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重组人β淀粉样蛋白1-42在毕赤酵母中的分泌表达

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重组人β淀粉样蛋白1-42在毕赤酵母中的分泌表达

作者：申茉函吉林大学

学位级别：硕士

Aβ蛋白(β-amyoid peptide)是1984年Glenne等发现脑内神经炎斑的主要成分,它是一种由39～43个氨基酸组成,具有β折叠构型的蛋白,因此称之为β-淀粉样蛋白。本研究以实验室构建的含人Aβ基因的质粒为模板,已将编码Aβ氨基酸的遗传密码... 详细信息

Aβ蛋白(β-amyoid peptide)是1984年Glenne等发现脑内神经炎斑的主要成分,它是一种由39～43个氨基酸组成,具有β折叠构型的蛋白,因此称之为β-淀粉样蛋白。本研究以实验室构建的含人Aβ基因的质粒为模板,已将编码Aβ氨基酸的遗传密码子全部换成了酵母偏爱的密码子。设计表达引物在5’端引入XhoⅠ酶切位点和所需的Kex2结构,在3’端加上终止密码子taa和EcoRⅠ酶切位点,通过PCR扩增获得了人酵母偏爱型的成熟肽Aβ基因。构建了Aβ的表达载体pPICZα-Aβ,通过电转化将其转染到酵母菌X-33后,筛选出稳定高效的分泌表达Aβ的工程菌株。经SDS-PAGE检测表达上清,结果显示表达上清中存在相对分子量约为4000 D的Aβ蛋白。本实验首次用酵母表达体系获得了重组人Aβ蛋白,并建立了大规模发酵和初步的纯化体系,为解决Aβ工程化大规模生产,研究其生物学功能及临床应用奠定了基础。

关键词：重组人Aβ1-42基因重组人Aβ1-42蛋白毕赤酵母分泌表达发酵

rhTRAIL对黑色素瘤A-375细胞凋亡的影响

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吉林大学学报（医学版） 2008年第4期34卷 565-568,F0002页

作者：陈伟莉牟旭鹏班磊刘韦申茉函颜炜群吉林大学药学院生物工程教研室

目的:研究重组人肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体(rhTRAIL)对黑色素瘤A-375细胞生长及诱导细胞凋亡的影响,并探讨其可能机制。方法:将培养的黑色素瘤A-375细胞分为对照组和rhTRAIL低、中、高剂量组(0.25、0.50、1.00mg·L-1),经不同剂量... 详细信息

目的:研究重组人肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体(rhTRAIL)对黑色素瘤A-375细胞生长及诱导细胞凋亡的影响,并探讨其可能机制。方法:将培养的黑色素瘤A-375细胞分为对照组和rhTRAIL低、中、高剂量组(0.25、0.50、1.00mg·L-1),经不同剂量rhTRAIL作用后,观察细胞形态;MTT法检测细胞存活分数;TUNEL法检测细胞凋亡率;流式细胞仪检测细胞凋亡及细胞周期变化。结果:对照组细胞呈梭形贴壁或半贴壁生长,rhTRAIL组一部分细胞变圆,贴壁不佳,细胞数低于对照组。与对照组比较,rhTRAIL明显抑制黑色素瘤A-375的生长,1.00mg·L-1组的生长抑制率最高,0.50mg·L-1组次之,0.25mg·L-1组最低,3组间比较差异有显著性(P<0.05)。流式细胞检测结果显示,rhTRAIL蛋白可诱导A-375细胞凋亡,rhTRAIL低、中、高剂量组细胞凋亡率分别为6.68%、24.59%和28.91%,且凋亡率随剂量增大而升高,3组间比较差异有显著性(P<0.05)。rhTRAIL低、中、高剂量组细胞处于G1期的百分率(45.26%、60.67%和69.10%)明显高于对照组(37.41%)(P<0.05)。结论:rhTRAIL对A-375细胞生长有显著的抑制作用,呈剂量依赖性,其机制可能与细胞周期阻滞、诱导细胞凋亡有关。

关键词：黑色素瘤 TRAIL 细胞凋亡}细胞周期

甲型流感病毒M2e与人血清白蛋白融合蛋白在毕赤酵母中的分泌表达

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中国老年学杂志 2010年第5期30卷 617-619页

作者：牟旭鹏韦安慧申茉函孔宁颜炜群吉林大学药学院吉林长春130021

目的将甲型流感病毒M2蛋白胞外区(M2e)基因与人血清白蛋白(HSA)基因融合,以构建高效分泌表达的毕赤酵母菌株。方法通过RT-PCR扩增HSA基因,构建pPICZα-HSA质粒,将人工合成的M2e序列与pPICZα-HSA质粒分别经BstBI和KpnI酶切消化后连接,... 详细信息

目的将甲型流感病毒M2蛋白胞外区(M2e)基因与人血清白蛋白(HSA)基因融合,以构建高效分泌表达的毕赤酵母菌株。方法通过RT-PCR扩增HSA基因,构建pPICZα-HSA质粒,将人工合成的M2e序列与pPICZα-HSA质粒分别经BstBI和KpnI酶切消化后连接,构建真核表达载体pPICZα-HSA/M2e,线性化后电转化毕赤酵母X-33。用PCR法筛选Zeocin抗性阳性的克隆,SDS-PAGE和Western印迹法筛选高表达HSA/M2e菌株。结果经RT-PCR法克隆的HSA基因序列与GenBank登录的cDNA序列一致,构建的pPICZα-HSA/M2e真核表达载体,经电转化获得Zeocin抗性阳性的克隆。SDS-PAGE和Western印迹分析证实了甲醇诱导的培养基上清中含有HSA/M2e,分子量约为68kD。结论成功构建了分泌表达重组HSA/M2e融合蛋白的毕赤酵母菌株,为进一步研究其生物学活性奠定了基础。

关键词：甲型流感病毒 M2e 血清白蛋白毕赤酵母

重组人β-淀粉样蛋白1-42在毕赤酵母中的表达与鉴定

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吉林大学学报（医学版） 2008年第6期34卷 1083-1085页

作者：申茉函王全才牟旭鹏陈洪波牛超颜炜群吉林大学再生医学科学研究所生物化学研究室吉林长春130021 中国医科大学盛京医院第一神经外科辽宁沈阳110003

目的:探索在毕赤酵母中表达人β-淀粉样蛋白1-42(hAβ1-42)的可行性。方法:以含有hAβ1-42基因的质粒为模板,采用PCR方法扩增所需DNA片段,与毕赤酵母表达载体pPICZα连接,构建重组质粒pPICZα-hAβ1-42并进行DNA测序分析。将其电击转化... 详细信息

目的:探索在毕赤酵母中表达人β-淀粉样蛋白1-42(hAβ1-42)的可行性。方法:以含有hAβ1-42基因的质粒为模板,采用PCR方法扩增所需DNA片段,与毕赤酵母表达载体pPICZα连接,构建重组质粒pPICZα-hAβ1-42并进行DNA测序分析。将其电击转化毕赤酵母菌株X-33,经SDS-PAGE和Western blotting分析表达产物。结果:经测序证实,获得的hAβ1-42序列与基因合成的完全一致。SDS-PAGE显示,在约4000处有一蛋白带,Western blotting证明表达产物与抗hAβ1-42抗体有特异性免疫反应。结论:本研究在毕赤酵母中成功地重组表达hAβ1-42。

关键词：阿尔茨海默病 β-淀粉样蛋白毕赤酵母表达

Leo自膨式支架结合弹簧圈栓塞宽颈动脉瘤10例

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中国老年学杂志 2008年第13期28卷 1305-1307页

作者：王全才申茉函喻博刘云会中国医科大学盛京医院第一神经外科辽宁沈阳110044 吉林大学药学院

目的总结Leo自膨式支架结合弹簧圈栓塞宽颈动脉瘤的技术和经验。方法回顾分析10例颅内宽颈动脉瘤病人的病例资料，瘤颈为3～5mm，宽颈不规则动脉瘤7例，梭形动脉瘤3例。均采用Leo自膨式支架结合弹簧圈栓塞技术治疗。结果9例完全栓塞，1... 详细信息

目的总结Leo自膨式支架结合弹簧圈栓塞宽颈动脉瘤的技术和经验。方法回顾分析10例颅内宽颈动脉瘤病人的病例资料，瘤颈为3～5mm，宽颈不规则动脉瘤7例，梭形动脉瘤3例。均采用Leo自膨式支架结合弹簧圈栓塞技术治疗。结果9例完全栓塞，1例大部分栓塞。1例术后复查头CT发现颅内血肿，予以开颅清除血肿。6例随访3～6个月。结论在栓塞颅内宽颈动脉瘤时应用Leo自膨式支架结合弹簧圈技术，能够提高宽颈动脉瘤栓塞的安全性，阻止弹簧圈向载瘤动脉内突人，从而提高疗效。

关键词：支架宽颈动脉瘤弹簧圈

β淀粉样蛋白1～42促进U87细胞凋亡作用的研究

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中国老年学杂志 2015年第4期35卷 1007-1010页

作者：申茉函王全才中国医科大学附属盛京医院辽宁沈阳110004 辽宁省人民医院神经外二科

目的研究重组人β淀粉样蛋白(Aβ)1~42对人神经胶质瘤细胞U87毒性作用机制。方法用MTT检测代谢率,倒置显微镜、投射电镜以及流式细胞术技术研究Aβ1~42对U87细胞的损伤作用机制。结果用Aβ1~42处理U87细胞24 h后,Aβ1~42剂量依赖性地引... 详细信息

目的研究重组人β淀粉样蛋白(Aβ)1~42对人神经胶质瘤细胞U87毒性作用机制。方法用MTT检测代谢率,倒置显微镜、投射电镜以及流式细胞术技术研究Aβ1~42对U87细胞的损伤作用机制。结果用Aβ1~42处理U87细胞24 h后,Aβ1~42剂量依赖性地引起U87细胞的MTT代谢率减少。倒置显微镜及透射电镜观察发现经Aβ1~42处理的U87细胞表现出凋亡细胞的特征。流式细胞仪检测表明10、20、50μmol/L的Aβ1~42组U87细胞的凋亡率分别为35.6%,42.2%,58.1%。结论 Aβ1~42致U87细胞发生损伤主要是通过细胞凋亡的途径。

关键词： β淀粉样蛋白1~42 U87细胞凋亡

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β淀粉样蛋白142促进神经细胞凋亡

中国老年学杂志 2015年第13期35卷 3498-3501页

作者：申茉函王全才杨丽中国医科大学附属盛京医院辽宁沈阳110004 辽宁省人民医院吉林大学人兽共患病研究所教育部重点实验室

目的探讨重组人β淀粉样蛋白(Aβ)1~42对人神经胶质瘤细胞U251的凋亡作用。方法体外培养的神经胶质瘤细胞U251分为对照组和实验组。实验组根据Aβ1~42作用终浓度的不同,分为0.5、1、5、10和20μmol/L 5个亚组,分别培养24 h后,采用MTT法... 详细信息

目的探讨重组人β淀粉样蛋白(Aβ)1~42对人神经胶质瘤细胞U251的凋亡作用。方法体外培养的神经胶质瘤细胞U251分为对照组和实验组。实验组根据Aβ1~42作用终浓度的不同,分为0.5、1、5、10和20μmol/L 5个亚组,分别培养24 h后,采用MTT法检测细胞存活,AO/EB光镜荧光染色技术、透射电镜以及Western印迹技术检测凋亡蛋白Bax、Bcl-2研究Aβ1~42损伤U251的途径。结果 Aβ1~42作用神经胶质瘤细胞24 h后,Aβ1~42剂量依赖性地引起U251细胞的代谢率减少;荧光染色及电镜观察经Aβ1~42处理的U251细胞表现出凋亡细胞的特征;Western印迹检测发现Bcl-2表达量随剂量的增加而明显下调,而Bax的表达则相反。结论 Aβ1~42对U251细胞的损伤可能主要通过细胞凋亡的途径。

关键词： β淀粉样蛋白神经胶质瘤细胞凋亡

重组人β-淀粉样蛋白1-42大规模发酵及纯化工艺

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吉林大学学报（医学版） 2009年第1期35卷 34-38页

作者：申茉函王全才刘佳伟韦安慧朱洁颜炜群吉林大学药学院医学生物工程研究室吉林长春130021 中国医科大学盛京医院神经外科辽宁沈阳110003 吉林省长春市第六医院ECT醒脉通治疗室吉林长春130052

目的：在毕赤酵母（Pichia pastoris）中高效表达人β-淀粉样蛋白1-42（hAβ1-42），用80L的发酵罐大量制备hAβ1-42。方法：在成功构建表达载体pPICZα—hAβ1-42并电转化至毕赤酵母X-33的基础上，筛选高表达hAβ1-42工程菌，对发酵液... 详细信息

目的：在毕赤酵母（Pichia pastoris）中高效表达人β-淀粉样蛋白1-42（hAβ1-42），用80L的发酵罐大量制备hAβ1-42。方法：在成功构建表达载体pPICZα—hAβ1-42并电转化至毕赤酵母X-33的基础上，筛选高表达hAβ1-42工程菌，对发酵液的pH值、溶解氧、甲醇流加速度以及诱导表达的时间等发酵条件进行系统优化，通过阳离子交换层析和反向疏水层析对其进行纯化，实现其大规模制备。结果：筛选出的高表达工程菌采用80L发酵罐甲醇诱导补料批式发酵，在pH4．0、溶解氧浓度20％～30％、罐内压力为10psi、甲醇诱导48h时产量最高可达150mg·L^-1；纯化的hAβ1-42经SDS-PAGE分析显示单一区带，相对分子质量约为4200。结论：构建、筛选出高效表达hAβ1-42的毕赤酵母工程菌，并建立稳定的发酵和纯化制备工艺。

关键词： β-淀粉样蛋白发酵分离提纯

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康复中心住院患者医院感染发病率及危险因素

中国感染控制杂志 2019年第10期18卷 964-968页

作者：申茉函陈方圆王彤张秀月中国医科大学附属盛京医院院内感染管理办公室辽宁沈阳110001 中国医科大学附属盛京医院康复中心辽宁沈阳110001

目的探讨康复中心住院患者医院感染发病情况及其危险因素。方法回顾性分析某院康复中心2018年1—12月住院患者的临床资料,分析医院感染发生情况、感染部位及病原体种类,采用单因素及多因素logistic回归分析患者医院感染的危险因素。结... 详细信息

目的探讨康复中心住院患者医院感染发病情况及其危险因素。方法回顾性分析某院康复中心2018年1—12月住院患者的临床资料,分析医院感染发生情况、感染部位及病原体种类,采用单因素及多因素logistic回归分析患者医院感染的危险因素。结果共收治住院患者4 118例,发生医院感染88例,95例次,医院感染发病率为2.14%,医院感染例次发病率为2.31%。脑出血患者医院感染发病率最高,为5.41%,例次发病率为6.21%。医院感染部位位于前3位的为泌尿道、下呼吸道、上呼吸道,分别占49.47%、27.37%、15.79%。95例次医院感染病例共分离出76株病原体,其中革兰阴性(G-)菌56株(占73.68%),革兰阳性(G+)菌15株(占19.74%)。多因素logistic回顾分析显示,男性、侵入性操作、意识障碍、低蛋白血症是康复科住院患者医院感染的独立危险因素(均P<0.05)。结论男性患者、意识障碍、侵入性操作及低蛋白血症是康复中心住院患者医院感染的危险因素,应采取针对性预防控制措施,减少医院感染的发生。

关键词：医院感染发病率康复科危险因素