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甲基丙烯酰化透明质酸/脱细胞华通胶水凝胶支架的制备与表征

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中国组织工程研究 2024年第22期28卷 3517-3523页

作者：袁勋丁振罡付力伟吴江郑亚哲张智超田广招眭翔刘舒云郭全义贵州医科大学附属医院骨科贵州省贵阳市550004 解放军总医院第一医学中心骨科研究所骨科再生医学北京市重点实验室全军骨科战创伤重点实验室北京市100853

背景:随着组织工程为关节软骨损伤修复这一世界难题带来了新的希望,构建成分仿生的光固化3D打印水凝胶支架对软骨组织工程具有重要意义。目的:通过数字光处理3D打印技术构建成分仿生的甲基丙烯酰化透明质酸/脱细胞华通胶水凝胶支架,评... 详细信息

背景:随着组织工程为关节软骨损伤修复这一世界难题带来了新的希望,构建成分仿生的光固化3D打印水凝胶支架对软骨组织工程具有重要意义。目的:通过数字光处理3D打印技术构建成分仿生的甲基丙烯酰化透明质酸/脱细胞华通胶水凝胶支架,评价其生物相容性。方法:从人脐带中分离提取华通胶组织后进行脱细胞处理,冷冻干燥后磨成粉末,溶于PBS中制备50 g/L的脱细胞华通胶溶液。制备甲基丙烯酰化透明质酸,冻干后溶于PBS中制备50 g/L的甲基丙烯酰化透明质酸溶液。将脱细胞华通胶溶液与甲基丙烯酰化透明质酸溶液以体积比1∶1混合,加入光引发剂后作为生物墨水。通过数字光处理3D打印技术分别制备甲基丙烯酰化透明质酸水凝胶支架(记为HAMA水凝胶支架)与甲基丙烯酰化透明质酸/脱细胞华通胶水凝胶支架(记为HAMA/WJ水凝胶支架),表征支架的微观结构、溶胀性能、生物相容性与促软骨分化性能。结果与结论:①扫描电镜下见两组支架均呈三维立体的网状结构,其中HAMA/WJ水凝胶支架纤维连接更加均匀;两组支架均在10 h内达到溶胀平衡,HAMA/WJ水凝胶支架的平衡溶胀比低于HAMA水凝胶支架(P<0.05)。②CCK-8实验显示相较于HAMA水凝胶支架,HAMA/WJ水凝胶支架可促进骨髓间充质干细胞的增殖;死活染色显示骨髓间充质干细胞在两组支架上生长良好,并且HAMA/WJ水凝胶支架上的细胞立体分布均匀、细胞数量更多;鬼笔环肽染色显示相较于HAMA水凝胶支架,HAMA/WJ水凝胶支架上的骨髓间充质干细胞黏附与铺展更佳。③将骨髓间充质干细胞接种于两组支架后进行成软骨诱导培养,qRT-PCR检测结果显示,HAMA/WJ水凝胶支架组聚集蛋白聚糖、SOX9、Ⅱ型胶原mRNA表达量均高于HAMA水凝胶支架组(P<0.05,P<0.01)。④结果表明,数字光处理3D生物打印HAMA/WJ水凝胶支架可促进骨髓间充质干细胞的增殖、黏附及成软骨分化。

关键词：华通胶甲基丙烯酰化透明质酸水凝胶支架数字光处理3D打印软骨损伤骨髓间充质干细胞组织工程

软骨细胞外基质免疫调控机制探索及联合白介素4促进骨软骨修复体内研究

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软骨细胞外基质免疫调控机制探索及联合白介素4促进骨软骨修复体...

作者：田广招南开大学

学位级别：硕士

背景:软骨再生是一个复杂的病生理过程。滑膜巨噬细胞在关节软骨损伤急性炎症反应中起着重要的免疫调节作用。由于巨噬细胞的异质性,其表型和极化状态是决定软骨损伤后愈合反应的关键因素。通过调节宿主巨噬细胞的反应,许多来源于细胞... 详细信息

背景:软骨再生是一个复杂的病生理过程。滑膜巨噬细胞在关节软骨损伤急性炎症反应中起着重要的免疫调节作用。由于巨噬细胞的异质性,其表型和极化状态是决定软骨损伤后愈合反应的关键因素。通过调节宿主巨噬细胞的反应,许多来源于细胞外基质的生物材料已被用于修复和重建各种组织。然而,脱细胞软骨细胞外基质(extracellular matrix,ECM)对巨噬细胞的免疫调节作用尚未阐明。因此,探索脱细胞软骨基质(decellularized cartilage matrix,DCM)的免疫调节特性对软骨再生材料的设计具有重要的指导意义。方法:通过湿法粉碎+差速离心方法制备猪关节软骨来源的DCM,通过组织学染色及蛋白质组学测定了其成分组成。并在体外检测小鼠巨噬细胞系RAW264.7和小鼠骨髓来源的巨噬细胞(mouse bone marrow-derived macrophages,BMDMs)对胃蛋白酶溶解的DCM(pepsin-solubilized DCM,PDCM)的反应。然后检测PDCM活化的巨噬细胞上清对骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)的侵袭、迁移、增殖和促软骨分化的作用。最后,我们将无细胞DCM支架植入大鼠膝关节滑车的原位骨软骨缺损模型中,联合早期(3-7天)关节腔内连续注射IL-4以探究无细胞DCM支架的自身免疫调节特性对实现软骨再生的有效性。结果:制备的DCM无细胞成分残留,并且保留了天然软骨细胞外基质的主要成分。巨噬细胞经PDCM活化后极化为一种与抗炎促再生表型相关的独特亚型,且其上清可在体外促进BMSCs侵袭、迁移、增殖和软骨分化。体内实验表明,无细胞DCM支架结合IL-4精确调控并优化免疫反应,促进关节软骨的有效再生。结论:脱细胞软骨细胞外基质是一种良好的软骨组织工程材料,该材料对巨噬细胞表型的主动调节作用是其促进软骨再生修复的机制之一。这种脱细胞软骨细胞外基质支架结合精确主动免疫调节策略,为软骨再生材料的开发提供了一种新的途径。图18幅,表4个,参考文献61篇。

关键词：脱细胞的细胞外基质巨噬细胞极化免疫调节干细胞募集软骨组织工程

CD146阳性亚群有作为软骨组织工程种子细胞的应用潜力

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中国组织工程研究 2020年第19期24卷 2997-3003页

作者：眭翔田广招杨振李旭刘舒云郭全义解放军总医院骨科研究所骨科再生医学北京市重点实验室全军骨科战创伤重点实验室北京市100853 南开大学医学院天津市300071

背景:再生医学的发展、组织工程技术的出现为软骨缺损重建提供了新的解决思路。在组织工程中,间充质干细胞是应用广泛的种子细胞,然而干细胞作为一个异质性的细胞群体其不同亚群发挥着不同的功能。因此,应用间充质干细胞关键功能亚群进... 详细信息

背景:再生医学的发展、组织工程技术的出现为软骨缺损重建提供了新的解决思路。在组织工程中,间充质干细胞是应用广泛的种子细胞,然而干细胞作为一个异质性的细胞群体其不同亚群发挥着不同的功能。因此,应用间充质干细胞关键功能亚群进行软骨修复具有广泛应用前景。目的:从人脂肪间充质干细胞中分离出CD146阳性亚群细胞,验证其生物学特性及其作为软骨组织工程种子细胞的潜力。方法:人脂肪间充质干细胞由浙江金时代生物技术有限公司提供,通过流式细胞术对人脂肪间充质干细胞表面标志物进行鉴定,应用免疫磁珠分选方法从人脂肪间充质干细胞中分选出CD146阳性表达的细胞亚群。通过基因芯片检测技术及生物信息学分析技术揭示2种细胞的分子特性;体外诱导2种细胞成软骨分化并进行鉴定;冻存复苏前后检测2种细胞的细胞活性及凋亡情况。结果与结论:①人脂肪间充质干细胞表达高水平干细胞相关标志物CD73、CD90,不表达造血干细胞相关标志物CD34、CD45、HLA-DR;②生物信息分析结果表明CD146阳性亚群细胞与脂肪间充质干细胞相比在炎症通路及骨骼肌肉系统疾病有不同功能;③CD146阳性亚群细胞能够成球软骨分化,并且其成软骨分化能力要优于人脂肪间充质干细胞;④CD146阳性亚群细胞复苏后凋亡情况和活性均要优于人脂肪间充质干细胞;⑤结果表明,CD146阳性亚群细胞具有良好的成软骨分化潜力,是一种具有前景的软骨组织工程种子细胞。

关键词：软骨损伤脂肪间充质干细胞 CD146阳性亚群细胞基因芯片生物信息学成软骨分化

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CD146在MSCs中的作用

中国修复重建外科杂志 2021年第2期35卷 227-233页

作者：查康康田广招杨振孙志强刘舒云郭全义解放军医学院北京100853 中国人民解放军总医院第一医学中心骨科研究所骨科再生医学北京市重点实验室全军骨科战创伤重点实验室北京100853 南开大学医学院天津300071

目的总结CD146在MSCs中的表达情况及作用。方法广泛查阅国内外CD146相关研究文献,对其在MSCs中的表达情况及作用进行总结分析。结果CD146是一种介导细胞间或细胞与细胞外基质间黏附的跨膜蛋白,表达于多种MSCs表面。越来越多研究表明,CD1... 详细信息

目的总结CD146在MSCs中的表达情况及作用。方法广泛查阅国内外CD146相关研究文献,对其在MSCs中的表达情况及作用进行总结分析。结果CD146是一种介导细胞间或细胞与细胞外基质间黏附的跨膜蛋白,表达于多种MSCs表面。越来越多研究表明,CD146+MSCs比CD146-MSCs或未分选MSCs具有更加优良的细胞特性,如更强的增殖、分化、迁移和免疫调节等能力。应用CD146+MSCs治疗特定疾病也获得了更佳效果。CD146还参与介导多种细胞信号通路,但其在MSCs中是否发挥同样的作用还需进一步实验证明。结论利用CD146+MSCs进行组织和器官损伤修复将有利于提高MSCs的治疗效果。

关键词： CD146 MSCs 异质性干细胞亚群再生

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脱细胞软骨基质对巨噬细胞极化的调控

中国组织工程研究 2021年第22期25卷 3545-3550页

作者：田广招杨振查康康孙志强李旭眭翔黄靖香郭全义刘舒云解放军医学院北京市100853 中国人民解放军第一医学中心骨科研究所骨科再生医学北京市重点实验室全军骨科战创伤重点实验室北京市100853 南开大学医学院天津市300071

背景:细胞外基质来源的生物材料在组织工程再生领域应用广泛,近年来生物材料对巨噬细胞表型极化作用受到极大关注。目的:探究脱细胞软骨基质(decellularized cartilage extracellular matrix,DCM)及胃蛋白酶处理脱细胞软骨基质(pepsin t... 详细信息

背景:细胞外基质来源的生物材料在组织工程再生领域应用广泛,近年来生物材料对巨噬细胞表型极化作用受到极大关注。目的:探究脱细胞软骨基质(decellularized cartilage extracellular matrix,DCM)及胃蛋白酶处理脱细胞软骨基质(pepsin treated decellularized cartilage extracellular matrix,PDCM)对巨噬细胞表型极化的调控作用。方法:采用物理粉碎、反复冻融及差速离心方法制备猪关节软骨脱细胞软骨基质(DCM),溶解于胃蛋白酶溶液内得到其生物降解产物(PDCM)。将小鼠巨噬细胞系RAW264.7分5组培养:对照组加入巨噬细胞完全培养基,M1型阳性对照组加入含脂多糖+干扰素γ的完全培养基,M2型阳性对照组加入含白细胞介素4的完全培养基,PDCM组加入含PDCM的完全培养基,胃蛋白酶组加入含胃蛋白酶的完全培养基,培养18 h后进行CD86(M1型巨噬细胞)、CD206(M2型巨噬细胞)免疫荧光染色鉴定。另外将小鼠巨噬细胞系RAW264.7分6组培养:对照组、M1型阳性对照组、M2型阳性对照组、胃蛋白酶组、DCM涂布组与PDCM涂布组,培养24 h后进行CD86、CD206流式细胞术检测。结果与结论:①免疫荧光结果显示,PDCM组诱导巨噬细胞CD86表达阳性比约为0.13,诱导巨噬细胞CD206表达阳性比约为0.5;②流式细胞术检测结果显示,DCM诱导巨噬细胞表达CD86(20.1%)及CD206(28.8%),PDCM只诱导巨噬细胞表达CD206(23.2%);③结果表明,DCM及其生物降解产物PDCM具有促进巨噬细胞M2型极化的作用。

关键词：软骨材料组织工程脱细胞软骨基质巨噬细胞极化巨噬细胞表型

脱细胞软骨细胞外基质对小鼠巨噬细胞系表型的调控

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中国组织工程研究 2021年第10期25卷 1512-1516页

作者：李珺琦田广招陈明学王皓刘舒云眭翔黄靖香李明郭全义长治医学院基础医学部山西省长治市046000 中国人民解放军总医院第一医学中心骨科研究所骨科再生医学北京市重点实验室全军骨科战创伤重点实验室北京市100853 长治医学院解剖教研室山西省长治市046000

背景:前期研究证实脱细胞软骨细胞外基质可有效促进关节软骨缺损修复再生,具有良好的修复效果,但是其促再生机制尚未阐明。目的:探究猪来源脱细胞软骨细胞外基质支架对小鼠巨噬细胞系表型极化的调控。方法:以猪膝关节软骨为原料,通过湿... 详细信息

背景:前期研究证实脱细胞软骨细胞外基质可有效促进关节软骨缺损修复再生,具有良好的修复效果,但是其促再生机制尚未阐明。目的:探究猪来源脱细胞软骨细胞外基质支架对小鼠巨噬细胞系表型极化的调控。方法:以猪膝关节软骨为原料,通过湿法粉碎、差速离心、冷冻干燥的方法制备脱细胞软骨细胞外基质支架。将小鼠RAW264.7巨噬细胞系接种于脱细胞软骨细胞外基质支架,构建细胞-支架复合物,体外极化诱导4 d,采用扫描电镜观察细胞黏附情况,死/活细胞染色观察细胞生长情况,免疫荧光染色观察M1型巨噬细胞特征性表面标志物CD86和M2型巨噬细胞特征性表面标志物CD206的表达,进而明确极化诱导情况。结果与结论:①扫描电镜显示,复合物中的巨噬细胞为原来的圆形或类圆形,沿着支架的管状排列,广泛分布在支架表面及内部结构中;②死/活细胞染色显示,支架上附着的大部分细胞为活细胞,仅有极少数死细胞;③免疫荧光染色显示,复合物中的M2型巨噬细胞标志物CD206呈80%的高阳性表达,M1型巨噬细胞标志物CD86的阳性表达甚少;④结果表明,猪来源脱细胞软骨细胞外基质支架可诱导极化M0型巨噬细胞为修复性M2型巨噬细胞。

关键词：骨软骨再生细胞外基质巨噬细胞极化组织工程免疫

低温沉积3D打印负载基质细胞衍生因子1的分级多孔软骨复合支架

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中国组织工程研究 2023年第30期27卷 4776-4782页

作者：吴江殷瀚严子能田广招丁振罡袁勋付力伟田壮眭翔刘舒云郭全义贵州医科大学附属医院骨科贵州省贵阳市550004 中国人民解放军总医院第一医学中心骨科研究所骨科再生医学北京市重点实验室全军骨科战创伤重点实验室北京市100853

背景:基于原位组织工程再生技术的飞速发展,促进体内干细胞募集策略为软骨损伤修复提供了新的方向。目的:通过低温沉积3D打印技术构建负载基质细胞衍生因子1的分级多孔细胞外基质支架。方法:采用化学法制备脱细胞软骨细胞外基质。制备... 详细信息

背景:基于原位组织工程再生技术的飞速发展,促进体内干细胞募集策略为软骨损伤修复提供了新的方向。目的:通过低温沉积3D打印技术构建负载基质细胞衍生因子1的分级多孔细胞外基质支架。方法:采用化学法制备脱细胞软骨细胞外基质。制备脱细胞软骨细胞外基质匀浆,并加入基质细胞衍生因子1,作为生物墨水,采用低温沉积3D打印技术构建分级多孔细胞外基质支架,通过大体观及扫描电镜观察支架的微观结构,通过CCK-8、死活染色及鬼笔环肽骨架染色评价支架的生物相容性,检测支架的体外缓释性能,通过Transwell实验检测支架对骨髓间充质干细胞迁移的影响。结果与结论:①扫描电镜显示,打印的细胞外基质支架呈现分级多孔的结构,孔径分布均匀,纤维交错排列,孔与孔之间相互贯通;②CCK-8实验显示,细胞外基质支架无明显的细胞毒性;死活染色显示,骨髓间充质干细胞能够很好地在细胞外基质支架上生长;鬼笔环肽骨架染色显示,骨髓间充质干细胞在细胞外基质支架上能够很好地铺展开,呈梭形;③细胞外基质支架具有良好的缓释性能,在前7 d内较快速地释放基质细胞衍生因子1,累计释放率达约60%,1-4周释放细胞因子速度逐渐减缓,4-6周的释放规律类似于零级释放动力学,42 d累计释放率约达80%,并且仍有缓慢释放的趋势;④Transwell迁移实验显示,基质细胞衍生因子1可提升细胞外基质支架募集干细胞的能力;⑤结果表明,基质细胞衍生因子1可提高低温沉积3D打印细胞外基质支架募集骨髓间充质干细胞的能力。

关键词：细胞外基质支架基质细胞衍生因子1 低温沉积3D打印软骨损伤骨髓间充质干细胞迁移

转化生长因子β3/聚乳酸-羟基乙酸微球对干细胞的调控

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中国组织工程研究 2020年第28期24卷 4540-4546页

作者：杨振李浩高仓健付力伟田广招查康康孙志强李旭郭维民眭翔黄靖香刘舒云卢世璧郭全义南开大学医学院天津市300071 解放军总医院骨科研究所骨科再生医学北京市重点实验室全军骨科战创伤重点实验室北京市100853

背景:转化生长因子β3/聚乳酸-羟基乙酸缓释微球系统可使药物在作用部位维持有效药物浓度,提高生长因子的利用率。目的:优化转化生长因子β3/聚乳酸-羟基乙酸缓释微球制备工艺,探究其对脂肪间充质干细胞增殖和迁移的影响。方法:采用乳化... 详细信息

背景:转化生长因子β3/聚乳酸-羟基乙酸缓释微球系统可使药物在作用部位维持有效药物浓度,提高生长因子的利用率。目的:优化转化生长因子β3/聚乳酸-羟基乙酸缓释微球制备工艺,探究其对脂肪间充质干细胞增殖和迁移的影响。方法:采用乳化-溶剂挥发法制备转化生长因子β3/聚乳酸-羟基乙酸缓释微球,并对微球的形态、粒径大小、药物空间分布、包封率、载药量和缓释性能进行表征。将转化生长因子β3/聚乳酸-羟基乙酸缓释微球溶解于PBS中,于相应的时间点检测上清液中转化生长因子β3浓度,对应时间点扫描电镜观察微球形态。将脂肪间充质干细胞分6组培养,分别加入培养基(阴性对照)、含转化生长因子β3的培养基、含空白聚乳酸-羟基乙酸微球的培养基、含10,100,1000 g/L转化生长因子β3/聚乳酸-羟基乙酸微球的培养基,于对应的时间点CCK-8法检测增殖。将脂肪间充质干细胞分别与培养基(阴性对照)、含转化生长因子β3的培养基、含聚乳酸-羟基乙酸微球的培养基、含10,100,1000 g/L转化生长因子β3/聚乳酸-羟基乙酸微球的培养基以非接触方式共培养24 h,检测细胞迁移数量。结果与结论:①转化生长因子β3/聚乳酸-羟基乙酸微球呈球形,表面光滑,无粘连,粒径均匀分布,微球直径2-50μm,微球内的蛋白药物分布均匀,具有较高的包封率与载药量;②缓释微球具有良好的降解性能,体外可于6个月后完全降解;同时具有良好的缓释性能,体外可缓慢释放转化生长因子β3长达45d;③空白微球及含转化生长因子β3的缓释微球对脂肪间充质干细胞增殖无影响;④空白微球对脂肪间充质干细胞的迁移无影响,转化生长因子β3及含转化生长因子β3的缓释微球可促进脂肪间充质干细胞的迁移,不同质量浓度缓释微球间的促进效果无差异;⑤结果表明,转化生长因子β3/聚乳酸-羟基乙酸缓释微球可在不影响脂肪间充质干细胞增殖的情况下促进其迁移。

关键词：转化生长因子β3 聚乳酸-羟基乙酸缓释微球兔脂肪间充质干细胞增殖迁移软骨损伤组织工程

3D生物打印负载转化生长因子β3的软骨复合支架

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中国组织工程研究 2021年第34期25卷 5445-5452页

作者：杨振李浩付力伟高仓健姜双鹏王福鑫苑志国孙志强查康康田广招曹福洋眭翔刘舒云郭全义南开大学医学院天津市300071 解放军总医院第一医学中心骨科研究所骨科再生医学北京市重点实验室全军骨科战创伤重点实验室北京市100853

背景:通过募集内源性干细胞原位再生软骨损伤的治疗策略,是未来软骨组织工程研究的新方向。目的:构建既能募集干细胞又能促进其黏附和增殖,且有利于新生组织成熟的组织工程软骨复合支架。方法:将脱细胞软骨细胞外基质(extracellular mat... 详细信息

背景:通过募集内源性干细胞原位再生软骨损伤的治疗策略,是未来软骨组织工程研究的新方向。目的:构建既能募集干细胞又能促进其黏附和增殖,且有利于新生组织成熟的组织工程软骨复合支架。方法:将脱细胞软骨细胞外基质(extracellular matrix,ECM)与甲基丙烯酸酯化明胶(methacrylated gelatin,GelMA)混合配制光敏性生物墨水,利用3D生物打印技术分别制备单纯聚己内酯[poly(Ɛ-caprolactone),PCL]支架、PCL/GelMA/ECM支架。将转化生长因子β3(transforming growth factorβ3,TGF-β3)负载于生物墨水中制备PCL/GelMA/ECM/TGF-β3支架,检测其缓释性能。从形态学、组织学、生物化学、生物力学等角度评价PCL/GelMA/ECM支架的物理化学性质。利用CCK-8法检测PCL/GelMA/ECM支架的细胞毒性。将脂肪间充质干细胞接种于PCL/GelMA/ECM支架上,1,4,7 d后,共聚焦显微镜下观察细胞活性,扫描电镜观察细胞黏附。将PCL/GelMA/ECM支架植入SD大鼠皮下,组织学观察炎性细胞浸润与支架降解。利用Transwell小室实验检测PCL/GelMA/ECM支架、PCL/GelMA/ECM/TGF-β3支架对脂肪间充质干细胞迁移的影响,以单独培养的细胞为阴性对照。结果与结论:①PCL/GelMA/ECM支架呈现三维立体多孔网状结构,无细胞成分,含有Ⅱ型胶原和糖胺聚糖等软骨特异性成分,支架弹性模量为(14.24±2.44)MPa;②PCL/GelMA/ECM支架无明显的细胞毒性;③脂肪间充质干细胞紧密贴附于PCL/GelMA/ECM支架上,细胞活性良好,可分泌细胞外基质;④PCL/GelMA/ECM支架植入大鼠皮下1周后有轻度急性炎症反应,3周后炎性反应减轻,并可见逐步支架降解;⑤PCL/GelMA/ECM/TGF-β3支架具有良好的缓释性能,可持续释放TGF-β3达60 d;⑥相对于阴性对照组,PCL/GelMA/ECM支架、PCL/GelMA/ECM/TGF-β3支架均可促进脂肪间充质干细胞的迁移,其中以PCL/GelMA/ECM/TGF-β3支架促迁移作用更显著;⑦结果表明,3D打印PCL/GelMA/ECM/TGF-β3支架可促进脂肪间充质干细胞的增殖、黏附与迁移。

关键词：骨材料支架转化生长因子β3 3D生物打印软骨损伤脂肪间充质干细胞招募迁移