检索结果-南通市图书馆

作者：田衍平第三军医大学

学位级别：硕士

登革病毒(dengue viruses, DV)是黄病毒属(Flavivirus)的单股正链RNA病毒。它只有一个开放阅读框(open reading frame,ORF),编码三种结构蛋白和七种非结构蛋白,从5’端到3’端依次为5’-C-prM(M)-E-NS1-NS2A-NS2B-NS3-NS4A-NS4B-NS5-3’。登革病毒广泛流行于热带和亚热带地区,主要通过埃及伊蚊和白纹伊蚊传播,引起人类登革热(classical dengue fever, DF)和登革出血热/登革休克综合征(dengue haemorrhagic fever /dengue shock syndrome, DHF/DSS)。近年来,在世界范围内和我国南方及东南亚,DHF/DSS的发病率有明显增加之趋势,可见登革病毒感染已是严重的公共卫生问题。当机体受到病毒感染等不利条件攻击时,活性氧(reactive oxygen species,ROS)就会产生过多,超过机体的清除能力,导致ROS在体内堆积并引起组织细胞氧化损伤。这一病理过程则称为氧化应激(Oxidative Stress, OS)。细胞内存在着许多抗氧化物质,谷胱甘肽(Glutathione,GSH)是其主要成员之一。它是细胞内一种含巯基的小分子抗氧化剂,是由谷氨酸、半胱氨酸、甘氨酸组成的天然小分子三肽,是体内重要的氧化还原缓冲系统。它与多种抗氧化酶以及抗氧化剂组成机体的抗氧化网络,维持机体的氧化-抗氧化平衡。病毒进入细胞后,利用宿主细胞的能量代谢系统进行自身大分子生物合成,这样宿主细胞正常代谢和生理功能被打乱,导致细胞自身的氧化-抗氧化平衡被打破。有文献报道流行性感冒病毒、人类免疫缺陷病毒感染能够增加细胞内氧化剂含量和抑制抗氧化剂合成,使细胞氧化水平升高,抗氧化能力下降,细胞内GSH下降,进而影响宿主细胞氧化还原状态。但登革病毒感染是否引起宿主细胞氧化还原状态的改变尚无见文献报告。因此,我们以对登革病毒易感染的肝癌细胞株HepG2细胞为研究对象,重点探讨了登革病毒及其3个结构蛋白C、prM和prM/E和重要的非结构蛋白(nonstructural protein 3,NS3)蛋白在与宿主细胞相互作用过程中细胞内GSH的变化,以此反映宿主细胞氧化还原状态的改变。本研究主要结果与结论如下: 1. DV NS3抗血清的制备利用RT-PCR以DV mRNA为模板扩增出DV NS3编码基因NS3。将NS3全长基因插入原核表达载体pQE31,转化大肠杆菌JM109,获得的pQE-NS3/ JM109工程菌经IPTG诱导后,超声裂解提取表达产物,融合蛋白NS3以包涵体的形式存在。包涵体裂解液经Ni-NTA亲和纯化后,获得大小相符的特异目标蛋白条带。经Western blot证实为所需目的蛋白。目的蛋白经纯化复性后免疫新西兰大耳白兔和Balb/c小鼠,获得了抗体效价较高的抗血清,经ELISA检测,兔抗血清效价达到了1:12800,小鼠抗血清的效价也达到1:6400。利用Western blot和间接免疫荧光证实,抗血清能特异性地识别病毒蛋白NS3。NS3抗血清的成功制备为进一步研究NS3在登革病毒感染病理机制中的作用提供良好的工具,也为部分登革病毒感染的诊断提供一种辅助手段。 2. pRE-NS3/HepG2稳定表达细胞株的构建通过PCR扩增出DV NS3编码基因。将NS3全长基因插入表达载体pReceiver,转化大肠杆菌JM109,获得pRE-NS3/ JM109工程菌。超纯提取质粒pRE-NS3 DNA后,利用脂质体法转染细胞HepG2,经G418筛选、克隆、间接免疫荧光和Western blot鉴定,获得了稳定表达NS3蛋白的HepG2细胞株,命名为:pRE-NS3/HepG2。同时,构建了含空载体pReceiver的HepG2细胞株作为对照。命名为:pReceiver/HepG2。 3. DV感染后HepG2细胞内GSH的测定 DV感染HepG2细胞(MOI=10)24h后, PBS充分洗涤细胞,胰蛋白酶消化,取出细胞。经过四次快速冻融,离心取上清用于GSH的测定。取相同数量的细胞经超声裂解用于测定细胞蛋白浓度。结果发现,病毒感染24h后,细胞内GSH的浓度较未感染细胞下降了32.8%,二者比较有显著性差异(P < 0.01)。说明DV感染能使HepG2细胞内GSH水平下降,改变宿主细胞的氧化还原状态。 4. DV NS3、C、prM和prM/E蛋白对宿主细胞内GSH的影响以上我们证明了DV感染能够使HepG2细胞内GSH水平下降,由此推测构成DV的3个结构蛋白和7个非结构蛋白可能参与了这一过程,为此我们选择了非结构蛋白中的NS3和3个结构蛋白,初步研究了它们对细胞氧化还原状态的影响。首先,将pRE-NS3/HepG2细胞和pReceiver/HepG2细胞接种6孔板,待细胞

关键词：登革病毒非结构蛋白3(NS3) 抗血清 HepG2细胞氧化还原状态

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重组双功能域补体受体Ⅰ型分子在Vero细胞中的稳定表达及其抑制补体活化的初步研究

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现代免疫学 2010年第1期30卷 35-40页

作者：杨永涛田衍平何莉汪正清第三军医大学微生物学教研室重庆400038 第三军医大学组织胚胎学教研室重庆400038

构建包含人重组双功能域人补体受体Ⅰ与绿色荧光蛋白(GFP)的重组质粒,观察融合蛋白在非洲绿猴肾细胞(Vero)内表达并检测其抑制补体活化的能力。PCR方法扩增出重组双功能域CR1分子,限制性内切酶XhoⅠ和SalⅠ将重组分子连入真核表达载体pE... 详细信息

构建包含人重组双功能域人补体受体Ⅰ与绿色荧光蛋白(GFP)的重组质粒,观察融合蛋白在非洲绿猴肾细胞(Vero)内表达并检测其抑制补体活化的能力。PCR方法扩增出重组双功能域CR1分子,限制性内切酶XhoⅠ和SalⅠ将重组分子连入真核表达载体pEGFP-N2中,构建出重组质粒pEGFP-N2/CR1-2D,脂质体转染Vero细胞中。新霉素G418筛选出稳定表达细胞克隆,荧光显微镜下观察绿色荧光融合蛋白在细胞内的表达。用Vero细胞和免疫小鼠获得的抗Vero细胞多克隆抗体激活补体后,通过检测乳酸脱氢酶的释放来分析重组蛋白抑制补体活化的功能。结果显示pEGFP-N2/CR1-2D质粒经酶切及测序分析证实载体构建正确。转染细胞后,荧光显微镜下观察到重组质粒pEGFP-N2/CR1-2D在Vero细胞中能够大量表达,G418筛选出了稳定表达细胞克隆,乳酸脱氢酶活性检测显示,与对照组相比CR1-2D能够显著的抑制补体的活化(P<0.05),初步证实了其能够抑制补体的活化。

关键词：补体受体1 克隆真核表达补体活化乳酸脱氢酶

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磷酸化Olig1和Olig2参与少突胶质细胞发育调控作用的研究进展

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生命科学 2013年第5期25卷 474-477页

作者：陈显军田衍平肖岚第三军医大学基础医学部组织学与胚胎学教研室重庆400038

少突胶质细胞(oligodendrocytes,OLs)是中枢神经系统(central nervous system,CNS)髓鞘形成细胞。转录因子Olig1和Olig2在OLs的发育、分化和髓鞘形成过程中具有重要作用,如Olig2主要参与少突胶质前体细胞(oligodendrocyte progenitor cells,OPCs)的早期定向分化;而Olig1主要在OLs的成熟分化和髓鞘形成的终末阶段发挥作用。最近研究发现,在OLs发育过程中,Olig1和Olig2可发生磷酸化修饰,而且其磷酸化状态的动态变化参与OLs早期命运决定、细胞增殖以及核浆转位等的调控。对Olig1和Olig2的磷酸化修饰的特点和功能作一综述。

关键词：少突胶质细胞发育磷酸化 Olig1 Olig2

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DISC1基因过表达对星形胶质细胞质膜伸展的影响

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第三军医大学学报 2013年第10期35卷 938-942页

作者：刘淑宝田衍平陈显军吴锡艳肖岚第三军医大学基础医学部组织学与胚胎学教研室重庆400038

目的构建精神分裂症断裂基因1(Disrupted-In-Schizophrenia 1,DISC1)蛋白表达质粒,检测其过表达后对星形胶质细胞(Astrocytes,ASTs)质膜伸展的影响。方法针对小鼠DISC1基因mRNA编码序列,设计合成可扩增全长引物;以小鼠脑白质cDNA为模板... 详细信息

目的构建精神分裂症断裂基因1(Disrupted-In-Schizophrenia 1,DISC1)蛋白表达质粒,检测其过表达后对星形胶质细胞(Astrocytes,ASTs)质膜伸展的影响。方法针对小鼠DISC1基因mRNA编码序列,设计合成可扩增全长引物;以小鼠脑白质cDNA为模板进行PCR扩增,构建全长表达质粒,命名为pEGFP-n1-DISC1。分别将过表达组pEGFP-n1-DISC1和空载体对照组pEGFP-n1电转染原代培养ASTs,以Western blot及免疫荧光染色检测DISC1-GFP融合蛋白的表达,利用Image-Pro Plus 5.0软件分析对照组与DISC1过表达组星形胶质细胞质膜伸展面积的大小。结果成功从cDNA中扩增出DISC1编码序列并插入pEGFP-n1载体,双酶切和测序结果证实,DISC1蛋白编码序列插入载体,并能正确读码翻译。构建质粒转染ASTs 60 h后,可见DISC1-GFP融合蛋白表达;与对照组相比,DISC1过表达组ASTs的质膜伸展面积明显增加(P<0.05)。结论成功构建小鼠DISC1全长基因表达载体,DISC1基因过表达后可促使ASTs质膜伸展面积增加。

关键词：精神分裂症断裂基因1 真核表达质粒星形胶质细胞质膜伸展

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两多一少肾石来扰

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家庭医药（快乐养生） 2010年第7期 34-35页

作者：田衍平第三军医大学

肾结石是尿路石症的一种。正常人尿液中的一些溶解物质，因各种原因沉淀，潴留于肾内，并持续生长，便可形成结石。各种原因中，尤以“两多一少”常见。

关键词：肾结石尿液保健知识食疗

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简易精神状态检查:老年痴呆早发现

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家庭医药（快乐养生） 2012年第2期 30-31页

作者：田衍平第三军医大学基础部

据统计，目前我国老年痴呆患者超过500万，而且年龄越大，老年痴呆的比例越高。在60-70岁的人群里，1O％会患上老年性痴呆，85岁以上则有50％的比例会患上痴呆。老年痴呆的发病十分隐匿，但也是有迹可循，如不会拨家里电话、叫不出熟人... 详细信息

据统计，目前我国老年痴呆患者超过500万，而且年龄越大，老年痴呆的比例越高。在60-70岁的人群里，1O％会患上老年性痴呆，85岁以上则有50％的比例会患上痴呆。老年痴呆的发病十分隐匿，但也是有迹可循，如不会拨家里电话、叫不出熟人名字、怀疑保姆偷钱、猜忌老伴外遇……这些症状都可能提示患上“老年痴呆”。然而，生活中对此了解的人并不多，这就使得相当一部分老年痴呆患者没有被及时发现，从而耽误治疗。

关键词：老年痴呆患者简易精神状态检查老年性痴呆

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