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蛋白质测序技术进展

科学通报 2021年第25期66卷 3309-3317页

作者：陈厚凯郝瑞田瑞军南方科技大学化学系深圳518055

蛋白质测序,即蛋白质一级结构的测定,是生命科学和医学领域重要的课题.蛋白质测序技术的发展,有助于更深刻地把握生命活动的规律以及实现疾病的早期诊断和精准治疗.以Edman降解法和质谱分析为代表的主流方法,可以有效地确定蛋白质的序列... 详细信息

蛋白质测序,即蛋白质一级结构的测定,是生命科学和医学领域重要的课题.蛋白质测序技术的发展,有助于更深刻地把握生命活动的规律以及实现疾病的早期诊断和精准治疗.以Edman降解法和质谱分析为代表的主流方法,可以有效地确定蛋白质的序列,应用广泛.然而,用这些传统方法测定极低浓度的蛋白质序列尚具挑战.另一方面,以平行荧光测序和纳米孔测序为代表的新方法,显示了单分子级别的测序灵敏度,有很大的发展前景.本文介绍了蛋白质测序的主要思路,着重阐述了高灵敏的测序新方法,并对该领域作出展望.

关键词：蛋白质测序纳米孔测序平行测序单分子质谱分析

基于毛细管电泳技术的高灵敏度蛋白质组学技术发展

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色谱 2020年第10期38卷 1125-1132页

作者：杨云田瑞军南方科技大学化学系广东深圳518055 香港科技大学化学及生物工程学系香港999077

近年来,蛋白质组学技术在样品前处理、分离技术和质谱检测技术方面获得了快速发展,已经可以实现在几小时内对上万种蛋白的同时定性和定量分析。然而,目前的主流蛋白质组学技术仍无法满足极微量生物样品,尤其是单细胞样品的组学分析需求... 详细信息

近年来,蛋白质组学技术在样品前处理、分离技术和质谱检测技术方面获得了快速发展,已经可以实现在几小时内对上万种蛋白的同时定性和定量分析。然而,目前的主流蛋白质组学技术仍无法满足极微量生物样品,尤其是单细胞样品的组学分析需求。毛细管电泳分离技术具有峰宽窄、柱效高、样品用量少等优势,是与高分辨质谱在线联用的理想选择之一。该文评述了集成化和在线样品前处理以及主流的纳升液相色谱-质谱联用系统在高灵敏度蛋白质组学分析领域的发展现状和挑战,认为该领域的重要技术挑战之一在于目前的纳升液相色谱分离已经无法完全匹配现代高分辨质谱超过40 Hz的超高扫描速度,从而导致质谱使用效率的降低。针对上述技术挑战,该文重点探讨了毛细管电泳-质谱联用技术的独特技术优势和潜在发展机遇,主要包括:(1)面向微量酶解多肽样品的高柱效毛细管电泳分离。通过采用毛细管电色谱可以进一步改善毛细管电泳柱容量不足的局限;(2)面向高灵敏度分析的无鞘液/鞘液接口开发;(3)高效毛细管电泳分离与高扫描速度质谱检测的协同化使用。总之,我们预期毛细管电泳-质谱联用技术的进一步发展有望在针对单细胞等超微量生物学样品的蛋白质组学分析中获得更广泛的应用。

关键词：毛细管电泳-质谱联用蛋白质组学鞘液接口集成化样品前处理

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高通量蛋白质组学分析研究进展

色谱 2021年第2期39卷 112-117页

作者：吴琼隋欣桐田瑞军南方科技大学理学院化学系广东深圳518055

基于质谱的蛋白质组学技术已经日趋成熟,可以对细胞和组织中的成千上万种蛋白质进行全面的定性和定量分析,逐步实现“深度覆盖”。随着生物医学日益增长的大队列蛋白质组学分析需求,如何在保持较为理想的覆盖深度下实现短时间、快速的... 详细信息

基于质谱的蛋白质组学技术已经日趋成熟,可以对细胞和组织中的成千上万种蛋白质进行全面的定性和定量分析,逐步实现“深度覆盖”。随着生物医学日益增长的大队列蛋白质组学分析需求,如何在保持较为理想的覆盖深度下实现短时间、快速的“高通量”蛋白质组学分析已成为当前亟需解决的关键问题之一。常规的蛋白质组学分析流程通常包括样品前处理、色谱分离、质谱检测和数据分析。该文从以上4个方面展开介绍近10年以来高通量蛋白质组学分析技术取得的一系列研究进展,主要包括:(1)基于高通量、自动化移液工作站的蛋白质组样品前处理方法;(2)基于微升流速液相色谱与质谱联用的高通量蛋白质组检测方法;(3)利用灵敏度高、扫描速度快的质谱仪实现短色谱梯度分离下蛋白质组深度覆盖的分析方法;(4)基于人工智能、深度神经网络、机器学习等的蛋白质组学大数据分析方法。此外,对高通量蛋白质组学面临的挑战及其发展进行展望。总而言之,预期在不久的将来高通量蛋白质组学技术将会逐步“落地转化”,成为大队列蛋白质组学分析的利器。

关键词：高通量蛋白质组学质谱色谱样品前处理

应用于原代T细胞酪氨酸磷酸化蛋白质组的高灵敏度分析方法

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色谱 2024年第7期42卷 693-701页

作者：梁富超柯弥田瑞军南方科技大学理学院化学系广东深圳518055

酪氨酸磷酸化在T细胞的信号转导过程中发挥着重要的作用,然而其丰度较低,鉴定困难。生物组织样本中分离获得的原代T细胞数量较少,培养和扩增的难度较大,因而常使用永生化细胞系来研究T细胞的酪氨酸磷酸化介导的信号转导过程,这通常会导... 详细信息

酪氨酸磷酸化在T细胞的信号转导过程中发挥着重要的作用,然而其丰度较低,鉴定困难。生物组织样本中分离获得的原代T细胞数量较少,培养和扩增的难度较大,因而常使用永生化细胞系来研究T细胞的酪氨酸磷酸化介导的信号转导过程,这通常会导致获得与原代T细胞相差较大的结论。因此,本研究发展了一种解析原代T细胞酪氨酸磷酸化修饰信号的高灵敏度的蛋白质组学方法。首先,针对原代T细胞数量有限的问题,本研究优化了一套从小鼠脾脏中分离、活化和扩增T细胞的完整流程,第4天时T细胞数量扩增到7倍以上;其次,针对酪氨酸磷酸化修饰丰度较低、不易被质谱检测的难题,本研究利用SH2超亲体(SH2-superbinder)亲和富集和固定化钛离子亲和色谱(Ti^(4+)-IMAC)技术对抗CD3和抗CD28单克隆抗体共刺激条件下的原代T细胞多肽样品进行了酪氨酸磷酸化多肽富集,并结合纳升液相色谱-串联质谱(nanoLC-MS/MS)进行解析。最终成功从1 mg蛋白质中鉴定到282个酪氨酸磷酸化位点,其中包含T细胞受体膜蛋白CD3胞内区的免疫受体酪氨酸激活序列(ITAM)上的多个酪氨酸磷酸化位点,以及信号转导相关蛋白ZAP70、LAT、VAV1等的重要位点信息。综上,本研究发展了一套深度解析原代T细胞中的酪氨酸磷酸化修饰的高灵敏度蛋白质组学分析流程,有望应用于绘制更接近生理状态下的信号转导网络。

关键词：纳升液相色谱-串联质谱酪氨酸磷酸化原代T细胞共刺激信号转导

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基于可断裂双功能探针的糖蛋白分析

化学学报 2023年第12期81卷 1673-1680页

作者：李畅郑振东郑江南田瑞军南方科技大学理学院化学系深圳518055

糖蛋白在细胞活动和疾病发生发展过程中发挥着重要作用.然而,在复杂的生物样本中,糖蛋白的丰度往往较低,因而在质谱分析前必须对其进行富集以实现高灵敏质谱分析.目前,已经发展出诸多糖蛋白富集方法,其中肼化学法与肟点击化学法因对糖... 详细信息

糖蛋白在细胞活动和疾病发生发展过程中发挥着重要作用.然而,在复杂的生物样本中,糖蛋白的丰度往往较低,因而在质谱分析前必须对其进行富集以实现高灵敏质谱分析.目前,已经发展出诸多糖蛋白富集方法,其中肼化学法与肟点击化学法因对糖蛋白标记的普适性与无偏性受到了越来越多的关注.然而,由于这些方法以共价连接或者超高亲和力生物素结合的方式在固相载体上捕获糖蛋白,因此无法选择性地洗脱被富集的糖蛋白.传统的方法是在固相载体上直接进行酶解,因此无法排除非特异性吸附蛋白、内源性生物素化蛋白、固相载体上的链霉亲和素等无关蛋白对糖蛋白质谱分析产生的背景干扰.本工作设计并合成了三种可断裂的双功能探针[生物素-偶氮苯-氧胺(BAA)、生物素-N-1-(4,4-二甲基-2,6-二氧环亚己基)乙基-氧胺(BDA)、生物素-邻硝基苄基-氧胺(BNA)],通过温和的方式从固相载体上释放糖蛋白,从而排除非糖蛋白的干扰,提高糖蛋白富集的选择性.对三种探针的标记与富集效果、切割效率、蛋白回收率等性能进行了评估.结果显示,探针BDA与BNA的性能较为优越.最后,探针BNA被应用于细胞表面糖蛋白的分离富集与质谱鉴定中.与传统的在固相载体上直接进行酶解的方法相比,该方法中非糖蛋白数目从3564降到了2139,降幅达到了40.0%,糖蛋白的无标定量(LFQ)分析强度提升了104.2%.此外,切割方法极大降低了内源性生物素化蛋白的干扰.上述结果表明,可断裂双功能探针显著地提高了糖蛋白质谱鉴定的灵敏度与选择性,为生物与医学等领域中糖蛋白的深度解析提供了新的工具.

关键词：糖蛋白质谱富集肟点击化学可断裂探针

基于可断裂三功能探针的酪氨酸磷酸化蛋白质复合物的规模化分析

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分析化学 2023年第4期51卷 492-501页

作者：秦韵秋郑振东田瑞军哈尔滨工业大学化学化工学院南方科技大学化学系

在细胞的信号转导过程中，磷酸化酪氨酸（Phosphotyrosine, pTyr）信号在许多通路中起着重要的调控作用。受pTyr信号调控的蛋白质复合物是信号传递早期过程中的关键分子机器，分析该类动态蛋白质复合物具有重要的意义。Photo-pTyr-scaff... 详细信息

在细胞的信号转导过程中，磷酸化酪氨酸（Phosphotyrosine, pTyr）信号在许多通路中起着重要的调控作用。受pTyr信号调控的蛋白质复合物是信号传递早期过程中的关键分子机器，分析该类动态蛋白质复合物具有重要的意义。Photo-pTyr-scaffold是一种结合了化学探针与pTyr识别蛋白质结构域的化学蛋白质组学分析策略，采用该策略已经实现了对表皮生长因子受体（Epidermal growth factor receptor, EGFR）通路相关的pTyr信号蛋白质复合物的规模化分析。但是，该方法无法解析所鉴定复合物的一一对应关系，增加了后续复合物解析的复杂性。本研究在Photo-pTyr-scaffold探针设计的基础上，将可断裂基团引入至其生物素富集端，设计合成了新型的可断裂三功能探针，以实现对富集产物的可控洗脱。基于pTyr信号蛋白质复合物在化学交联后的分子量差异，利用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳实现了对洗脱的pTyr蛋白质复合物的分离，进一步将不同分子量区域的蛋白质进行胶内酶解和质谱分析。理论上，发生化学交联的pTyr蛋白质复合物将在高于原蛋白质分子量的区域被鉴定到。利用此策略，本研究系统研究了EGFR信号通路的pTyr信号蛋白质复合物，得到了20种重要蛋白质的分子量迁移图谱，从图谱中筛选出具有明显迁移现象的2种信号蛋白质（泛素连接酶CBL和脚手架蛋白SHC1），进一步采用蛋白免疫印迹法验证了其迁移现象，证明了本方法用于解析pTyr信号蛋白质复合物的可行性。

关键词：酪氨酸磷酸化蛋白质复合物表皮生长因子受体信号通路蛋白质组学分析

基于3种非天然糖代谢标记的分泌蛋白质组分析性能对比

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色谱 2021年第10期39卷 1086-1093页

作者：毛源郑江南封顺田瑞军西南交通大学生命科学与工程学院四川成都610031 南方科技大学理学院化学系广东深圳518055

分泌蛋白质是调控细胞间信号转导的重要生物大分子。由于分泌蛋白的丰度相比于胞内蛋白以及培养基添加剂更低,因此分泌蛋白的高通量鉴定是目前蛋白质组学界研究的热点和难点。目前,基于生物质谱的分泌蛋白质组学分析一般均需要从无血清... 详细信息

分泌蛋白质是调控细胞间信号转导的重要生物大分子。由于分泌蛋白的丰度相比于胞内蛋白以及培养基添加剂更低,因此分泌蛋白的高通量鉴定是目前蛋白质组学界研究的热点和难点。目前,基于生物质谱的分泌蛋白质组学分析一般均需要从无血清的条件培养基中获得分泌蛋白质,再对其进行富集和分析。该流程操作步骤繁琐,易造成分泌蛋白质的损失和降解。本工作采用基于生物正交化学生物学技术实现对分泌蛋白质的高选择性标记和高效富集。通过结合点击化学技术,综合评估了分泌蛋白质分析中用于代谢标记的不同糖类似物。采用3种最常用的商品化糖类似物,N-叠氮乙酰甘露糖胺(ManNAz)、N-叠氮乙酰半乳糖胺(GalNAz)和N-叠氮乙酰葡萄糖胺(GlcNAz)分别对HeLa细胞进行代谢标记,之后通过炔基生物素探针对条件培养基中的分泌蛋白进行富集,结合质谱分析来对比3种糖类似物对分泌蛋白的标记效率。最后通过无标定量蛋白质组学分析,系统评估了3种糖类似物用于分泌蛋白质组分析的性能。结果表明,基于ManNAz的分泌蛋白标记方法鉴定到了282个分泌蛋白、224个细胞质膜蛋白以及846个N-糖基化位点;对分泌蛋白的富集效率分别较GalNAz和GlcNAz提高了130%和67.2%;对细胞质膜蛋白的富集效率较GalNAz和GlcNAz分别提高了273.3%和148.7%,体现出了明显的优势。本研究的实验结果为分泌蛋白高选择性富集和系统分析提供了有益的对比分析和新技术策略。

关键词：液相色谱串联质谱分泌蛋白点击化学代谢标记糖类似物

色谱与质谱联用技术在蛋白质翻译后修饰研究中的进展及应用

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分析化学 2015年第10期43卷 1479-1489页

作者：林琳罗树生王灵珏杨杰沈海南田瑞军南方科技大学化学系南方科技大学分析测试中心南方科技大学深圳市细胞微环境重点实验室

蛋白质翻译后修饰是调控各种细胞信号通路和细胞命运最为关键的分子机制之一。在分子水平上,蛋白质翻译后修饰的"写入"、"擦除"和"识别"是实现其动态调控功能的核心过程,均属于生物分析化学的研究范畴。基于液相色谱与生物质谱联用的蛋... 详细信息

蛋白质翻译后修饰是调控各种细胞信号通路和细胞命运最为关键的分子机制之一。在分子水平上,蛋白质翻译后修饰的"写入"、"擦除"和"识别"是实现其动态调控功能的核心过程,均属于生物分析化学的研究范畴。基于液相色谱与生物质谱联用的蛋白质组学技术经历了近十年的高速发展,已成为系统水平上表征各种蛋白质翻译后修饰的标准方法。本文综述了蛋白质翻译后修饰分析相关的关键技术和方法进展,主要包括:各种翻译后修饰蛋白质和多肽的富集方法、基于高效液相色谱的多维分离方法和各种生物质谱鉴定方法,并重点阐述了近年来的新的发展方向。基于相关技术的快速发展和大规模鉴定数据的产生,本文重点介绍了5种具有重要生物学功能的蛋白质翻译后修饰,包括:磷酸化、糖基化、泛素化、乙酰化和甲基化。生物分析化学领域的方法和技术创新必将进一步促进对蛋白质翻译后修饰的系统水平研究的发展。

关键词：蛋白质翻译后修饰蛋白质组学质谱综述

基于锚杆无损检测技术的巷道锚固质量评价方法应用研究

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煤炭工程 2017年第F8期49卷 185-188页

作者：田瑞军齐新林神华大雁集团雁南煤矿内蒙古呼伦贝尔021122

应用煤矿锚杆无损检测技术,对雁南煤矿井下巷道的锚杆的长度和轴力进行了检测,基于测试结果和煤矿相关规范,提出了锚杆锚固质量评价方法,并用此方法对巷道锚固质量进行评价和分析。研究结果表明:该评价方法提高了检测巷道锚杆锚固质量... 详细信息

应用煤矿锚杆无损检测技术,对雁南煤矿井下巷道的锚杆的长度和轴力进行了检测,基于测试结果和煤矿相关规范,提出了锚杆锚固质量评价方法,并用此方法对巷道锚固质量进行评价和分析。研究结果表明:该评价方法提高了检测巷道锚杆锚固质量的效率,可为锚杆支护质量检测和评估提供经验和参考。

关键词：锚杆支护无损检测锚固质量评价方法