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乳品中细菌与酵母菌PMA-qPCR活菌检测方法的建立

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乳品中细菌与酵母菌PMA-qPCR活菌检测方法的建立

作者：盖冬雪吉林大学

学位级别：硕士

乳品中富含蛋白质、氨基酸、矿物质等多种营养成分,口感佳、易消化,深受消费者青睐。但是乳品的质量与安全问题严重制约了我国乳品行业的发展,如何保障乳品的质量与安全成为生产企业与消费者共同瞩目的焦点。微生物污染是威胁乳品安全... 详细信息

乳品中富含蛋白质、氨基酸、矿物质等多种营养成分,口感佳、易消化,深受消费者青睐。但是乳品的质量与安全问题严重制约了我国乳品行业的发展,如何保障乳品的质量与安全成为生产企业与消费者共同瞩目的焦点。微生物污染是威胁乳品安全的主要因素之一,受到微生物污染的乳品会变质、腐败、胀袋。致病微生物污染还可能会引发食物中毒,威胁消费者的健康。国标常规检测方法耗时长,不适用于乳品加工企业现代化生产模式。因此,乳品中微生物快速检测技术的研发备受乳品企业关注。本实验采用叠氮溴化丙锭(PMA)结合q PCR对乳制品样品中活菌DNA进行定量,分别建立一种快速检测巴氏乳中细菌与发酵乳中酵母菌活菌总数的检测方法。首先采集广泽乳业生产的巴氏乳及发酵乳样品500份,分离巴氏乳中污染的细菌与发酵乳中污染的酵母菌,通过形态学、分子生物学与生化实验对分离得到的微生物进行鉴定。结果显示,巴氏乳中污染的细菌包括:阴沟肠杆菌、大肠埃希菌、蜂房哈夫尼亚菌、阪崎肠杆菌、溶血链球菌、格式乳球菌、中间葡萄球菌、绿浅气球菌、溶血性葡萄球菌、克氏库克菌。发酵乳中酵母菌包括:马克思克鲁维酵母菌、库德里阿兹威氏毕赤酵母菌、热带假丝酵母菌。分别优化不同菌种的PMA处理条件,确定巴氏乳中细菌最佳PMA工作浓度为15μg/m L,暗孵育时间10 min,曝光时间15 min。确定发酵乳中酵母菌最佳PMA工作浓度为15μg/m L,暗孵育时间与曝光时间均为10 min。通过q PCR定量分析,分别建立细菌及酵母菌的菌浓度对数与相应Ct值的标准曲线。参照国标GB19645-2010与GB19302-2010,分别确定巴氏乳中细菌总数与发酵乳中酵母菌总数超标的参考Ct值范围。结果显示:巴氏乳奶样品中细菌浓度为105 CFU/m L的Ct范围为27.240.85;发酵乳样品中酵母菌浓度为102 CFU/m L的Ct范围为33.975.24。分别对巴氏乳与发酵乳样品进行PMA-q PCR法与国标法检测,验证两种乳品中PMA-q PCR活菌检测方法的准确性。巴氏乳中细菌PMA-q PCR活菌检测结果与国标法符合率大于93.3%,发酵乳中酵母菌PMA-q PCR活菌检测结果与国标法符合率大于86.6%,检测时间约为4 h。该方法可快速判断加工后的乳品是否合格,及时反馈检测信息,适用于乳品加工企业生产线的现场评价。

关键词：巴氏乳发酵乳细菌酵母菌活菌总数 PMA-qPCR

中国男篮与伊朗男篮阵地进攻中基础配合运用的对比研究 ——以第27届亚锦赛为例

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中国男篮与伊朗男篮阵地进攻中基础配合运用的对比研究 ——以第2...

作者：盖冬雪湖南师范大学

学位级别：硕士

2013年第27届菲律宾亚洲男子篮球锦标赛圆满落下帷幕。上届亚锦赛中国队获得了冠军,因此本届比赛中国队备受关注。本次亚锦赛上中国队与另一支亚洲强队伊朗队的交锋被视为一场焦点之战,两队也是赛前夺冠呼声最高的两支球队,但是中国队... 详细信息

2013年第27届菲律宾亚洲男子篮球锦标赛圆满落下帷幕。上届亚锦赛中国队获得了冠军,因此本届比赛中国队备受关注。本次亚锦赛上中国队与另一支亚洲强队伊朗队的交锋被视为一场焦点之战,两队也是赛前夺冠呼声最高的两支球队,但是中国队最终以51：70输掉了比赛。本文以阵地进攻中基础配合为主要研究内容,运用文献资料法、数据统计法、录像观察法等研究方法,针对中国队同伊朗队比赛进行详细统计,依据进攻基础配合运用情况的统计数据进行对比分析,找出两队进攻端特征,分析中国队落败原因：(1)中国队在进攻端运用基础配合的总数无优势可言,配合成功率不高,没能将配合转化为得分,进攻端采用的进攻基础配合的形式也相对比较单一,没能完全发挥自身优势;(2)中国队在阵地进攻运用掩护配合较多,但质量不高,伊朗队侧重突分配合,成功率高于中国队,将进攻配合有效地转化为得分,在半场就确立了领先优势;(3)本场比赛中国队在防守端明显表现为应对方法不多,进攻端又很难形成进攻机会。反之,伊朗队本场比赛心态端正,进攻组织有序,基础配合完成效果较好,从而取得比赛胜利;(4)中国队失利的根源在于阵地进攻基础配合的运用没能发挥出以往水平,导致内外线脱节;出现机会把握机会能力不强;投篮命中率不高;而伊朗队基础配合运用合理,成功率相对较高,最终获得比赛胜利。本研究旨在于通过两队进攻基础配合运用情况对比分析,找出中国队大比分落败原因,分析出中国队本场比赛基础配合出现问题,这对于总结现代篮球阵地进攻战术的发展趋势有一定的理论意义,也能为中国男篮备战以后亚锦赛分析实力较强对手的打法特点提供一点理论依据。

关键词：第27亚锦赛中国男篮阵地进攻基础配合

乳品中热带假丝酵母菌的双抗夹心ELISA快速检测方法

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食品工业科技 2016年第24期37卷 63-68页

作者：常江刘熙柳增善任洪林卢士英胡盼李岩松盖冬雪金雯张嵩孟宪梅人兽共患病研究教育部重点实验室吉林大学人兽共患病研究所吉林大学动物医学学院吉林长春130062 吉林工商学院粮油食品深加工吉林省高校重点实验室吉林长春130507 广泽乳业有限公司吉林长春130102

本研究用于乳品中热带假丝酵母菌的快速检测。采用热带假丝酵母菌超声破碎后的上清蛋白作为免疫原分别免疫新西兰大耳白兔和Hartley豚鼠,获得热带假丝酵母菌的多克隆抗体。以兔抗体作为捕获抗体,豚鼠抗体作为检测抗体,通过矩阵法及正交... 详细信息

本研究用于乳品中热带假丝酵母菌的快速检测。采用热带假丝酵母菌超声破碎后的上清蛋白作为免疫原分别免疫新西兰大耳白兔和Hartley豚鼠,获得热带假丝酵母菌的多克隆抗体。以兔抗体作为捕获抗体,豚鼠抗体作为检测抗体,通过矩阵法及正交分析建立乳品中热带假丝酵母菌快速、特异的双抗夹心ELISA检测方法。该方法检出限为98 ng/m L,板内变异系数小于2%,板间变异系数小于6%,特异性及重复性良好。实际样品检测中,通过对乳制品进行滤膜集菌并选择性增菌培养,超声后提取的蛋白上清应用本研究建立的双抗夹心ELISA检测方法,100 CFU/m L热带假丝酵母菌可在22 h内准确检测出阳性反应。

关键词：乳品热带假丝酵母菌双抗夹心ELISA 快速检测选择性增菌滤膜集菌

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鲜乳中常见污染细菌的分离与鉴定

中国乳品工业 2014年第6期42卷 16-18,33页

作者：刘艳艳卢士英任洪林崔成盖冬雪丁燕霞柳增善孟宪梅吉林工商学院粮油食品深加工吉林省高校重点实验室长春130062 吉林大学动物医学学院人兽共患病研究教育部重点实验室长春130062

对吉林省污染鲜乳的细菌进行分离鉴定,以分析本地区鲜乳污染情况,为建立针对性检测鲜乳中的污染细菌提供参考。采集吉林省部分地区奶牛养殖场及农户散养奶牛自产鲜乳,采用常规培养方法进行分离培养。用聚合酶链式反应(PCR)扩增细菌16S r... 详细信息

对吉林省污染鲜乳的细菌进行分离鉴定,以分析本地区鲜乳污染情况,为建立针对性检测鲜乳中的污染细菌提供参考。采集吉林省部分地区奶牛养殖场及农户散养奶牛自产鲜乳,采用常规培养方法进行分离培养。用聚合酶链式反应(PCR)扩增细菌16S rDNA,对PCR产物测序、分析,与Genbank上已知的细菌16S rDNA序列对比同源性,交叉同源性较高的细菌进行生化实验加以补充鉴定。结果表明,分离并鉴定出吉林省污染鲜乳的常见细菌,为鲜乳在生产加工过程中有针对性的检测特异性细菌奠定了基础。

关键词：鲜乳分离鉴定常规培养 16S rDNA 聚合酶链式反应

灭菌乳中活阪崎肠杆菌PMA-PCR检测方法的建立

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中国畜牧兽医 2014年第2期41卷 65-69页

作者：刘艳艳柳增善卢士英任洪林盖冬雪崔成丁艳霞孟宪梅于师宇人兽共患病研究教育部重点实验室吉林大学人兽共患病研究所吉林大学动物医学学院吉林长春130062 吉林工商学院粮油食品深加工吉林省高校重点实验室吉林长春130062 福建出入境检验检疫局福建福州350001

本试验旨在建立灭菌乳中活阪崎肠杆菌(Enterobacter sakazakii)的PMA-PCR检测方法。将DNA染料叠氮溴化丙锭(propidium monoazide,PMA)与聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)技术结合,优化PMA最佳工作浓度和曝光时间,确定PMA-PCR区别死、活阪崎肠杆菌细胞的最佳条件。结果表明,活阪崎肠杆菌经100℃沸水处理20min可完全致死,PMA完全与死阪崎肠杆菌DNA共价交联并光解溶液中游离PMA的最佳曝光时间为15min,完全抑制死阪崎肠杆菌PCR扩增的最小PMA浓度为5μg/mL,不抑制活阪崎肠杆菌PCR扩增的最大PMA浓度为15μg/mL。经PMA处理后,在含有不同比例的死、活阪崎肠杆菌混合液中检测到活阪崎肠杆菌的最低检测限为40CFU/mL,在灭菌乳样品中检测到活阪崎肠杆菌的最低检测限为100CFU/mL。该方法为利用PMA-PCR检测食品中的活阪崎肠杆菌奠定了基础。

关键词： PMA PCR 阪崎肠杆菌灭菌乳

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乳品中大肠杆菌PMA-qPCR活菌检测方法的建立

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中国畜牧兽医 2016年第2期43卷 493-498页

作者：盖冬雪任洪林卢士英胡盼孟宪梅刘熙宋德刚金雯张嵩常江刘艳艳柳增善吉林大学人兽共患病研究所人兽共患病教育部重点实验室长春130062 吉林工商学院粮油食品深加工吉林省高校重点实验室长春130000 广泽乳业有限公司长春130000 山东省东营市利津县第二中学东营257400

本试验旨在建立一种乳品中大肠杆菌PMA-qPCR活菌检测方法。优化qPCR检测方法,探究菌浓度为1×108 CFU/mL的大肠杆菌活菌悬液、热致死菌悬液细胞数来确定不同的PMA剂量、暗孵育时间、曝光时间对死菌抑制效果的影响,确定最佳PMA处理方案... 详细信息

本试验旨在建立一种乳品中大肠杆菌PMA-qPCR活菌检测方法。优化qPCR检测方法,探究菌浓度为1×108 CFU/mL的大肠杆菌活菌悬液、热致死菌悬液细胞数来确定不同的PMA剂量、暗孵育时间、曝光时间对死菌抑制效果的影响,确定最佳PMA处理方案。结果表明,qPCR检测可特异性扩增大肠杆菌,1×108 CFU/mL的大肠杆菌经90℃水浴30s全部致死后,采用10μg/mL的PMA暗孵育15min后冰上曝光10min为最佳处理方案,这种处理方案可最大程度抑制死细胞信号,而对活细胞几乎没有影响,样品中微生物初始浓度不低于1×108 CFU/mL时较稳定,得到标准曲线回归方程y=-3.356x+47.413,R2=0.9989,最低检测限为103 CFU/mL,加标样本检测结果与实际相符。该方法为利用PMA-qPCR检测食品中的活大肠杆菌杆菌奠定了基础。

关键词：大肠杆菌叠氮溴化丙啶 qPCR 计数

乳品中细菌与酵母菌PMA-PCR活菌检测方法的建立

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乳品中细菌与酵母菌PMA-PCR活菌检测方法的建立

巴氏杀菌乳中细菌PMA-PCR活菌检测方法的建立

中国毒理学会兽医毒理学委员会与中国畜牧兽医学会兽医食品...

作者：胡盼盖冬雪卢士英任洪林赵柯张虹柳增善吉林大学人兽共患病教育部重点实验室/动物医学学院吉林大学人兽共患病研究所

【目的】乳品中富含蛋白质、氨基酸、矿物质等多种营养成分,口感佳、易消化,深受消费者青睐。但是乳品的质量与安全严重制约了我国乳品行业的发展。如何保障乳品的质量与安全成为生产企业与消费者共同瞩目的焦点。微生物污染是威胁乳品... 详细信息

【目的】乳品中富含蛋白质、氨基酸、矿物质等多种营养成分,口感佳、易消化,深受消费者青睐。但是乳品的质量与安全严重制约了我国乳品行业的发展。如何保障乳品的质量与安全成为生产企业与消费者共同瞩目的焦点。微生物污染是威胁乳品安全的主要因素之一,受到微生物污染的乳品会变质、腐败、胀袋。致病微生物污染还可能会引发食物中毒,威胁消费者的健康。国标常规检测方法耗时长(24h以上),不适用于乳品加工企业现代化生产模式,因此,乳品中微生物快速检测技术的研发备受乳品企业关注。本实验拟采用叠氮溴化丙锭(PMA)结合qPCR对乳制品样品中活菌DNA进行定量,分别建立一种快速检测巴氏杀菌乳中细菌与发酵乳中酵母菌活菌总数的检测方法。【方法】首先采集广泽乳业生产的巴氏杀菌乳及发酵乳样品约600份,分离巴氏杀菌乳中污染的细菌与发酵乳中污染的酵母菌,通过形态学观察、分子生物学与生化实验对分离得到的微生物进行鉴定。然后分别优化不同菌种的PMA处理条件。通过qPCR定量分析,分别建立细菌及酵母菌的菌浓度对数与相应Ct值的标准曲线。参照国标GB19645-2010与GB19302-2010,分别确定巴氏杀菌乳中细菌总数与发酵乳中酵母菌总数超标的参考Ct值范围。分别对巴氏杀菌乳与发酵乳实际样品进行PMA-qPCR法、qPCR法及国标法检测,验证PMA-qPCR检测方法的准确性。【结果】巴氏杀菌乳中污染的细菌包括:阴沟肠杆菌、大肠埃希菌、蜂房哈夫尼亚菌、阪崎肠杆菌、溶血链球菌、格式乳球菌、中间葡萄球菌、绿浅气球菌、溶血性葡萄球菌、克氏库克菌。发酵乳中酵母菌包括:马克斯克鲁维酵母菌、库德里阿兹威氏毕赤酵母菌、热带假丝酵母菌。确定巴氏杀菌乳中细菌最佳PMA工作浓度为15μg/mL,暗孵育时间10 min,曝光时间15 min。发酵乳中酵母菌最佳PMA工作浓度为15μg/mL,暗孵育时间与曝光时间均为10 min。qPCR定量分析结果显示:巴氏乳奶样品中细菌浓度为10CFU/mL的Ct范围为27.240.85;发酵乳样品中酵母菌浓度为10CFU/mL的Ct范围为34.814.98。该方法的检测周期为4 h,准确率高于90%。

关键词：乳品细菌酵母菌活菌总数 PMA-qPCR

来源： cnki会议评论

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巴氏杀菌乳中细菌PMA-PCR活菌检测方法的建立

中国畜牧兽医学会兽医公共卫生学分会第五次学术研讨会

作者：盖冬雪刘熙胡盼卢士英任洪林李岩松柳增善人兽共患病教育部重点实验室/吉林大学动物医学学院广泽乳业有限公司

乳品因其营养物质丰富口感良好备受消费者亲睐,但近年来乳品安全事件不断被媒体曝光,乳品的质量与安全成为生产企业与消费者共同瞩目的焦点。微生物污染是造成乳品安全事件的主要因素之一,受微生物污染会导致产品变质、腐败、胀袋,严重...

乳品因其营养物质丰富口感良好备受消费者亲睐,但近年来乳品安全事件不断被媒体曝光,乳品的质量与安全成为生产企业与消费者共同瞩目的焦点。微生物污染是造成乳品安全事件的主要因素之一,受微生物污染会导致产品变质、腐败、胀袋,严重者会引发食物中毒等严重事故。常规检测方法耗时长,不适用于企业生产加工过程中信息的及时反馈。因此,建立一种快速检测乳品中细菌活菌总数的检测方法对乳品生产加工企业十分必要。本实验首先从广泽乳业采集原料乳及巴氏杀菌乳样品约500份,分离样品中污染细菌,利用16S r DNA序列测序法及生化实验法进行鉴定,确定微生物污染菌谱。利用叠氮溴化丙锭(PMA)与q PCR技术结合,定量样品微生物中细菌活菌的16S r DNA,建立一种快速计数巴氏杀菌乳中细菌活菌总数检测方法。优化PMA处理条件,确定细菌死活筛选的最佳处理为PMA工作浓度15μg/m L,暗孵育时间10 min,曝光时间15 min。通过q PCR分析,建立细菌浓度对数与Ct值的标准曲线,最低检测限为103 CFU/m L。参照国标GB19645-2010,当巴氏杀菌乳中的细菌总数限量值为1×105 CFU/g(m L),对细菌浓度在1×105 CFU/m L时加标污染牛奶的Ct值进行分析,得到了巴氏杀菌乳中细菌数量超标的参考Ct值范围。结果显示:细菌浓度为1×105 CFU/m L的Ct值范围为27.240.85;对100份实际样品采取PMA-q PCR法与国标法同时进行检测,验证PMA-q PCR活菌检测方法的准确性。结果显示:该方法的检测时间在4 h左右,准确率高于90%,能够快速检测巴氏杀菌乳中细菌的活菌总数。

关键词：

来源： cnki会议评论

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我国慢投垒球现状调查与分析

当代体育科技 2016年第28期6卷 144-144,146页

作者：宋凯盖冬雪抚顺市体育运动学校抚顺市第二中学辽宁抚顺113006

在西方发达国家,慢投垒球运动十分普及,具有一定的群众基础,但当前我国的垒球运动水平仍然十分低下,处于危机与机遇并存的状态,为了进一步开展此项运动,我国应学会借鉴发达国家的先进经验,并制定出符合我国实际国情的发展措施,这样才可... 详细信息

在西方发达国家,慢投垒球运动十分普及,具有一定的群众基础,但当前我国的垒球运动水平仍然十分低下,处于危机与机遇并存的状态,为了进一步开展此项运动,我国应学会借鉴发达国家的先进经验,并制定出符合我国实际国情的发展措施,这样才可以使我国的慢投垒球运动更具有实用价值。该文通过文献资料、实地调查以及对比分析等方法,调查分析了我国慢投垒球运动的现状调查,并提出了一系列可行的发展措施。

关键词：慢投垒球现状调查分析