢杆菌属Lysinibacillus各有3株,分别占拮抗菌株的3.19%;苍白杆菌属Ochrobactrum、根瘤菌属Rhizobium和短杆菌属Brevibacterium各有2株,分别占拮抗菌株的2.13%。聚类分析结果表明：编号为80、82和88的菌株与亲缘关系最近的种的相似度小于99%,通过构建系统发育树,它们形成了独特的亚种。3、拮抗菌株酶活性检测结果表明：94株拮抗菌株的几丁质酶和葡聚糖酶活性具有较大的差异。茯苓粉培养基筛选到33株产葡聚糖酶的活性菌株,并检测到有葡聚糖活性,但由于透明圈大小并不明显,活性很弱;55株菌含有编码聚酮合成酶的基因,占拮抗菌株的58.5%;目前所得的结果表明实验筛得的拮抗菌株在植物真菌病害的生物防治和植物基因工程育种方面具有很大的潜力。胶体几丁质培养基筛选到23株产几丁质酶的活性菌株,其中有7株菌株的单位菌落透明圈大小达到2.0以上,15号和60号菌株更是达到3.0以上,几丁质酶活性很强。4、利用TAIL PCR技术,成功地从36号拮抗菌中克隆了几丁质酶基因,序列分析表明,该基因的总长度为1878bp,编码623个氨基酸的几丁质酶基因开放阅读框,前47个氨基酸为信号肽。BLAST分析结果表明：与该基因碱基序列同源性最高的是菌株S. griseus几丁质酶基因(Chi Ⅲ),同源性为91%,氨基酸序列同源性最高的是菌株S.griseus几丁质酶(Chi Ⅲ),同源性为86%。5、成功地构建了PET-22b(+)几丁质酶基因的表达质粒,为后期进一步将几丁质酶基因导入植物细胞进行表达以及植物基因工程育种,提供了理论依据和实践基础。

关键词：植物内生菌拮抗菌株抑菌谱几丁质酶基因

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板栗果实内生真菌群落组成及分化特征

林业科学研究 2022年第4期35卷 9-22页

作者：闾星窦桂铭汪慧华李如华江泽平李志朋严东辉中国林业科学研究院森林生态环境与自然保护研究所国家林业和草原局森林保护学重点实验室北京100091 北京农业职业学院食品与生物工程系北京100085 北京市怀柔区园林绿化局北京101400

[目的]探明果实内生真菌群落结构组成和多样性是了解果实健康微生物组功能和机制的基础。[方法]采用高通量测序技术和传统组织分离方法,对6个板栗品种的健康果实及其果肉(子叶)和果壳(含种皮)组织的内生真菌群落进行了多样性和组成分析... 详细信息

[目的]探明果实内生真菌群落结构组成和多样性是了解果实健康微生物组功能和机制的基础。[方法]采用高通量测序技术和传统组织分离方法,对6个板栗品种的健康果实及其果肉(子叶)和果壳(含种皮)组织的内生真菌群落进行了多样性和组成分析。[结果]6个品种的果实及其2个组织共36个样本总共产生3229205条高质量序列,注释出真菌1557个OTUs,分属10个门,38个纲,97个目,203个科,350个属。板栗果实中子囊菌门Ascomycota(平均相对丰度80.40%)丰度最高,其次为担子菌门Basidiomycota(平均相对丰度7.70%),优势纲为粪壳菌纲Sordariomycetes(平均相对丰度43.00%)和酵母纲Saccharomycetes(平均相对丰度15.10%)。品种间共有(Shared)真菌类群富集在座囊菌纲Dothideomycetes上,其丰度>90%。板栗果实品种间,子囊菌门在每一个品种中同样体现为最丰富类群,相对丰度为57.96%~90.15%,其次为担子菌门,相对丰度为3.28%~23.71%;纲水平上,优势类群出现变化,酵母菌纲真菌相对丰度(39.21%)在毛板红品种中是最高的,而粪壳菌纲真菌是另外5个板栗品种中最丰富类群(29.47%~59.56%)。果实组织间,果肉组织较之果壳具有更高的特有真菌多样性,果肉组织特有优势类群全部为担子菌,尤其是银耳纲Tremellomycetes的红菇目Russulales。LEfSe分析显示,果壳和果肉组织存在显著性差异群落组成或种群,镰孢属Fusarium、梅奇酵母属Metschnikowia、迈耶氏酵母属Meyerozyma和德巴利酵母属Debaryomyces真菌在果肉组织中具有显著优势。采用人工培养方法共获得有效菌株2346株,分属子囊菌、担子菌和毛霉菌门Mucoromycota。除酵母菌类需特殊培养基筛选外,可培养方法显示果实及其果壳、果肉上的真菌优势类群,在群落组成和丰度上与高通量测序技术结果相似。[结论]板栗果实具有丰富的以子囊菌粪壳菌纲和酵母菌纲为优势类群的内生真菌群落组成和种群多样性,但建群种类主要来自座囊菌纲。板栗果实品种间的内生真菌群落组成结构具有明显差异。板栗果肉较之果壳组织有更为丰富的特有内生真菌多样性。板栗果肉和果壳组织内生真菌群落组成具有明显分化。本文系统报道了板栗果实内生真菌组的组成结构,为利用板栗健康微生物组防控果实病害和了解坚果类果实微生物组提供了基础。

关键词：板栗果实内生真菌组多样性子叶果皮非培养技术

植物内生链霉菌Streptomyces sp.SAT1的基因组测序和比较基因组分析

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微生物学通报 2021年第9期48卷 3039-3053页

作者：王莎窦桂铭马玉超北京林业大学北京100089 中国林业科学研究院北京100089

【背景】一直以来,链霉菌都是活性物质的主要生产者,近年来随着抗生素滥用引起的环境和微生物抗药性问题越发严重,挖掘高效生物防治因子和新型抗生素成为了解决以上问题的重要手段。【目的】通过获得植物内生链霉菌SAT1全基因组序列和... 详细信息

【背景】一直以来,链霉菌都是活性物质的主要生产者,近年来随着抗生素滥用引起的环境和微生物抗药性问题越发严重,挖掘高效生物防治因子和新型抗生素成为了解决以上问题的重要手段。【目的】通过获得植物内生链霉菌SAT1全基因组序列和次级代谢基因簇信息,利用比较基因组学和泛基因组学分析SAT1菌株的特殊性以及与其他链霉菌的共性,为阐明SAT1抑菌和内生机制提供理论基础,为揭示链霉菌的生态功能提供可靠数据。【方法】通过三代测序平台PacBio Sequel完成SAT1基因组测序,利用生物信息学技术进行注释和功能基因分类;分别利用RAxML和PGAP软件进行系统发育树的构建和泛基因组分析;次级代谢基因簇的预测和分析通过antiSMASH网站完成。【结果】获得SAT1菌株的全基因组完成图,该菌线性染色体长度约7.47 Mb,包含有4个质粒,GC含量近73%,共预测到7550个蛋白编码基因,含有37个次级代谢基因簇,分属29个类型,其中默诺霉素基因簇与加纳链霉菌具有较高相似性。42株代表链霉菌中,单个菌株次级代谢基因簇数量为20-55个,主要类型为PKS类、Terpene类和Nrps类,而且含有大量杂合基因簇,各个菌株中特有基因数目较为庞大。【结论】链霉菌SAT1菌株在基因组特点以及次级代谢基因簇的数量和类型上与其余41株链霉菌具有一定的共性,其中潮霉素B基因簇和默诺霉素基因簇合成的相关物质可能与SAT1抑菌活性密切相关。42株链霉菌中次级代谢基因簇数量的多少与基因组大小成正相关,同时大量杂合基因簇以及庞大的特有基因数目的存在说明链霉菌在长期进化过程中存在了很高程度的水平基因转移现象,可能具有重要的生态功能。

关键词：链霉菌全基因组测序次级代谢基因簇比较基因组

生防链霉菌SAT1的分离、鉴定及其对辣椒疫霉的生物防治潜力

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广东农业科学 2014年第19期41卷 75-79,85页

作者：刘晓瑜窦桂铭马玉超北京林业大学生物科学与技术学院北京100083 北京林业大学林学院北京100083

辣椒疫霉引起的植物病害使农业遭受了巨大的经济损失,环保、经济实用的混合微生物菌剂防治策略是当前的最新发展趋势。试验从6种药用植物分离得到15株植物内生菌,平板拮抗实验筛选得到拮抗链霉菌SAT1,经鉴定为Streptomyces anandii,其... 详细信息

辣椒疫霉引起的植物病害使农业遭受了巨大的经济损失,环保、经济实用的混合微生物菌剂防治策略是当前的最新发展趋势。试验从6种药用植物分离得到15株植物内生菌,平板拮抗实验筛选得到拮抗链霉菌SAT1,经鉴定为Streptomyces anandii,其发酵液粗提物和挥发性物质对辣椒疫霉菌丝生长有明显抑制作用。接种链霉菌SAT1的孢子液可提高辣椒苗对辣椒疫霉的抗性并明显促进辣椒苗的生长。

关键词：辣椒疫霉植物内生菌生物防治

板栗果实的内生真菌群落组成及在组织中的分化

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板栗果实的内生真菌群落组成及在组织中的分化

耐酸、耐热普鲁兰酶产生菌的筛选及酶学性质研究

中国菌物学会2023年学术年会

作者：闾星窦桂铭汪慧华李如华李志朋严东辉中国林业科学研究院森林生态环境与自然保护研究所北京农业职业学院食品与生物工程系北京市怀柔区园林绿化局

以来自辽宁、河北、山东、安徽、浙江和江西等板栗主产区或产区当年的6个品种板栗成熟果实为研究对象,利用Illumina MiSeq高通量测序方法,调查了板栗果实内生真菌群落组成以及在果肉和果壳多样性与组成,结果表明板栗果实中相对丰度平均... 详细信息

以来自辽宁、河北、山东、安徽、浙江和江西等板栗主产区或产区当年的6个品种板栗成熟果实为研究对象,利用Illumina MiSeq高通量测序方法,调查了板栗果实内生真菌群落组成以及在果肉和果壳多样性与组成,结果表明板栗果实中相对丰度平均最高的是子囊菌门Ascomycota(80.40%),其次为担子菌门Basidiomycota(7.70%);纲水平的丰度最高为粪壳菌纲Sordariomycetes(43.00%)和酵母纲Saccharomycetes(15.10%)。品种间共有(Shared)真菌类群在纲水平上,富集在座囊菌纲Dothideomycetes上,其丰度>90%;而品种间的优势类群有变化,除酵母菌纲在毛板红品种中最高(39.21%)外、粪壳菌纲真菌在另外5个板栗品种中最丰富(29.47%～59.56%)。果实组织间,果肉组织较之果壳具有更高的特有真菌种类,而果肉组织特有优势类群均来自担子菌,尤其是银耳纲Tremellomycetes的红菇目Russulales。LEfSe分析结果指出果壳和果肉组织显著性差异种群来自镰孢属Fusarium、梅奇酵母属Metschnikowia、迈耶氏酵母属Meyerozyma和德巴利酵母属Debaryomyces真菌,这些真菌在果肉组织中具有显著优势。采用组织分离和常规培养了6品种果肉组织的真菌,共获得有效菌株2346株,分属子囊菌、担子菌和毛霉菌门Mucoromycota。果实及其果壳、果肉上的真菌优势类群,在群落组成和丰度上与高通量测序技术结果相似。分析认为板栗果实具有丰富的、以子囊菌粪壳菌纲和酵母菌纲为优势类群的内生真菌群落组成和种群多样性,但建群种类主要来自座囊菌纲。板栗果实品种间的内生真菌群落组成结构具有明显差异。板栗果肉较之果壳组织有更为丰富的特有内生真菌多样性。板栗果肉和果壳组织内生真菌群落组成具有明显分化。研究为利用板栗健康微生物组防控果实病害和了解坚果类果实微生物组提供了基础。

关键词：板栗果实内生真菌组 illumina MiSeq测序群落组成多样性

来源： cnki会议评论

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广东农业科学 2012年第15期39卷 104-107页

作者：徐妙马玉超赵帆窦桂铭北京林业大学生物科学与技术学院北京100083

利用选择性筛选方案从啤酒厂附近土壤样品中获得两株耐酸、耐热普鲁兰酶产生菌(PPL3和PPLA),16S rRNA基因系统发育分析结果显示,PPL3和PPL4均为芽孢杆菌。酶学性质分析结果显示,最适pH值和最适温度均为7.0和90℃,粗酶液在pH值为5.0和90... 详细信息

利用选择性筛选方案从啤酒厂附近土壤样品中获得两株耐酸、耐热普鲁兰酶产生菌(PPL3和PPLA),16S rRNA基因系统发育分析结果显示,PPL3和PPL4均为芽孢杆菌。酶学性质分析结果显示,最适pH值和最适温度均为7.0和90℃,粗酶液在pH值为5.0和90℃的条件下放置10 h后残余酶活仍分别保持在85%和80%以上,对酸和热表现出很好的稳定性。

关键词：普鲁兰酶筛选鉴定酶学性质

内生链霉菌SSD49的抑菌活性和防病促生效果

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生物技术通报 2017年第6期33卷 121-127页

作者：葛优优刘晓瑜窦桂铭马玉超北京林业大学生物科学与技术学院北京100083 北京林业大学林学院北京100083

内生链霉菌SSD49分离自羊角拗的根部,对杨树溃疡病病原真菌具有很强的抑菌活性。为了研究该菌对各种病原菌的抑菌活性,促进植物生长的特征和作为生防菌剂的潜力,进行了平板对峙、组织培养和温室盆栽实验。结果显示,SSD49能够抑制板栗疫... 详细信息

内生链霉菌SSD49分离自羊角拗的根部,对杨树溃疡病病原真菌具有很强的抑菌活性。为了研究该菌对各种病原菌的抑菌活性,促进植物生长的特征和作为生防菌剂的潜力,进行了平板对峙、组织培养和温室盆栽实验。结果显示,SSD49能够抑制板栗疫病菌、大豆核盘菌、辣椒疫霉、苹果轮纹病病原菌、杨树溃疡病细菌型病原菌、以及耐甲氧西林金黄色葡萄球菌和白假丝酵母等多种植物病原菌和人类机会致病菌,并产生几丁质酶和31.56 mg/L的吲哚乙酸;接种SSD49孢子液的毛白杨组培苗、大豆、番茄和辣椒的株高、根长和地上部分干重及根干重分别提高了16.98%-41.82%、19.00%-55.85%、4.58%-70.87%和15.25%-126.06%;对大豆菌核病的防治效果达到88.24%。以上研究结果证明内生链霉菌SSD49在农林业的生物防治中具有潜在的应用价值,生防、促生机理有待进一步深入研究。

关键词：植物内生菌内生链霉菌抑菌活性生物防治植物促生

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板栗叶焦枯病相关病菌分离及病因初探

林业科学研究 2021年第2期34卷 185-192页

作者：任菲董炜史胜青汪慧华窦桂铭严东辉中国林业科学研究院森林生态环境与保护研究所国家林业和草原局森林保护重点实验室北京100091 国家粮食和物资储备局科学研究院粮油加工研究所北京100037 中国电力科学研究院北京100192 中国林业科学研究院林业研究所北京100091 北京农业职业学院食品与生物工程系北京100085

[目的]近年河北板栗主产区大面积严重发生板栗叶焦枯病,造成板栗减产和栗农经济损失,该病害发病原因亟待明确,尽早进行有效的防控。[方法]通过林间症状调查和病叶组织样本微生物分离、离体叶片及盆栽苗接种致病柯赫法则验证,结合果园管... 详细信息

[目的]近年河北板栗主产区大面积严重发生板栗叶焦枯病,造成板栗减产和栗农经济损失,该病害发病原因亟待明确,尽早进行有效的防控。[方法]通过林间症状调查和病叶组织样本微生物分离、离体叶片及盆栽苗接种致病柯赫法则验证,结合果园管理措施和环境因素分析,对病因进行了探讨。[结果]该病栗园病树率可达10%~50%,单株树病叶率可至90%以上,病叶主要症状为叶缘及叶脉间组织干枯。林间、室内湿培及显微镜切片均未发现病组织存在病症或病原菌组织。组织分离纯化获得相关微生物菌株102株,均为真菌,归属10科12属15种,丰度最高为Alternaria alternata。致病性接种试验表明,其中的Ophiognomonia setacea和Coniothyrium pyrinum能引起接种组织局部褐变发病,但症状表现与林间叶焦枯病有差异。[结论]研究发现Ophiognomonia setacea和Coniothyrium pyrinum两种真菌具有致病性,可在中国板栗引发叶斑病,但症状不同于发生于栗园的板栗叶焦枯病。当前频发性树叶焦枯病类病害常见诱发因素,多与气候变暖、异常天气、环境污染以及生产和病虫害管理措施不当引起的品种生长不适应密切关联。河北大面积发生的板栗叶焦枯病病因有待综合非侵染因子进行深入研究和探明,以期为尽快采取有效防控措施奠定基础。

关键词：板栗叶片焦枯菌株分离接种实验病因分析

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大豆菌核病拮抗内生细菌的筛选与鉴定

广东农业科学 2013年第7期40卷 78-82页

作者：窦桂铭刘晓瑜张银东马玉超海南大学农学院海南海口570228 北京林业大学生物科学与技术学院北京100083

从北京林业大学校园和海南省儋州植物园共采集6种植物的不同组织,通过五步法表面消毒和选择性分离培养方法共分离得到183株植物内生菌,平板拮抗试验显示,32株内生菌对大豆菌核病病原菌具有拮抗活性,占分离菌株的17.49%;结合抗菌活性、... 详细信息

从北京林业大学校园和海南省儋州植物园共采集6种植物的不同组织,通过五步法表面消毒和选择性分离培养方法共分离得到183株植物内生菌,平板拮抗试验显示,32株内生菌对大豆菌核病病原菌具有拮抗活性,占分离菌株的17.49%;结合抗菌活性、形态特征和宿主来源,选择10株拮抗菌株进行鉴定,结果显示这些菌株分别属于链霉菌属(Streptomyces)、棒状杆菌属(Microbacterium)、根瘤菌属(Rhizobium)、无色杆菌属(Achromobacter)和芽孢杆菌属(Bacillus),具有丰富的微生物多样性。因此,本研究筛选的大豆菌核病病原菌拮抗菌株为开发生物防治混合菌剂提供了菌种资源,为生物防治菌核病、减少农业经济损失奠定了基础。

关键词：大豆菌核病植物内生菌拮抗菌几丁质酶