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免疫检查点分子PD-L1和B7-H4在卵巢癌组织中的表达及意义

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现代免疫学 2023年第1期43卷 36-41页

作者：凌佳怡谢芳杜婷黄沁张营胡鑫童瞿秋霞苏州大学医学部苏州215006 苏州大学附属第一医院临床免疫学实验室苏州215006 苏州大学病理学教研室苏州215006 苏州大学附属第一医院妇产科苏州215006 苏州大学附属第二医院妇产科苏州215004

为探讨免疫检查点分子PD-L1和B7-H4在卵巢癌组织中的表达特点以及临床意义,收集46例手术切除的卵巢癌组织,通过免疫组化染色技术检测PD-L1和B7-H4分子的表达水平和定位,采用χ2检验分析其与样本临床参数之间的关系,Spearman法分析相关... 详细信息

为探讨免疫检查点分子PD-L1和B7-H4在卵巢癌组织中的表达特点以及临床意义,收集46例手术切除的卵巢癌组织,通过免疫组化染色技术检测PD-L1和B7-H4分子的表达水平和定位,采用χ2检验分析其与样本临床参数之间的关系,Spearman法分析相关性。结果显示,PD-L1和B7-H4分子在卵巢癌组织内中/高表达所占百分比分别为67.4%(31/46)和82.6%(38/46),二者同时中/高表达率为58.7%(27/46)。膜PD-L1中/高表达与病理类型、分化程度有关(P<0.05),膜B7-H4中/高表达与病理类型有关(P<0.05);膜PD-L1与膜B7-H4的表达有相关性(r=0.553,P<0.05),浆PD-L1和浆B7-H4的表达有相关性(r=0.429,P<0.05)。该研究提示,卵巢癌组织中癌细胞膜表面PD-L1中/高表达提示肿瘤分化差,胞膜同时中/高表达PD-L1和B7-H4分子主要集中在卵巢透明细胞癌亚组,PD-L1与B7-H4在胞膜和胞浆的表达具有相关性,在免疫治疗卵巢癌时需考虑PD-L1和B7-H4抗体联合靶向干预。

关键词：卵巢肿瘤免疫检查点程序性死亡受体配体1 B7-H4

抗人CD40人—鼠嵌合抗体的构建、表达及其生物学活性的初步研究

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抗人CD40人—鼠嵌合抗体的构建、表达及其生物学活性的初步研究

作者：瞿秋霞苏州大学

学位级别：硕士

本研究在本科室自行研制成功的国内首株激发型抗人CD40单克隆抗体(5C11)的基础上，采用经典的嵌合抗体构建方法，对其进行基因工程改造，并在CHO细胞中实现真核表达，进而对其生物学活性进行初步的研究，以期获得能持续有效分泌特异性... 详细信息

本研究在本科室自行研制成功的国内首株激发型抗人CD40单克隆抗体(5C11)的基础上，采用经典的嵌合抗体构建方法，对其进行基因工程改造，并在CHO细胞中实现真核表达，进而对其生物学活性进行初步的研究，以期获得能持续有效分泌特异性的抗人CD40人-鼠嵌合抗体的稳定细胞株，为靶向CD40分子的肿瘤免疫治疗提供必要的物质基础，也期在治疗性单抗的研发领域中取得突破。第一部分首先采用RT-PCR从特异性分泌抗人CD40单克隆抗体的杂交瘤细胞株5C11中提取总RNA，常规逆转录，应用简并引物进行PCR扩增，并根据重、轻链基因序列分析结果设计引物，应用SMART-PCR方法扩增含信号肽序列的V和V基因，进行测序鉴定。同时采用RT-PCR从人脾脏细胞中抽提总RNA，分别设计特异性引物扩增人IgG1链huFc、huCH1基因和κappa链恒定区基因huCκ，再利用TP-PCR方法将huFc和huCH1进行拼接得到人IgG1(CH1-CH3)链恒定区基因，测序鉴定。将含信号肽序列的V序列和人的IgG1重链恒定区序列进行拼接获得嵌合重链，将含信号肽序列的V序列和人的κappa链恒定区序列进行拼接获得嵌合轻链，拼接产物测序鉴定，构建共表达嵌合重、轻链的重组质粒pIRES／hu5C11。pIRES／hu5C11重组质粒用脂质体法转染293T细胞，利用CD40-L929和mock-L929细胞株，通过流式细胞术对293T细胞瞬时表达上清中抗人CD40人-鼠嵌合抗体进行鉴定。结果显示，本研究成功构建了含人-鼠嵌合重链和嵌合轻链基因的抗人CD40人-鼠嵌合抗体真核表达载体pIRES／huSC11。第二部分选择中国仓鼠卵巢细胞(CHO)作为表达宿主，经试剂盒抽提的pIRES／hu5C11嵌合抗体重组表达质粒用脂质体法转染CHO细胞，获得持续稳定分泌表达抗人CD40人-鼠嵌合抗体(ch-SC11)的基因转染细胞株(hu5C11-CHO)。RT-PCR鉴定结果表明ch-SC11表达基因成功整合在huSC11-CHO细胞中;FCM和Western blot结果表明，转染pIRES／hu5C11质粒的CHO培养上清中含有抗人CD40人-鼠嵌合抗体，其不仅保留了特异识别CD40分子活性，并且含人免疫球蛋白Fc

关键词： CD40 单克隆抗体嵌合抗体基因工程真核细胞蛋白质表达淋巴瘤

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关于加强聋生书面语教学的思考

关于加强聋生书面语教学的思考

作者：瞿秋霞华中师范大学

学位级别：硕士

在聋人语言发展进程中,手语、口语、综合交际法等各种教法此消彼长,它们在特定的历史阶段都起过一定的作用,但都并不十全十美,语言教学的现状仍令人担忧,关键问题是聋生仍不能更好地投入社会。本文针对当前问题,首先回顾历史,接着从分... 详细信息

在聋人语言发展进程中,手语、口语、综合交际法等各种教法此消彼长,它们在特定的历史阶段都起过一定的作用,但都并不十全十美,语言教学的现状仍令人担忧,关键问题是聋生仍不能更好地投入社会。本文针对当前问题,首先回顾历史,接着从分析问题的现状和原因为入手,以增强交流的准确性为直接目的,明确阐释了聋生书面语教学法的重要性,进而提出聋生教育中需大力推行书面语教学法,指出具体操作措施,力求能给广大一线聋教工作者一些启示:重新审视聋生语言教学,采用切实有效的聋生书面语教学法。

关键词：聋生语言教学书面语教学重要措施

抗人CD40单克隆抗体偶联纳米胶束药物载体系统的构建及其生物学特性

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中国肿瘤生物治疗杂志 2013年第5期20卷 552-558页

作者：郑毅于洋瞿秋霞黄沁邱利焱张学光苏州大学基础医学与生物科学学院免疫学系江苏苏州215007 浙江大学药学院药物制剂研究所浙江杭州310058 苏州大学附属第一医院江苏省临床免疫研究所江苏苏州215007

目的:将抗人CD40单克隆抗体5C11与3种含有不同反应基团的聚合胶束(polymeric micelle,PM)偶联,构建相应5C11偶联的聚合胶束(5C11 coupled polymeric micelle,PM-5C11),筛选出其中最适合与5C11偶联的PM,并观察该偶联物的生物学特性。方法... 详细信息

目的:将抗人CD40单克隆抗体5C11与3种含有不同反应基团的聚合胶束(polymeric micelle,PM)偶联,构建相应5C11偶联的聚合胶束(5C11 coupled polymeric micelle,PM-5C11),筛选出其中最适合与5C11偶联的PM,并观察该偶联物的生物学特性。方法:分别合成3种不同化学结构的聚合物材料,制备相应PM,与5C11偶联后制备PM-5C11,选择其中偶联率和生物安全性均较高的作为最适PM-5C11。将最适PM-5C11与人Burkitt淋巴瘤Daudi细胞株作用,观测其生物学活性及其被Daudi细胞摄取的能力。结果:成功制备了分别含对甲苯磺酸酯基、丙烯基、羧基的3种PM,其中含对甲苯磺酸酯基和羧基的PM与5C11的偶联率均明显高于含丙烯基的PM的偶联率[(28.08±2.24)%、(29.06±1.37)%vs(21.26±1.04)%,P<0.05];由于含羧基的PM在制备过程中易残留细胞毒性物质,故选取含对甲苯磺酸酯基的PM作为最适PM。相应的最适PM成功偶联5C11形成PM-5C11,最适PM-5C11显示出5C11原有的生物学活性,并且可被Daudi细胞摄取。结论:构建的3种PM中,含对甲苯磺酸酯基的PM在生物安全性、偶联率及相应PM-5C11的生物学活性方面最优,可作为构建纳米药物载体的最佳选择。

关键词： CD40单克隆抗体聚合胶束纳米药物载体肿瘤免疫治疗 Burkitt淋巴瘤 Daudi细胞

计算机模建和点突变分析抗人CD40单克隆抗体5C11识别的抗原表位

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中国肿瘤生物治疗杂志 2011年第4期18卷 355-361页

作者：张婷张学光瞿秋霞章良苏州大学医学生物技术研究所江苏苏州215007 江苏省临床免疫学研究所江苏苏州215007 江苏省干细胞重点实验室江苏苏州215007

目的:通过计算机模拟与点突变实验初步探讨本课题组前期研制的抗人CD40激发型单克隆抗体5C11识别的抗原表位。方法:利用InsightⅡ软件分别模拟抗原、抗体结构,构建抗原抗体复合物模型,通过计算推测5C11单抗所识别的抗原表位。构建人野生... 详细信息

目的:通过计算机模拟与点突变实验初步探讨本课题组前期研制的抗人CD40激发型单克隆抗体5C11识别的抗原表位。方法:利用InsightⅡ软件分别模拟抗原、抗体结构,构建抗原抗体复合物模型,通过计算推测5C11单抗所识别的抗原表位。构建人野生型CD40(wtCD40)及其第70位苏氨酸突变型(70muCD40)和第114位谷氨酸突变型(114muCD40)的重组真核表达载体pIRES2-EGFP/wtCD40、pIRES2-EGFP/70muCD40和pIRES2-EGFP/114muCD40,脂质体转染法将重组载体导入HEK293细胞,筛选稳定转染细胞株(即HEK293/wtCD40、HEK293/70muCD40和HEK293/114muCD40细胞)。流式细胞术和Western blotting检测5C11单抗与HEK293/wtCD40、HEK293/70muCD40和HEK293/114muCD40细胞的结合能力。结果:成功构建pIRES2-EG-FP/wtCD40、pIRES2-EGFP/70muCD40和pIRES2-EGFP/114muCD40真核表达载体和相应稳定转染细胞株。5C11单抗与HEK293/70muCD40和HEK293/114muCD40细胞结合能力较HEK293/wtCD40细胞明显减弱;Western blotting检测结果表明,5C11单抗仅识别HEK293/wtCD40细胞,不识别HEK293/70muCD40和HEK293/114muCD40细胞。结论:人CD40氨基酸序列的第70位苏氨酸和第114位谷氨酸是其单抗5C11识别的抗原表位,对构建人源化CD40抗体具有潜在的临床意义。

关键词： CD40 抗原表位同源模建点突变肿瘤生物治疗

CD40突变体融合蛋白真核表达载体的构建及表达

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细胞与分子免疫学杂志 2012年第7期28卷 673-676页

作者：徐健瞿秋霞朱一蓓张学光苏州大学生物技术研究所江苏苏州215007 苏州大学附属第一医院临床免疫研究所江苏苏州215006

目的:构建CD40突变体(muCD40)融合蛋白的真核表达载体pIRES2-EGFP/muCD40Ig,并在中国仓鼠卵巢细胞(CHO)中表达,以获得muCD40Ig融合蛋白,为检测体内可溶性muCD40分子建立实验基础。方法:从L929/muCD40基因转染细胞中通过RT-PCR扩增出人mu... 详细信息

目的:构建CD40突变体(muCD40)融合蛋白的真核表达载体pIRES2-EGFP/muCD40Ig,并在中国仓鼠卵巢细胞(CHO)中表达,以获得muCD40Ig融合蛋白,为检测体内可溶性muCD40分子建立实验基础。方法:从L929/muCD40基因转染细胞中通过RT-PCR扩增出人muCD40胞外段基因序列,从人脾脏细胞中扩增出人IgG1恒定区基因,分别插入真核表达载体pIRES2-EGFP,采用Superfectin转染CHO细胞,G418筛选出能稳定分泌muCD40Ig蛋白的基因转染细胞并亚克隆。筛选出的阳性克隆经无血清培养后,收集上清进行Western blot检测;并收集细胞进行RT-PCR鉴定,同时用流式细胞仪分析muCD40Ig蛋白与CD40L的结合能力。结果:成功构建了人pIRES2-EGFP/muCD40Ig重组真核表达载体,PCR及Western blot结果显示该CHO基因转染细胞能够稳定分泌人muCD40Ig蛋白;流式检测muCD40Ig融合蛋白能够与CD40L分子结合。结论:获得了能稳定分泌人muCD40Ig的CHO基因转染细胞株,muCD40Ig融合蛋白具有与CD40L结合的能力。

关键词： CD40突变体融合蛋白真核表达

活化CD40信号上调胃癌细胞株PD-L1表达及其生物学功能

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免疫学杂志 2013年第5期29卷 400-403页

作者：庞雪芹瞿秋霞穆传勇陈成李锐徐晓苏州大学附属第一医院呼吸科临床免疫实验室 215006

目的观察CD40信号活化后胃癌细胞株增殖凋亡及其表面分子的变化情况并探讨其生物学意义。方法以高表达CD40分子的胃癌细胞株AGS和低表达CD40分子的BGC-823为研究对象,以可溶性CD40配体(sCD40L)激发细胞CD40信号,流式细胞术测定激发CD40... 详细信息

目的观察CD40信号活化后胃癌细胞株增殖凋亡及其表面分子的变化情况并探讨其生物学意义。方法以高表达CD40分子的胃癌细胞株AGS和低表达CD40分子的BGC-823为研究对象,以可溶性CD40配体(sCD40L)激发细胞CD40信号,流式细胞术测定激发CD40信号前后胃癌细胞表面PD-L1分子的表达情况和CD8+T淋巴细胞的表型变化;采用台盼蓝染色法比较CD40活化前后胃癌细胞对CD8+T淋巴细胞的抑制效应。结果 1)CD40信号活化可以诱导高表达CD40分子的胃癌细胞株AGS周期阻滞;2)CD40信号活化可上调AGS细胞表面PD-L1分子的表达,而对低表达CD40分子的细胞BGC-823无上调效应。3)AGS细胞表面PD-L1分子上调明显抑制CD8+T淋巴细胞的增殖并下调其表面CD25分子的表达。结论 CD40信号活化可上调胃癌细胞表面PD-L1表达,继而诱导效应细胞的数量和功能下降,最终有利于胃癌发生免疫逃逸。

关键词： CD40 PD-L1 胃癌免疫逃逸

激发型CD40单抗对宫颈癌细胞株SiHa化疗敏感性的影响

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现代妇产科进展 2010年第4期19卷 261-264页

作者：黄沁瞿秋霞张学光苏州大学附属第一医院妇产科苏州215006 苏州大学医学生物技术研究所

目的:研究激发型CD40单抗(5C11)对宫颈癌细胞株SiHa化疗敏感性的影响及其机制。方法:采用流式细胞术检测宫颈癌细胞株SiHa上CD40分子的表达,用MTT法检测5C11联合化疗药物对SiHa细胞的作用,PI染色检测SiHa细胞周期的变化,Annexin V-PI法... 详细信息

目的:研究激发型CD40单抗(5C11)对宫颈癌细胞株SiHa化疗敏感性的影响及其机制。方法:采用流式细胞术检测宫颈癌细胞株SiHa上CD40分子的表达,用MTT法检测5C11联合化疗药物对SiHa细胞的作用,PI染色检测SiHa细胞周期的变化,Annexin V-PI法检测细胞凋亡,RT-PCR方法分析单抗5C11作用SiHa细胞后凋亡基因表达水平变化。结果:宫颈癌细胞株SiHa高表达CD40,5C11和盐酸吉西他滨单独抑制细胞生长作用不明显,但两者联合能显著抑制SiHa生长和促进凋亡,SiHa细胞经5C11作用后出现S期阻滞,抗凋亡基因bcl-XL表达明显下调,促凋亡基因Bax的上调作用不明显。结论:CD40分子通过介导S期阻滞和调节凋亡基因表达水平增加SiHa细胞对盐酸吉西他滨化疗的敏感性。

关键词：宫颈肿瘤抗原,CD40 抗体,单克隆细胞系化疗敏感性

抗人CD154人-鼠嵌合抗体Fab段的构建和表达

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细胞与分子免疫学杂志 2007年第6期23卷 569-571页

作者：葛彦陈永井瞿秋霞张学光苏州大学生物技术研究所江苏苏州215007 苏州大学附属第一医院临床免疫学实验室江苏苏州215007

目的:通过基因工程技术构建和表达抗人CD154人-鼠嵌合抗体Fab段。方法:从分泌鼠抗人CD154单克隆抗体(mAb)的杂交瘤细胞株4F1中提取总RNA,分别采用特异性引物扩增mAb VH和VL的DNA编码区基因。同时,从人脾脏细胞中克隆出免疫球蛋白恒定区... 详细信息

目的:通过基因工程技术构建和表达抗人CD154人-鼠嵌合抗体Fab段。方法:从分泌鼠抗人CD154单克隆抗体(mAb)的杂交瘤细胞株4F1中提取总RNA,分别采用特异性引物扩增mAb VH和VL的DNA编码区基因。同时,从人脾脏细胞中克隆出免疫球蛋白恒定区基因。利用基因重组技术构建嵌合Fab共表达载体pTXB1-Fab,利用大肠杆菌表达简单,高效,成本低廉的特点,对重组Fab进行原核表达。利用SDS-PAGE电泳、Western blot、流式细胞术对表达产物进行鉴定。结果:NCBI数据库BLAST显示,克隆的基因序列符合小鼠Ig可变区特征。表达质粒pTXB1-Fab构建正确,在大肠杆菌中实现可溶性表达。表达的人-鼠嵌合抗体与亲本抗体具有相同的识别位点。结论:成功地克隆获得阻断型抗人CD154 mAb(4F1)的轻链、重链可变区基因,成功构建pTXB1-Fab共表达载体,在大肠杆菌中实现可溶性表达,为人源化抗体的制备奠定了技术基础。

关键词：单克隆抗体 CD154 Fab