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作者：祝岩波河北医科大学

学位级别：硕士

目的:实验动物是生命科学研究的基础和条件,实验动物作为人类的替身承担药物安全和治疗效果,其质量直接影响众多领域科学实验的准确性。随着我国科研水平的不断提高,研究人员对实验动物的微生物质量控制要求越来越严格。金黄色葡萄球菌(... 详细信息

目的:实验动物是生命科学研究的基础和条件,实验动物作为人类的替身承担药物安全和治疗效果,其质量直接影响众多领域科学实验的准确性。随着我国科研水平的不断提高,研究人员对实验动物的微生物质量控制要求越来越严格。金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)、多杀巴氏杆菌(Pasteurella multocida)、支气管鲍特杆菌(Bordetella bronchiseptica)、肺支原体(Mycoplasma pneumoniae)、泰泽氏菌(clostridium piliformis)、肺炎克雷伯杆菌(Klebsiella pneumoniae)等七种病原体是我国实验动物微生物质量控制需要排除的病原体,也是实验动物常见的易感病原体。目前对实验动物携带的病原体主要依靠分离纯化培养、菌落形态、镜下观察及生化试验等方法进行鉴定,检测周期长,费用高,并且需要有经验的检测人员进行判定,漏检、误判时有发生。PCR(Polymerase Chain Reaction)技术以其简便、快速、准确等优点已广泛用于医疗和卫生行业,但实验动物的微生物质量控制还未将PCR检测方法纳入,更没有多重PCR方法,这已成为多种病原体或大样本简单、快速、准确鉴定的掣肘。多重PCR(multiplex PCR)可以在同一反应体系中扩增出大小不同的核酸片段,具有快捷方便、高效等优点。用于实验动物病原微生物检测,可以同时检测多种病原体,适合大样本的检测与鉴定,具有高灵敏性、高特异性和低成本等优点。多重PCR在其他行业应用较多,然而,目前应用在实验动物病原微生物检测的研究很少。本研究目的是针对七种实验动物病原菌金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、多杀巴氏杆菌、支气管鲍特杆菌、肺支原体、泰泽氏菌、肺炎克雷伯杆菌,建立多重PCR检测方法,并与传统的微生物检测方法或血清学方法比较,验证多重PCR检测方法的可操作性和准确性。方法:1、标准菌株的培养和DNA提取:将金黄色葡萄球菌标准株接种到SP琼脂培养基,绿脓杆菌标准株接种到NAC琼脂培养基,肺炎克雷伯杆菌接种到dhl琼脂培养基,37℃培养18-24h;多杀巴氏杆菌、支气管鲍特杆菌接种到血琼脂培养基,37℃培养24-48h;肺支原体接种到液体培养基中,一周后进行观察收集。按照细菌提取试剂盒方法提取各种病原体的dna,泰泽氏菌dna由中国食品药品检定研究院惠赠。2、引物的设计:通过查阅文献和primer5.0软件设计金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、肺炎克雷伯杆菌、多杀巴氏杆菌、支气管鲍特杆菌、肺支原体和泰泽氏菌的特异性引物,使用blast分析引物特异性;进行pcr扩增,测序鉴定。3、特异性实验和敏感性实验:pcr扩增非目的菌进行特异性实验;将模板dna按照10倍的比例进行梯度稀释,检测pcr敏感性。4、四组多重pcr检测方法的建立和初步应用4.1将金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌和肺炎克雷伯杆菌三种细菌在同一个反应体系中扩增,同时加入16srrna的引物作为内质控,优化多重反应体系和扩增条件,验证该多重体系的特异性和敏感性。应用该多重反应体系检测人工感染的粪便样本和76例新鲜大、小鼠粪便样本,同时采用传统检测方法进行检测。4.2将多杀巴氏杆菌、支气管鲍特杆菌、肺支原体三种病原微生物在同一个反应体系中扩增,验证该多重体系的特异性和敏感性,建立多重反应体系。应用该多重反应体系检测人工感染的气管分泌物、棉拭子样本和182例实验动物样本,同时采用传统检测方法或血清学方法进行检测。4.3将金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、多杀巴氏杆菌、支气管鲍特杆菌和肺支原体五种病原微生物在同一个反应体系中扩增,优化多重反应体系和扩增条件,验证该多重体系的特异性和敏感性,建立多重反应体系,应用该多重反应体系检测人工感染病原菌的粪便、气管分泌物、棉拭子和182例实验动物样本,同时采用传统检测方法或血清学方法进行检测。4.4将金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌和泰泽氏菌三种细菌在同一个反应体系中扩增,验证该多重体系的特异性和敏感性,建立多重反应体系。应用该多重反应体系检测112例实验动物粪便样本,同时采用传统检测方法或血清学方法进行检测。结果:1、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、肺炎克雷伯杆菌、多杀巴氏杆菌和支气管鲍特杆菌在琼脂培养基上生长,肺支原体液体培养颜色由红色变为黄色。2、获得10对特异性引物,并通过blast比对验证引物的特异性,扩增产物大小分别为金黄色葡萄球菌(153bp)、绿脓杆菌(600bp)、肺炎克雷伯杆菌(368bp)、通用引物(520bp)、多杀巴氏杆菌(356bp)、支气管鲍特杆菌(237bp)、肺支原体(266bp)、泰泽氏菌(639bp)、绿脓杆菌(197bp),扩增产物测序结果均与genebank中相

关键词：实验动物多重PCR 病原体检测敏感性特异性

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实验动物泰泽氏菌、肺支原体、兔出血症病毒检测方法的评价

实验动物泰泽氏菌、肺支原体、兔出血症病毒检测方法的评价

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2017年第十五届中国北方实验动物科技年会

作者：祝岩波王俊霞河北省实验动物实验室河北医科大学实验动物学部

泰泽氏菌、肺支原体、兔出血症病毒是实验动物重要的致病病原体,可引起呼吸系统、消化系统疾病,对动物的生产和动物实验可产生不良影响。本文对上述国家检测标准规定必须检测且有检测难度的三种病原体进行方法学总结,以获得更好特异性... 详细信息

泰泽氏菌、肺支原体、兔出血症病毒是实验动物重要的致病病原体,可引起呼吸系统、消化系统疾病,对动物的生产和动物实验可产生不良影响。本文对上述国家检测标准规定必须检测且有检测难度的三种病原体进行方法学总结,以获得更好特异性和敏感性的诊断方法,提出传统方法初检、PCR方法复检的方法以提高检测结果的准确性和可靠性。

关键词：泰泽氏菌肺支原体兔出血症病毒检测方法

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婴幼儿配方乳粉中叶酸检测用鼠李糖乳杆菌定量菌株制备

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食品与发酵工业 2023年第22期49卷 189-193页

作者：张涛张瑞张子仑李献祝岩波刘雨蒙张雅伦周巍河北省食品检验研究院河北省食品安全重点实验室国家市场监管重点实验室(特殊食品监管技术)特殊食品安全与健康河北省工程研究中心河北石家庄050200

为优化生物法测定婴幼儿配方乳粉中叶酸含量制备鼠李糖乳杆菌定量菌株。通过添加保护剂冻存菌株的方式制作适用检测条件的菌球,对菌球做运输条件模拟试验和贮存条件模拟实验验证菌球稳定性,随机抽取10瓶菌株做均匀性验证;应用鼠李糖乳... 详细信息

为优化生物法测定婴幼儿配方乳粉中叶酸含量制备鼠李糖乳杆菌定量菌株。通过添加保护剂冻存菌株的方式制作适用检测条件的菌球,对菌球做运输条件模拟试验和贮存条件模拟实验验证菌球稳定性,随机抽取10瓶菌株做均匀性验证;应用鼠李糖乳杆菌定量菌株测试质控样品叶酸含量。结果表明,鼠李糖乳杆菌定量菌株在25℃和37℃条件下菌落数变动较小,在-20℃和4℃环境中复苏率均在80%以上,鼠李糖乳杆菌定量菌株稳定性良好;通过单因素方差分析方法分析结果表明鼠李糖乳杆菌定量菌株均匀性良好;测得质控样品叶酸含量结果准确。鼠李糖乳杆菌定量菌株具有检测结果准确,便于保存,简化实验步骤等优点,满足婴幼儿乳粉中叶酸检测需求。

关键词：叶酸鼠李糖乳杆菌定量菌株婴幼儿配方乳粉均匀性稳定性

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实验动物泰泽氏菌、肺支原体、兔出血症病毒检测方法的评价

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实验动物科学 2017年第2期34卷 71-74页

作者：祝岩波王俊霞河北省实验动物实验室河北医科大学实验动物学部石家庄050000

泰泽氏菌、肺支原体、兔出血症病毒是实验动物重要的致病病原体,可引起呼吸系统、消化系统疾病,对动物的生产和动物实验可产生不良影响。本文对上述国家检测标准规定必须检测且有检测难度的三种病原体进行方法学总结,以获得更好特异性和敏感性的诊断方法;提出传统方法初检、PCR方法复检的方法以提高检测结果的准确性和可靠性。

关键词：泰泽氏菌肺支原体兔出血症病毒检测方法

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叶酸对SOD1-G93A小鼠的促炎作用研究

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脑与神经疾病杂志 2024年第11期32卷 667-674页

作者：祝岩波严陶陶张双周巍河北省食品检验研究院石家庄050227

目的探讨叶酸对肌萎缩侧索硬化症(ALS)的可能作用机制,为叶酸在临床上的防治提供可靠的实验数据。方法将转基因SOD1-G93A突变型小鼠12对随机分为对照组和叶酸组,同窝分开,雌雄各半,每组12只。从60 d开始,对照组正常进水进食,叶酸组正常... 详细信息

目的探讨叶酸对肌萎缩侧索硬化症(ALS)的可能作用机制,为叶酸在临床上的防治提供可靠的实验数据。方法将转基因SOD1-G93A突变型小鼠12对随机分为对照组和叶酸组,同窝分开,雌雄各半,每组12只。从60 d开始,对照组正常进水进食,叶酸组正常进食,水添加4mg·kg^(-1)叶酸,每周称体质量2次。小鼠终末期脱颈处死后留取大脑、小脑、脊髓、心、肝、脾、肺、肾、坐骨神经、肌肉、小肠和结肠,提取RNA,PCR array试剂盒检测SOD1-G93A小鼠脊髓RNA表达水平,RT-qPCR检测SOD1-G93A小鼠大脑、小脑、脊髓、心、肝、脾、肺、肾、坐骨神经、肌肉、小肠和结肠中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)、分化簇68(CD68)、分化簇86(CD86)和单核细胞趋化蛋白-1(MCP1)的表达水平。结果SOD1-G93A小鼠的叶酸组生存期为(128±8.1)d,对照组生存期为(136.5±9.7)d,叶酸组比对照组生存寿命平均减少8 d,差异有统计学意义(P<0.05);上调最为显著的基因有2个,分别为Epo和Bcl2a1a,涉及到Hypoxia和NF-κB信号通路。叶酸组在小脑和脊髓中TNF-α、IL-1β、CD68和CD 86的表达是对照组的两倍以上,叶酸组在小脑中MCP1的表达是对照组的两倍以上,差异有统计学意义(P<0.05)。叶酸组在心脏中TNF-α、IL-1β和MCP1的表达与对照组差异有统计学意义,在脾脏中IL-1β、CD68、CD86和MCP1的表达与对照组有显著性差异,其余无统计学意义。叶酸组在肌肉中TNF-α、CD68、CD86和MCP1的表达与对照组有显著性差异,叶酸组在结肠中TNF-α、IL-1β、CD68、CD86和MCP1的表达与对照组有显著性差异,其余差异无统计学意义。荧光染色结果表明SOD1-G93A小鼠脊髓中,Iba1和GFAP的表达叶酸组明显高于对照组。结论叶酸在SOD1-G93A小鼠模型中的干预可能激活了NF-κB信号通路,诱发了炎症反应,从而延长了病程。

关键词： PCR array 叶酸 SOD1-G93A小鼠炎症

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大鼠冠状病毒和仙台病毒的双重PCR检测方法的建立与应用

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中国实验动物学报 2019年第2期27卷 181-186页

作者：孟钰榕郑龙祝岩波王璇尤红煜刘健敏栗彦宁连伟光张东明王俊霞河北省实验动物重点实验室河北医科大学实验动物学部石家庄050000 河北医科大学第二医院石家庄050000

目的建立快速检测实验大鼠冠状病毒和仙台病毒的双重PCR方法。方法根据大鼠冠状病毒N基因、仙台病毒L基因设计特异性引物;经过双重PCR优化,特异性和敏感性的检测,建立双重PCR体系。应用该PCR体系检测人工感染仙台病毒组织DNA样本和实验... 详细信息

目的建立快速检测实验大鼠冠状病毒和仙台病毒的双重PCR方法。方法根据大鼠冠状病毒N基因、仙台病毒L基因设计特异性引物;经过双重PCR优化,特异性和敏感性的检测,建立双重PCR体系。应用该PCR体系检测人工感染仙台病毒组织DNA样本和实验动物组织样本,并与ELISA方法比对。结果双重PCR扩增出大鼠冠状病毒(168 bp)和仙台病毒(262 bp)目的条带,PCR扩增产物测序结果利用核酸BLAST功能进行同源序列对比,仙台病毒和大鼠冠状病毒同源性分别为100%和99%。仙台病毒和大鼠冠状病毒的检测下限为1.56×10~2 copies/μL。特异性检测对小鼠肝炎病毒扩增,产生片段大小近似大鼠冠状病毒产物。应用建立的双重PCR体系检测人工感染仙台病毒组织DNA样本,30份DNA标本均被检出;检测94份实验动物肺组织样本,结果均阴性。结论建立的双重PCR方法操作简单、快速、特异性强、灵敏度高,能够实现对实验动物仙台病毒和大鼠冠状病毒病原体的快速检测。

关键词：大鼠冠状病毒仙台病毒双重PCR

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大鼠冠状病毒和仙台病毒的双重PCR检测方法的建立与应用

大鼠冠状病毒和仙台病毒的双重PCR检测方法的建立与应用

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第十四届中国实验动物科学年会

作者：孟钰榕郑龙祝岩波王璇尤红煜刘健敏栗彦宁连伟光张东明王俊霞河北省实验动物重点实验室河北医科大学实验动物学部河北医科大学第二医院

目的建立快速检测实验大鼠冠状病毒和仙台病毒的双重PCR方法。方法根据大鼠冠状病毒N基因、仙台病毒L基因设计特异性引物;经过双重PCR优化,特异性和敏感性的检测,建立双重PCR体系。应用该PCR体系检测人工感染样本和实验动物组织样本,并... 详细信息

目的建立快速检测实验大鼠冠状病毒和仙台病毒的双重PCR方法。方法根据大鼠冠状病毒N基因、仙台病毒L基因设计特异性引物;经过双重PCR优化,特异性和敏感性的检测,建立双重PCR体系。应用该PCR体系检测人工感染样本和实验动物组织样本,并与ELISA方法比对。结果双重PCR扩增出大鼠冠状病毒(168bp)和仙台病毒(262bp)目的条带。仙台病毒和大鼠冠状病毒的检测下限为1.56×10 copies/μL。应用建立的双重PCR体系检测人工感染样本,30份仙台病毒核酸阳性标本均被检出。结论建立的双重PCR方法操作简单、快速、特异性强、灵敏度高,能够实现对实验动物仙台病毒和大鼠冠状病毒病原体的快速检测。

关键词：大鼠冠状病毒仙台病毒双重PCR

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大鼠冠状病毒和仙台病毒的双重PCR检测方法的建立与应用

大鼠冠状病毒和仙台病毒的双重PCR检测方法的建立与应用

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第十六届中国实验动物科学年会

作者：孟钰榕郑龙祝岩波王璇尤红煜刘健敏栗彦宁连伟光张东明王俊霞河北省实验动物重点实验室河北医科大学实验动物学部河北医科大学第二医院

目的建立快速检测实验大鼠冠状病毒和仙台病毒的双重PCR方法。方法根据大鼠冠状病毒N基因、仙台病毒L基因设计特异性引物;经过双重PCR优化,特异性和敏感性的检测,建立双重PCR体系。应用该PCR体系检测人工感染仙台病毒组织DNA样本和实验动物组织样本,并与ELISA方法比对。结果双重PCR扩增出大鼠冠状病毒(168 bp)和仙台病毒(262 bp)目的条带,PCR扩增产物测序结果利用核酸BLAST功能进行同源序列对比,仙台病毒和大鼠冠状病毒同源性分别为100%和99%。仙台病毒和大鼠冠状病毒的检测下限为1.56×102 copies/μL。特异性检测对小鼠肝炎病毒扩增,产生片段大小近似大鼠冠状病毒产物。应用建立的双重PCR体系检测人工感染仙台病毒组织DNA样本,30份DNA标本均被检出;检测94份实验动物肺组织样本,结果均阴性。结论建立的双重PCR方法操作简单、快速、特异性强、灵敏度高,能够实现对实验动物仙台病毒和大鼠冠状病毒病原体的快速检测。

关键词：大鼠冠状病毒仙台病毒双重PCR

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利美尼定促进肌萎缩侧索硬化相关蛋白质TDP-43降解的研究

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脑与神经疾病杂志 2021年第3期29卷 156-160页

作者：李奕王晓艳祝岩波段伟松张瑞宁李春岩河北医科大学第二医院神经内科河北省神经病学重点实验室石家庄050000

目的探索利美尼定(RIL)对肌萎缩侧索硬化(ALS)相关蛋白质TAR DNA结合蛋白43(TDP-43)降解的影响.方法用瞬时转染的方法在运动神经元样细胞系NSC-34中过表达WT TDP-43,与家族型ALS相关的Q331K TDP-43、M337V TDP-43突变蛋白、TDP-43的两种... 详细信息

目的探索利美尼定(RIL)对肌萎缩侧索硬化(ALS)相关蛋白质TAR DNA结合蛋白43(TDP-43)降解的影响.方法用瞬时转染的方法在运动神经元样细胞系NSC-34中过表达WT TDP-43,与家族型ALS相关的Q331K TDP-43、M337V TDP-43突变蛋白、TDP-43的两种C末端片段TDP-25和TDP-35,再给予利美尼定干预16h,通过蛋白印迹方法检测5种TDP-43的表达水平.结果在自噬诱导剂RIL的作用下,两种突变TDP-43及其C末端片段的表达明显减少,而WT TDP-43的蛋白质表达水平无明显变化.在自噬阻断剂3-MA的干预下,RIL降解异常蛋白质的作用也被阻断.结论RIL可经由自噬通路降解Q331K TDP-43、M337V TDP-43及其C末端截短片段.

关键词：肌萎缩侧索硬化 TAR DNA结合蛋白43 利美尼定自噬 LC3-Ⅱ

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金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌和肺炎克雷伯杆菌多重PCR方法的建立与初步应用

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中国比较医学杂志 2017年第5期27卷 94-98页

作者：祝岩波郑龙尤红煜王璇梁晓亮刘健敏张东明连伟光栗彦宁王俊霞河北省实验动物重点实验室河北医科大学实验动物学部石家庄050000 河北医科大学第二医院石家庄050000

目的建立金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌和肺炎克雷伯杆菌多重PCR检测方法,为实验动物细菌检测提供快速、灵敏、简便的方法。方法根据金黄色葡萄球菌nuc基因、绿脓杆菌Las I基因、肺炎克雷伯杆菌Pho E基因和细菌通用16S rRNA基因设计出特异... 详细信息

目的建立金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌和肺炎克雷伯杆菌多重PCR检测方法,为实验动物细菌检测提供快速、灵敏、简便的方法。方法根据金黄色葡萄球菌nuc基因、绿脓杆菌Las I基因、肺炎克雷伯杆菌Pho E基因和细菌通用16S rRNA基因设计出特异性引物;经过多重PCR引物浓度和退火温度的优化,特异性和敏感性的检测,建立多重PCR体系。应用该PCR体系对人工感染标本、实验动物粪便样本进行验证检测,与传统检测方法对比。结果多重PCR分别扩增出金黄色葡萄球菌(153 bp)、绿脓杆菌(600 bp)、肺炎克雷伯杆菌(368 bp)和通用(520 bp)的目的条带。多重敏感性为10 pg,特异性检测未从其他细菌中检测出目的条带。应用建立的多重PCR体系检测出不同组合的人工感染标本,从76只粪便检测出绿脓杆菌阳性1例,与传统检测方法结果一致。结论本文建立的多重PCR方法具有特异、灵敏、简便、快速等优点,为实验动物微生物的快速检测提供了可靠的方法。

关键词：金黄色葡萄球菌绿脓杆菌肺炎克雷伯杆菌多重PCR

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