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刻点血蜱成蜱中肠菌群结构的分析

畜牧与兽医 2024年第4期56卷 54-60页

作者：刘龙江刘潇雨程天印段德勇吴平顺甘肃省迭部县动物疫病预防控制中心甘肃迭部747400 湖南农业大学动物医学院湖南长沙410128

旨在探明雌、雄刻点血蜱中肠菌群结构特征及其差异。从新疆沙湾市绵羊体表采集刻点血蜱雌、雄蜱,无菌条件下收集雌、雄蜱中肠内容物,提取各样本细菌总DNA,PCR扩增细菌16S rDNA V3-V4区,运用Illiumina NovaSeq高通量双末端测序,对数据进... 详细信息

旨在探明雌、雄刻点血蜱中肠菌群结构特征及其差异。从新疆沙湾市绵羊体表采集刻点血蜱雌、雄蜱,无菌条件下收集雌、雄蜱中肠内容物,提取各样本细菌总DNA,PCR扩增细菌16S rDNA V3-V4区,运用Illiumina NovaSeq高通量双末端测序,对数据进行拼接和过滤,扩增子序列变异(ASVs)降噪与物种注释后,对比分析雌、雄蜱中肠菌群结构的组成及差异。结果:雌蜱中肠菌群多样性高于雄蜱;在门水平上,变形菌门、厚壁菌门、异常球菌门、拟杆菌门、放线菌门在雌、雄蜱中肠内相对丰度较高,其中变形菌门相对丰度最高,为2个样本的优势菌门,且变形菌门在雄蜱中肠内的含量大于雌蜱;在属水平上,Schlegelella、不动杆菌属、拟杆菌属、乳杆菌属、短波单胞菌属、罗姆布茨菌属等在雌、雄蜱中肠内的相对丰度较高,其中Schlegelella的丰度最高,且在雌蜱(41.7%)中的含量高于雄蜱(0.8%);注释到种水平且2个样本共有的菌种包括:西尔瓦诺斯亚栖热菌、鲍曼不动杆菌、柯克斯氏体共生菌、肠乳杆菌、长双歧杆菌、巴氏杆菌拟杆菌等。本研究表明,刻点血蜱雌、雄蜱中肠菌群结构较为相似,但各细菌在不同分类级别上的相对丰度差异较大,这可能与雌、雄蜱吸血及生理特性不同有关。

关键词：刻点血蜱雌蜱雄蜱中肠菌群结构

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新产褐黄血蜱卵原生质蛋白组成和状态研究

中国病原生物学杂志 2022年第8期17卷 924-928,933页

作者：李丹徐义葳程天印湖南农业大学动物医学院湖南长沙410128

目的分析新产褐黄血蜱卵原生质蛋白及功能,揭示蜱胚发育的物质需求,为创新免疫控蜱策略奠定基础。方法采用LC/MS/MS技术,搜索唾液腺转录组文库鉴定褐黄血蜱卵原生质蛋白和高丰度卵成分。结果检获特异性肽段503条,由此鉴定多肽137条,高... 详细信息

目的分析新产褐黄血蜱卵原生质蛋白及功能,揭示蜱胚发育的物质需求,为创新免疫控蜱策略奠定基础。方法采用LC/MS/MS技术,搜索唾液腺转录组文库鉴定褐黄血蜱卵原生质蛋白和高丰度卵成分。结果检获特异性肽段503条,由此鉴定多肽137条,高可信的82条,属于79种蛋白,其中34种已知功能的分别属于酶类、蛋白酶抑制剂、转运蛋白、蛋白合成与修饰、免疫相关蛋白等五类;序列比对表明,在抑制剂和转运蛋白两类中,成员有明显的家族性;定量分析显示,在卵蛋白中,丰度最高的蛋白是contig_43009+19714,另外三种分别为contig_42244+44787、contig_195、contig_12613,其丰度排名依次为第2、6、7。电泳显示,新鲜卵蛋白大小25-400 ku之间,但分布不均,在近120 ku、90 ku等9处形成浓染条带;切带分析显示,9个条带中的高丰度蛋白均为contig_43009、contig_19714、contig_42244、contig_44787等Vn片段,说明蜱卵产出时其内的Vn(或Vg)已降解成大小不同的肽段。结论新产褐黄血蜱卵原生质蛋白具有多样性、系统性和家族性。

关键词：褐黄血蜱卵 LC/MS/MS 酶蛋白酶抑制剂

褐黄血蜱卵蛋白的鉴定及在卵孵化过程中的量变

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中国畜牧兽医 2022年第11期49卷 4410-4419页

作者：徐义葳李丹程天印湖南农业大学动物医学院长沙410128

【目的】探明褐黄血蜱卵蛋白成分及其在胚胎发育过程中的作用,为筛选抗蜱生殖疫苗分子奠定基础。【方法】提取褐黄血蜱孵化0、7、14、21 d的卵蛋白,以过滤器辅助样品制备(filter-aided sample preparation, FASP)法酶解卵蛋白,液相色谱... 详细信息

【目的】探明褐黄血蜱卵蛋白成分及其在胚胎发育过程中的作用,为筛选抗蜱生殖疫苗分子奠定基础。【方法】提取褐黄血蜱孵化0、7、14、21 d的卵蛋白,以过滤器辅助样品制备(filter-aided sample preparation, FASP)法酶解卵蛋白,液相色谱-串联质谱法(liquid chromatography-tandem mass spectrometry, LC-MS/MS)分离、检测酶解特异性肽段,搜索该蜱中肠转录组文库鉴定卵原生质中的蛋白,登录NCBI对各蛋白进行注释;以Maxquant计算各蛋白的iBAQ(intensity-based absolute quantification)和非标记定量(Label-free quantification, LFQ),分析各蛋白在不同孵化时间的相对丰度及其增减,并对高可信蛋白序列进行GO功能富集分析。【结果】本研究共检出特异性肽段1 044条,由此鉴定多肽291种,其中高可信的(unique peptides≥2)112种,但仅39种有相关文献。基于文献,按照功能将39种蛋白归类于酶、酶抑制剂、转运蛋白、热休克蛋白、细胞骨架蛋白及未知蛋白6类;酶、酶抑制剂、转运蛋白、热休克蛋白都有家族蛋白共存的情况。定量分析显示,在新产褐黄血蜱卵中,丰度最高的是Contig14782,其次为Contig6575。至孵化结束时,在20种高丰度蛋白中,1种(Contig2242)显著升高(P<0.05),14种显著下降(P<0.05),5种增减不显著。GO功能富集分析表明,本次鉴定的高可信蛋白主要定位于胞外区域,参与免疫调节过程,发挥结合蛋白质和RNA的作用。【结论】褐黄血蜱卵蛋白成分复杂、种类众多,包括酶、酶抑制剂、转运蛋白、热休克蛋白、细胞骨架蛋白等,其中酶是最多的一类。在孵化期间,绝大多数蛋白酶和酶抑制剂丰度显著下降。

关键词：褐黄血蜱卵蛋白液相色谱-串联质谱定量分析

褐黄血蜱HSP70-b2及其类14-Mer肽的作用研究

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畜牧兽医学报 2023年第6期54卷 2570-2580页

作者：程天印吴聪颖刘雨珂段德勇湖南农业大学动物医学院长沙410128

褐黄血蜱(Haemaphysalis flava,H.flava)热休克蛋白70-b2(heat shock protein 70-b2,HSP70-b2)属于HSP70家族。为评估褐黄血蜱HSP70-b2的抗凝血活性、免疫原性及其类14-Mer肽的作用,本研究通过RACE技术扩增褐黄血蜱HSP70-b 2基因全长;定点突变其编码类14-Mer肽段序列获得HSP70-b2^(M)基因全长;分别构建原核表达质粒,经原核表达、镍柱层析纯化获得可溶性重组蛋白,体外凝血四项试验评估rHSP70-b2与rHSP70-b2^(M)的抗凝血活性;将重组蛋白与弗氏(不)完全佐剂按推荐剂量乳化,皮下免疫Sprague Dawley(SD)大鼠,间接ELISA检测血清抗体效价,探究rHSP70-b2与rHSP70-b2^(M)的免疫原性。结果显示:HSP70-b 2基因全长2413 bp,开放阅读框长1905 bp,编码蛋白中具有HSP70蛋白家族标签。成功将HSP70-b 2中编码类14-Mer肽段的核酸序列突变为编码14-Mer肽段的核酸序列。与对照组相比,rHSP70-b2和rHSP70-b2^(M)对凝血酶原时间(prothrombin time,PT)和活化部分凝血酶时间(activated partial thromboplastin time,APTT)无显著作用(P>0.05),但均可延长凝血酶时间(thrombin time,TT)和纤维蛋白原(FIB)凝血时间(P0.05)。大鼠血清中抗体效价随免疫次数的增加而提升,且rHSP70-b2诱导产生的抗体水平极显著高于rHSP70-b2^(M)(P<0.01)。综上表明:rHSP70-b2和rHSP70-b2^(M)在体外可通过延长凝血酶时间和降低纤维蛋白原含量发挥抗凝血作用;rHSP70-b2和rHSP70-b2^(M)均具有良好的免疫原性,可诱发体液免疫。

关键词：褐黄血蜱 HSP70-b2 定点突变原核表达抗凝活性免疫原性

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山莓叶中总黄酮提取工艺优化的试验研究

湖南畜牧兽医 2023年第3期 45-50页

作者：李丹程天印邵阳职业技术学院生物工程系湖南邵阳422000 湖南农业大学动物医学院湖南长沙410128

采用均匀实验设计,以山莓叶总黄酮的提取率为指标,分析回流法和超声波法中乙醇浓度、固料比、提取温度、提取时间对山莓叶总黄酮得率的影响。结果显示:回流法提取的最佳工艺条件为以90%的乙醇浓度按1:10的固液比在95℃温度下,提取4h;超... 详细信息

采用均匀实验设计,以山莓叶总黄酮的提取率为指标,分析回流法和超声波法中乙醇浓度、固料比、提取温度、提取时间对山莓叶总黄酮得率的影响。结果显示:回流法提取的最佳工艺条件为以90%的乙醇浓度按1:10的固液比在95℃温度下,提取4h;超声波提取的最佳工艺条件为以90%的乙醇浓度按1:20的固液比在50℃温度下,提取35min。

关键词：山莓总黄酮提取

葡萄糖氧化酶纳米粒的制备及其体内外抗菌效果

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畜牧与兽医 2022年第2期54卷 72-77页

作者：周名清程天印张嘉恒湖南农业大学动物医学院湖南长沙410000 哈尔滨工业大学(深圳)材料科学与工程学院广东深圳518055

为了使葡萄糖氧化酶更加稳定,利用可逆加成-断裂链转移自由基聚合反应对葡萄糖氧化酶进行纳米包裹。动态激光散射仪测定显示,包裹后粒径为(12.4±1.0)nm, Zeta电位为(+4.2±0.5)mV。通过冻融循环、长期储存和胰蛋白酶试验证明了包裹后... 详细信息

为了使葡萄糖氧化酶更加稳定,利用可逆加成-断裂链转移自由基聚合反应对葡萄糖氧化酶进行纳米包裹。动态激光散射仪测定显示,包裹后粒径为(12.4±1.0)nm, Zeta电位为(+4.2±0.5)mV。通过冻融循环、长期储存和胰蛋白酶试验证明了包裹后的稳定性。在体外,对大肠杆菌的最低抗菌浓度为0.01 mg/mL。对新西兰大白兔细菌肿包治疗显示,包裹后的葡萄糖氧化酶较包裹前有较好的稳定性和抑菌效果,可作为新型抗菌制剂。

关键词：葡萄糖氧化酶纳米包裹稳定性抗菌

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褐黄血蜱组织蛋白酶L的克隆和表达水平分析

中国病原生物学杂志 2022年第2期17卷 186-190页

作者：吴聪颖伍芷锋程天印湖南农业大学动物医学院湖南长沙410128

目的对褐黄血蜱组织蛋白酶B(cathepsin L-like cysteine proteinase B,cathepsin L-lcp B)基因进行克隆及表达分析。方法基于褐黄血蜱唾液腺转录组文库中的Contig731序列设计引物,RACE法扩增cathepsin L-lcp BcDNA(Hf-CLlCPb)全长,qPCR法分析Hf-CLlCPb在不同吸血状态下雌成蜱不同组织的表达水平。结果Hf-CLlCPb全长1547bp,ORF框长1005bp,编码355个氨基酸;该基因在半饱血、饱血褐黄血蜱(♀)中的唾液腺表达量最高,卵巢、中肠、体壳次之;Hf-CLlCPb在半饱血褐黄血蜱(♀)中的表达量高于饱血褐黄血蜱(♀)。结论成功克隆出褐黄血蜱Hf-CLlCPb基因全长,qPCR检测Hf-CLlCPb基因在褐黄血蜱唾液腺中高表达。

关键词：褐黄血蜱 Hf-CLlCPb RACE qPCR

不同地区褐黄血蜱的单倍型多态性、遗传分化和种系发育关系分析

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中国兽医杂志 2023年第9期59卷 60-66页

作者：李中波侯强红舒鸣程天印怀化职业技术学院湖南怀化418000 湖南农业大学动物医学院湖南长沙410128

为了探究不同地区褐黄血蜱的单倍型多态性、遗传分化和种系发育关系,本试验以采自于湖南、河南两省的褐黄血蜱(各10只,共20只)为研究对象,通过PCR扩增其细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ(cox1)和还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸脱氢酶亚基Ⅳ(nad4)基... 详细信息

为了探究不同地区褐黄血蜱的单倍型多态性、遗传分化和种系发育关系,本试验以采自于湖南、河南两省的褐黄血蜱(各10只,共20只)为研究对象,通过PCR扩增其细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ(cox1)和还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸脱氢酶亚基Ⅳ(nad4)基因序列,对其单倍型多态性(Hd)、遗传分化和种系发育关系进行分析。结果显示,cox 1基因序列(849 bp)包含4个变异位点,5个单倍型(h=5,A1~A5,Hd=0.653),其基因分化系数(Gst)=0.061,遗传分化系数(Fst)=-0.047,基因流(Nm)=-5.625;nad 4基因序列(626 bp)包含3个变异位点,3个单倍型(h=3,B1~B3,Hd=0.363),其Gst=0.004,Fst=0.074,Nm=3.125;cox 1+nad 4基因序列包含7个变异位点,7个单倍型(h=7,C1~C7,Hd=0.768),其Gst=-0.010,Fst=-0.015,Nm=-16.560;在所构建的种系发育树中,20只褐黄血蜱均处于种系发育树的一个分支。结果表明,湖南、河南两省的褐黄血蜱个体之间虽表现出单倍型多态性,但它们之间具有较近的亲缘关系,尚未出现遗传分化。

关键词：褐黄血蜱 cox 1 nad 4 基因变异单倍型多态性遗传分化种系发育关系

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豪猪血蜱的形态学和分子生物学鉴定

中国兽医科学 2022年第2期52卷 214-222页

作者：刘雨珂王爱兵刘国华刘磊程天印段德勇湖南农业大学动物医学院湖南长沙410128

为豪猪血蜱的鉴定提供准确依据,从湖南省怀化地区猪獾体表采集蜱,运用体视显微镜超景深系统观察其形态学特征;提取蜱体壁总DNA,经PCR扩增测序获得其COX1、ITS2和16S rDNA基因序列,与GenBank数据库中序列比对,并构建系统发育树,进行同源... 详细信息

为豪猪血蜱的鉴定提供准确依据,从湖南省怀化地区猪獾体表采集蜱,运用体视显微镜超景深系统观察其形态学特征;提取蜱体壁总DNA,经PCR扩增测序获得其COX1、ITS2和16S rDNA基因序列,与GenBank数据库中序列比对,并构建系统发育树,进行同源性分析。结果显示,该蜱种雌蜱呈南瓜子形,前窄后宽;假头基为矩形,基突后缘短薄,末端刺宽圆;孔区圆形;须肢圆短,第3节背面有1对刺;盾板两侧缘呈深弧状弯曲,刻点散布均匀;颈沟短而深;缘垛较宽但不明显;无外距,内距粗短呈锥状;生殖孔为圆形,前端与基节Ⅱ中部平行,后端止于基节Ⅲ前缘;气门板呈逗点形;肛门圆形,肛沟位于肛后呈酒杯状。雄蜱除体型较小、体色较浅、盾板覆盖全背、颈沟短而浅、缘垛明显形状狭长、生殖孔与基节Ⅱ平行饱满呈唇形、肛门平行于第1缘垛呈圆形突出状、肛沟呈马蹄状等特征外,其他结构与雌蜱的相似。该蜱种COX1、ITS2和16SrDNA基因序列大小分别为749、1 656和440 bp。经测序比对,该蜱种COX1、16SrDNA基因序列与GenBank中已有豪猪血蜱COX1、16S rDNA基因序列的相似度分别可达99.21%、99.32%以上;该蜱种ITS2基因序列在GenBank中尚未有记录,其仅与长角血蜱ITS2基因序列(KX450306)的相似度较高为91.32%。通过COX1、ITS2和16S rDNA基因系统发育树分析,该蜱种与其他血蜱种聚于同一属分支下。结果表明,从猪獾体表采集的蜱种为豪猪血蜱,结合形态结构及分子标记特征较易鉴定该蜱种。

关键词：豪猪血蜱形态学分子标记特征系统发育树