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作者：田敬欢北京中医药大学

学位级别：硕士

T7表达系统由T7RNA聚合酶和T7启动子间特异性识别而建立的基因表达系统。到目前为止,T7表达系统是表达目的蛋白最强大的表达系统之一。蓝藻因其具有生长条件、遗传结构和细胞结构简单等,作为大肠杆菌和酵母之后新一代的微生物表达宿主,... 详细信息

T7表达系统由T7RNA聚合酶和T7启动子间特异性识别而建立的基因表达系统。到目前为止,T7表达系统是表达目的蛋白最强大的表达系统之一。蓝藻因其具有生长条件、遗传结构和细胞结构简单等,作为大肠杆菌和酵母之后新一代的微生物表达宿主,但是,外源基因在蓝藻中的表达效率较低,影响着蓝藻基因工程的发展。目的:获得含T7RNA聚合酶基因的定点整合载体,将其转化到鱼腥藻7120基因组中,通过筛选、鉴定获得含T7RNA聚合酶基因的鱼腥藻。方法:鱼腥藻7120对5种抗生素的敏感性比较,筛选出作为转基因藻的抗性基因;利用PCR方法分别获得带组氨酸标签的T7RNA聚合酶基因、抗性基因Cm以及同源片段F2基因,利用重叠延伸PCR方法将三片段拼接起来,将其连接到克隆载体pEASY-BluntZero上;利用酶切连接方法将该基因连接到本课题组构建好的载体pEASY-T1-F1-Tac-NptII-F2上;通过电击转化法将线性化的定点整合载体转到野生型鱼腥藻7120中;利用Cm进行抗性筛选,PCR测序验证,并用Western-Blot方法检测T7RNA聚合酶基因的表达。结果:1.野生型鱼腥藻7120对5种抗生素敏感性的比较将野生型鱼腥藻涂布到含不同浓度的抗生素的BG11（+N）固体培养基中,光照培养。其中 Amp 的浓度为 0,5,7,10,12,15μg/mL,Kan 的浓度为 0,10,15,20,25,30μg/mL,Str 的浓度为 0,0.002,0.005,0.008,0.01,0.02μg/mL,Nm 的浓度为0,0.1,0.5,0.7,1,3μg/ml,Cm 的浓度为 0,0.01,0.05,0.1,0.5,1 μg/mL。结果发现,随着每一种抗生素的浓度的增长,野生型鱼腥藻7120的生长藻落数呈剂量依赖性减少,当Amp的浓度为5 μg/mL时,可抑制藻的生长,浓度为15 μg/mL时,平板上没有藻落长出,而空白对照组平板藻落清晰可见;同样的,当Kan的浓度为20 μg/mL时,可抑制鱼腥藻的生长,浓度为30 μg/mL时,对鱼腥藻有致死作用;当Str的浓度为0.08 μg/mL时,可抑制鱼腥藻7120的生长,浓度为0.02 μg/mL时,对鱼腥藻7120有致死作用;当Nm的浓度为0.5 μg/mL时,可抑制鱼腥藻7120的生长,浓度为3μg/mL时,对鱼腥藻7120有致死作用;当Cm浓度分别为0.01μg/mL时,可抑制鱼腥藻7120的生长,浓度为1 μg/mL时,对鱼腥藻7120有致死作用。2.野生型鱼腥藻7120液体培养时对Cm和Nm敏感性比较在液体培养基中比较鱼腥藻对Cm和Nm敏感程度,其中Nm的浓度为0,1,2,3,4,5μg/ml,Cm的浓度为 0,1,3,5,7,9μg/ml。结果发现,当 Nm 浓度为 2μg/mL时,可抑制鱼腥藻的生长,藻色发黄,3 μg/ml时,无藻丝体,细胞大量死亡,浓度为4μg/mL时,藻全部死亡;当Cm浓度为5μg/mL时,抑制鱼腥藻7120的生长,藻色发黄,浓度为9 μg/ml时,藻全部死亡。3.定点整合载体的构建首先通过PCR扩增获得带组氨酸标签的T7RNA聚合酶基因、抗性基因Cm以及同源片段F2基因,测序分析每段序列正确后,利用重叠延伸PCR的方法将3段基因拼接起来,获得T7RNAP-Cm-F2基因片段。将获得的片段克隆到载体pEASY-BluntZero上,然后提取质粒,将质粒送去测序,将序列正确的质粒与本课题组保存的载体pEASY-T1-F1-Tac-NptII-F2,通过BamHI和ApaI内切酶双酶切,胶回收 T7RNAP-Cm-F2基因和pEASY-T1-F1-Tac基因。通过T4连接酶将两片段连接起来,然后利用试剂盒提取质粒。经过酶切、测序验证载体构建成功。4.T7RNA聚合酶基因在鱼腥藻7120中的转化和筛选首先用HindⅢ内切酶将定点整合载体单酶切,回收线性载体,将线性载体通过电击转化转到对数生长早期的野生型鱼腥藻7120中,将转化载体的藻在不含抗生素的液体BG-11+N培养基中,暗光培养24h,然后将其转移到含3、5、10、15、20μg/mLCm的固体培养基上,光照培养。每隔3天将藻转移到含高浓度Cm的BG-11+N固体培养基上,培养2周后,将筛选到的单藻落挑到含15 μg/mLCm的BG-11+N液体培养基中,培养2周后,将长出藻液扩大培养,待藻长到对数生长期后,提取基因组DNA,进行PCR扩增,将扩增产物测序鉴定转基因藻。其中比较了电击时的电压,结果发现1600v电压效果比1200v电压好,因此,后续电击转化的电压为1600v;蓝藻基因组DNA提取的两种方法:CTAB法和超声破碎法,结果发现CTAB法获得的DNA纯度较高,此方法用于后续实验;通过对PCR扩增产物测序进行比对,结果显示含有目的基因;Western-Blot结果显示非特异性条带较多。结论:成功构建含组

关键词：鱼腥藻7120 T7RNA聚合酶/T7启动子表达系统电击转化定点整合载体转基因

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T7 RNA聚合酶基因表达系统在鱼腥藻7120中构建及hG-CSF的表达

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生物工程学报 2020年第11期36卷 2467-2477页

作者：谢雪晴田钰琪田敬欢宁文艳王春梅北京中医药大学生命科学学院北京102488

外源基因的表达效率低是蓝藻基因工程发展的瓶颈之一,T7 RNA聚合酶表达系统实现了大肠杆菌中外源基因的高效表达,蓝藻与大肠杆菌同为革兰氏阴性菌,具有较高的遗传同源性,在蓝藻中构建T7 RNA聚合酶表达系统有可能提高外源基因在蓝藻中的... 详细信息

外源基因的表达效率低是蓝藻基因工程发展的瓶颈之一,T7 RNA聚合酶表达系统实现了大肠杆菌中外源基因的高效表达,蓝藻与大肠杆菌同为革兰氏阴性菌,具有较高的遗传同源性,在蓝藻中构建T7 RNA聚合酶表达系统有可能提高外源基因在蓝藻中的表达效率。为了在鱼腥藻7120中构建T7 RNA聚合酶表达系统,采用重叠延伸PCR技术和酶切连接等方法构建能够表达T7 RNA聚合酶的定点整合载体pEASY-T1-F1-TacT7RNAPCmR-F2以及由T7启动子驱动hG-CSF基因表达的穿梭表达载体pRL-T7-hG-CSF;采用电击转化法将定点整合载体导入野生型鱼腥藻中,通过三亲接合的方法将穿梭表达载体转入已定点整合T7 RNA聚合酶的转基因鱼腥藻中。利用PCR技术鉴定外源基因在蓝藻中的存在;RT-PCR方法检测外源基因在蓝藻中的转录情况;Western blotting实验检测外源基因在蓝藻中的蛋白表达情况。结果表明两种载体构建成功,T7 RNA聚合酶基因和hG-CSF基因被转入鱼腥藻中,两个基因均在藻中表达,T7 RNA聚合酶表达系统在鱼腥藻中构建成功,与传统蓝藻表达系统相比,文中在鱼腥藻中构建的T7表达系统使hG-CSF基因的表达量提高2倍。该表达系统将为蓝藻基因工程的应用提供更优的工具,将促进蓝藻作为底盘细胞在合成生物学等领域的发展。

关键词： T7 RNA聚合酶 T7启动子鱼腥藻Anabaena sp.PCC 7120 人粒细胞集落刺激因子电击转化三亲结合

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斑马鱼在中药研究中的应用进展

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中草药 2015年第17期46卷 2635-2648页

作者：赵崇军田敬欢王金凤马志强曹丹夏青李丹张文婷姜岩林瑞超北京中医药大学中药学院北京100102

斑马鱼作为一种模式动物,已经被广泛应用于遗传学和发育生物学研究。近些年,斑马鱼的研究已经拓展和延伸到中药领域。作为一种整体动物模型,斑马鱼能够全面地检测、评估中药的活性和毒性,进而实现高通量筛选。概括介绍了斑马鱼模型的特... 详细信息

斑马鱼作为一种模式动物,已经被广泛应用于遗传学和发育生物学研究。近些年,斑马鱼的研究已经拓展和延伸到中药领域。作为一种整体动物模型,斑马鱼能够全面地检测、评估中药的活性和毒性,进而实现高通量筛选。概括介绍了斑马鱼模型的特点及其在中药毒性、活性物质筛选和中药代谢方面的研究进展。

关键词：斑马鱼中药活性物质筛选毒性代谢

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家蚕茧壳水解物对小鼠免疫功能的影响

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蚕业科学 2015年第1期41卷 145-150页

作者：刘建亭王玉霞周晓潮田敬欢林峰武鹏凯王春梅北京中医药大学中药学院北京100102

以小鼠为实验动物研究家蚕茧壳水解物的免疫调节功能。分别给正常雄性BALB/c小鼠灌胃低剂量(575 mg/kg)、中剂量(1 150 mg/kg)和高剂量(2 300 mg/kg)家蚕茧壳水解物,30 d后测定小鼠胸腺、脾脏质量计算脏器/体质量比值,并通过脾淋巴细胞... 详细信息

以小鼠为实验动物研究家蚕茧壳水解物的免疫调节功能。分别给正常雄性BALB/c小鼠灌胃低剂量(575 mg/kg)、中剂量(1 150 mg/kg)和高剂量(2 300 mg/kg)家蚕茧壳水解物,30 d后测定小鼠胸腺、脾脏质量计算脏器/体质量比值,并通过脾淋巴细胞增殖试验、腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞试验、乳酸脱氢酶法和血清溶血素法等,分别检测细胞免疫功能、巨噬细胞吞噬能力、NK细胞活性和体液免疫功能。与对照组相比,中剂量家蚕茧壳水解物灌胃组小鼠的脾指数显著增加(P<0.05),低剂量组和高剂量组小鼠胸腺指数显著增加(P<0.05);中、高剂量家蚕茧壳水解物灌胃组小鼠的脾淋巴细胞增殖能力、NK细胞杀伤活性、腹腔巨噬细胞对鸡红细胞的吞噬指数等显著(P<0.05)或极显著提高(P<0.01)。此外,家蚕茧壳水解物对小鼠体质量和血清溶血素含量没有显著影响。研究结果表明,家蚕茧壳水解物能促进正常小鼠的免疫器官质量增加,对小鼠的细胞免疫和非特异性免疫功能也有明显的促进作用。

关键词：家蚕茧壳水解物免疫调节脾淋巴细胞增殖单核-巨噬细胞功能 NK细胞活性小鼠

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上、中、下部位鹿茸对PC12细胞促增殖和诱导分化的影响

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中华中医药学刊 2014年第12期32卷 2829-2831,I0018,I0019页

作者：田敬欢王春梅高雅董玲北京中医药大学中药学院生物制药系北京100102

目的:探讨鲜品鹿茸上、中、下部位对PC12细胞的促增殖和诱导分化作用。方法:采用BCA试剂盒法测定样品的蛋白浓度;以大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤株PC12细胞为研究模型,以MTT法检测鲜鹿茸上、中、下不同部位,不同浓度(5、10、50、100、200、300... 详细信息

目的:探讨鲜品鹿茸上、中、下部位对PC12细胞的促增殖和诱导分化作用。方法:采用BCA试剂盒法测定样品的蛋白浓度;以大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤株PC12细胞为研究模型,以MTT法检测鲜鹿茸上、中、下不同部位,不同浓度(5、10、50、100、200、300、500、800 mg·m L-1)的水提液对PC12细胞增殖活性的影响;显微观察计数法评价上、中、下不同部位,不同浓度的鲜鹿茸对细胞的促分化能力,统计分析细胞分化率。结果:鹿茸上、中、下部位可溶性蛋白含量分别为13.18、12.16和9.08 mg·m L-1;所有样品对细胞增殖均有促进作用,且呈现浓度效应。鹿茸上部促增殖能力最强,中部其次,下部最低。上部高浓度样品的促增殖率可达到60%,中部与上部样品的作用效果在高浓度(大于等于300 mg·m L-1)时差异不显著。鹿茸诱导细胞分化的能力,上部最强,中部和下部依次降低。随样品浓度增加,细胞分化率增加,当浓度为800 mg·m L-1时,上、中、下部位对细胞的分化率分别为91.38%、80.29%、76.52%。中部与下部样品对细胞分化程度的影响相差不大。

关键词：鹿茸不同部位 PC12细胞细胞增殖诱导分化

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马钱子对斑马鱼胚胎发育的影响

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中华中医药学刊 2016年第11期34卷 2773-2775,I0011页

作者：赵崇军田敬欢倪媛媛冯娅茹代一航王金凤樊娇娇杨冉马志强林瑞超北京中医药大学中药学院中药品质评价北京市重点实验室北京100102 中国科学院理化技术研究所北京100190

目的:探讨马钱子水提液对斑马鱼胚胎发育的影响,建立马钱子对斑马鱼胚胎的浓度-效应曲线,确认其LC50。方法:参照OECD推荐的方法,将受精后6 h(6 hpf)胚胎暴露在含有不同浓度马钱子的养殖水中,分别在24 hpf、48 hpf和72 hpf(96 hpf)阶段... 详细信息

目的:探讨马钱子水提液对斑马鱼胚胎发育的影响,建立马钱子对斑马鱼胚胎的浓度-效应曲线,确认其LC50。方法:参照OECD推荐的方法,将受精后6 h(6 hpf)胚胎暴露在含有不同浓度马钱子的养殖水中,分别在24 hpf、48 hpf和72 hpf(96 hpf)阶段测定自主抽动次数,心率、孵化率、死亡率、畸变率等指标。结果:各暴露组24 hpf自主抽动次数、48 hpf心率以及孵化率与正常对照组都具有显著性统计学差异;48 hpf后出现脊柱弯曲、心包水肿、卵黄囊水肿,游泳异常的毒性症状;各给药组的畸形率都可达到100%;在72 hpf之后,随着浓度的升高胚胎的死亡率升高。结论:马钱子对斑马鱼胚胎发育有毒性作用。

关键词：斑马鱼马钱子发育毒性

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热炸工艺对不同部位梅花鹿鹿茸细胞增殖活性的影响

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中华中医药学刊 2014年第9期32卷 2135-2137页

作者：丁倩男王春梅吴帆田敬欢赓迪戴俊东董玲北京中医药大学中药学院北京100102

目的:考察传统热炸工艺对梅花鹿鹿茸不同部位细胞增殖活性的影响;方法:利用传统热炸法炮制东北梅花鹿鹿茸,用Bradford法测定鹿茸可溶性蛋白含量;利用MTT法测定鲜鹿茸与热炸炮制鹿茸上、中、下部位对NRK-49F细胞增殖活性的影响。结果:鲜... 详细信息

目的:考察传统热炸工艺对梅花鹿鹿茸不同部位细胞增殖活性的影响;方法:利用传统热炸法炮制东北梅花鹿鹿茸,用Bradford法测定鹿茸可溶性蛋白含量;利用MTT法测定鲜鹿茸与热炸炮制鹿茸上、中、下部位对NRK-49F细胞增殖活性的影响。结果:鲜鹿茸上中下部均具有促进细胞增殖的能力,从上到下活性减弱;热炸炮制品促细胞增殖活性降低。结论:梅花鹿鹿茸具有较强的促细胞增殖能力,传统热炸炮制明显降低鹿茸的促细胞增殖的能力。

关键词：梅花鹿鹿茸热炸不同部位 NRK-49F 细胞增殖

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香加皮对斑马鱼发育毒性及心脏毒性的影响

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环球中医药 2017年第5期10卷 536-540页

作者：冯娅茹赵崇军倪媛媛田敬欢夏青张文婷樊娇娇马志强林瑞超北京中医药大学中药学院中药品质评价北京市重点实验室100102

目的探讨香加皮水提液对斑马鱼的发育毒性及不同暴露时间药物对心脏毒性的影响。方法参照经济合作与发展组织推荐的方法,将受精后6小时(6 hour-post-fertilization,6 hpf)胚胎暴露在含有不同浓度香加皮水溶液的24孔板中,分别在24、48、7... 详细信息

目的探讨香加皮水提液对斑马鱼的发育毒性及不同暴露时间药物对心脏毒性的影响。方法参照经济合作与发展组织推荐的方法,将受精后6小时(6 hour-post-fertilization,6 hpf)胚胎暴露在含有不同浓度香加皮水溶液的24孔板中,分别在24、48、72、96 hpf阶段测定胚胎/幼鱼的自主抽动次数、心率、孵化率、死亡率等指标。随后,使用不同浓度的香加皮水溶液处理发育至48、72、96 hpf的斑马鱼24小时,通过死亡率确定不同暴露阶段对斑马鱼心脏毒性的影响。结果各暴露组24 hpf自主抽动次数增加、48 hpf心率以及72 hpf孵化率显著降低,与正常对照组相比均有显著性差异(P<0.05);24 hpf低浓度给药组胚胎发育迟缓、眼点未发育、头部偏小或未发育,高浓度组发育畸形或停留在体节期;48 hpf胚胎卵黄囊畸形、黑色素生成抑制、尾芽未脱落;72 hpf幼鱼出现身体弯曲、心包水肿、卵黄囊畸形等中毒症状。不同发育阶段斑马鱼急性毒性暴露实验结果表明:香加皮对48、72、96 hpf斑马鱼的半数致死浓度(LC_(50))分别为:0.866 mg/m L、0.693 mg/m L和0.843mg/m L。结论香加皮对斑马鱼具有明显的发育毒性和心脏毒性,且48 hpf斑马鱼非常适合进行心脏毒性药物筛选。

关键词：香加皮发育毒性心脏毒性斑马鱼

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基于斑马鱼模型探讨马钱子的抗血管生成活性

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世界科学技术-中医药现代化 2016年第9期18卷 1534-1538页

作者：倪媛媛赵崇军冯娅茹田敬欢张文婷夏青樊娇娇马志强林瑞超北京中医药大学中药学院中药品质评价北京市重点实验室北京100102

目的:以斑马鱼为模型,探讨马钱子的抗血管生成活性。方法:以Tg(kdrl:mCherry)斑马鱼和野生斑马鱼为模型,在安全浓度范围内,分别采用荧光显像和体内碱性磷酸酶定量检测的方法,以PTK787为阳性对照,考察马钱子水提取物对斑马鱼血管生成的... 详细信息

目的:以斑马鱼为模型,探讨马钱子的抗血管生成活性。方法:以Tg(kdrl:mCherry)斑马鱼和野生斑马鱼为模型,在安全浓度范围内,分别采用荧光显像和体内碱性磷酸酶定量检测的方法,以PTK787为阳性对照,考察马钱子水提取物对斑马鱼血管生成的抑制作用。结果:与空白对照组比较,在一定的浓度范围内,低浓度的马钱子水提取物能抑制Tg(kdrl:mCherry)斑马鱼的节间血管生成,随着提取物浓度的增加抑制作用更加明显,抑制作用呈剂量依赖性。在碱性磷酸酶定量检测实验中,马钱子水提取物浓度为25μg·mL^(-1)时,血管生成抑制率为8.61%;浓度为100μg·mL^(-1)时,血管生成抑制率为26.16%;在一定的浓度范围内,马钱子处理组均表现出显著的抗血管生成活性(P<0.05),血管生成抑制率与马钱子水提取物浓度成线性关系。结论:马钱子水提取物可以有效的抑制斑马鱼血管生成,有明显的抗血管生成活性。

关键词：马钱子斑马鱼抗血管生成荧光显像碱性磷酸酶定量

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香加皮水提取物对斑马鱼幼鱼肝脏毒性的初步研究

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环球中医药 2017年第10期10卷 1161-1166页

作者：代一航赵崇军田敬欢倪媛媛李二文杨冉冉冯丹刘雯雪王昭懿乔艺涵马志强林瑞超邹迪新北京中医药大学中药学院中药品质评价北京市重点实验室硕士研究生100102 内蒙古医科大学药学院

目的研究香加皮水提取物对斑马鱼幼鱼肝脏的毒性作用。方法将受精后发育4天的斑马鱼幼鱼暴露于不同浓度的香加皮水提取物中,24小时后,统计幼鱼的死亡率,计算量毒曲线;选取低于LC_(10)的三个药物暴露组和空白组,以幼鱼肝脏形态和面积变... 详细信息

目的研究香加皮水提取物对斑马鱼幼鱼肝脏的毒性作用。方法将受精后发育4天的斑马鱼幼鱼暴露于不同浓度的香加皮水提取物中,24小时后,统计幼鱼的死亡率,计算量毒曲线;选取低于LC_(10)的三个药物暴露组和空白组,以幼鱼肝脏形态和面积变化、转基因幼鱼肝脏荧光面积和荧光强度以及幼鱼肝脏细胞凋亡、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、谷胱甘肽过氧化酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)、丙氨酸转氨酶(alanine aminotransferase,ALT)、天门冬氨酸转氨酶(aspartic transaminase,AST)活性为毒性评价指标。结果香加皮水提取物对幼鱼的量-毒回归曲线y=-1.0843+0.0014x(R^2=0.9524,r=0.97590,P<0.001),LC_(10)为845.9286μg/m L;与空白组相比,幼鱼肝脏形态异常、透明度降低,肝脏面积随药物暴露浓度增加而剂量依赖性增加(P<0.05);转基因幼鱼肝脏荧光面积随暴露浓度增加而增大,但在高浓度组减小,荧光强度随暴露浓度的增加而减小(P<0.05);高浓度暴露组幼鱼肝脏区域显示了细胞凋亡;药物暴露组幼鱼SOD、GSH-Px活力显著下降,ALT、AST活力显著上升(P<0.05)。结论香加皮水提取物对斑马鱼幼鱼的肝脏毒性可能是通过破坏其体内氧化应激平衡,进而诱导肝脏细胞凋亡实现的。

关键词：香加皮水提取物斑马鱼模型肝脏毒性

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