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LAMP方法检测豌豆细菌性疫病菌

植物检疫 2013年第3期27卷 80-84页

作者：封立平尼秀媚厉艳吴兴海纪瑛甘琴华山东出入境检验检疫局山东青岛266002

本文应用环介导等温核酸扩增技术(LAMP)对豌豆细菌性疫病菌的肽相关脂蛋白(oprL)特异性基因进行扩增,采用2对引物识别目的片段的6个特异性区域,60 oC恒温1h完成扩增,设计的引物与假单胞属的近缘菌丁香假单胞菌丁香致病变种、绿黄假单胞... 详细信息

本文应用环介导等温核酸扩增技术(LAMP)对豌豆细菌性疫病菌的肽相关脂蛋白(oprL)特异性基因进行扩增,采用2对引物识别目的片段的6个特异性区域,60 oC恒温1h完成扩增,设计的引物与假单胞属的近缘菌丁香假单胞菌丁香致病变种、绿黄假单胞菌、丁香假单胞菌大豆致病变种、丁香假单胞菌菜豆致病变种都没有扩增反应,表现了较好的特异性。该LAMP检测方法与普通PCR相比灵敏度高100倍。同时,LAMP技术的检测程序便捷,所需设备简单,其结果可以通过肉眼观察来判断,比常规PCR能更早得到反应结果,因此该技术在该病菌的口岸检疫方面拥有更大的优势。

关键词：豌豆细菌性疫病菌 LAMP oprL 检测

进境韩国大花蕙兰上唐菖蒲伯克氏菌的分离鉴定及生物学研究

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植物病理学报 2014年第3期44卷 313-317页

作者：厉艳甘琴华封立平邵秀岭山东出入境检验检疫局检验检疫技术中心青岛266002

大花蕙兰（Cymbidium hybridum），又名虎头兰、喜姆比兰，兰科、兰属多年生草本植物，是近几年我国花卉市场上流行的高档室内盆栽花卉。大花蕙兰的杂交育种已有一百多年的历史，每年新增加的品种有几十种之多。近年来，我国检验检疫部... 详细信息

大花蕙兰（Cymbidium hybridum），又名虎头兰、喜姆比兰，兰科、兰属多年生草本植物，是近几年我国花卉市场上流行的高档室内盆栽花卉。大花蕙兰的杂交育种已有一百多年的历史，每年新增加的品种有几十种之多。近年来，我国检验检疫部门分别从各入境口岸的进境大花蕙兰中多次发现携带有菊基腐病菌（Erwinia chrysanthemi）、兰花细菌性褐腐病菌（Erwinia cypripedii）、建兰花叶病毒（Cymbidium mosaic virus）等多种病原生物，均有潜伏期长、发病率高等特点。入境大花蕙兰种苗携带植物病原细菌、病毒等有害生物隐蔽性强、风险较高。

关键词：大花蕙兰分离鉴定进境生物学唐菖蒲建兰花叶病毒多年生草本植物韩国

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边缘假单胞菌的分离鉴定及其特性

植物保护学报 2011年第2期38卷 183-184页

作者：甘琴华厉艳邵秀玲王英超山东出入境检验检疫局青岛266001

边缘假单胞菌Pseudomonas marginalis是假单胞菌科假单胞菌属植物病原细菌,能引发百合软腐病[1]、草莓花疫病、番茄细菌性髓部坏死病[2]、马蹄莲块茎软腐病[3]等,还可引发洋葱、莴苣、中国白菜、大蒜、姜、花椰菜、水稻等软腐病[4]。边... 详细信息

边缘假单胞菌Pseudomonas marginalis是假单胞菌科假单胞菌属植物病原细菌,能引发百合软腐病[1]、草莓花疫病、番茄细菌性髓部坏死病[2]、马蹄莲块茎软腐病[3]等,还可引发洋葱、莴苣、中国白菜、大蒜、姜、花椰菜、水稻等软腐病[4]。边缘假单胞菌具有如此广泛的宿主致病性取决于其生理特点,尤其是在0℃生长良好、5℃能大量繁殖等特点[3]。

关键词：假单胞菌属分离鉴定 Pseudomonas 细菌性髓部坏死病特性植物病原细菌软腐病生理特点

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木薯细菌性萎蔫病菌的LAMP快速检测方法

植物保护 2015年第3期41卷 93-99页

作者：封立平李洪林倪新王简纪瑛甘琴华山东出入境检验检疫局青岛266002 滨州出入境检验检疫局滨州256603 临沂出入境检验检疫局综合技术服务中心临沂276034

建立了一种木薯细菌性萎蔫病菌的环介导恒温扩增快速检测方法,为木薯细菌性萎蔫病的快速检测提供有力的技术支持。针对木薯细菌性萎蔫病菌TAL效应器蛋白质(pthBXam)靶序列的6个位点设计4条特异性引物,并对反应温度和内引物浓度等参数进... 详细信息

建立了一种木薯细菌性萎蔫病菌的环介导恒温扩增快速检测方法,为木薯细菌性萎蔫病的快速检测提供有力的技术支持。针对木薯细菌性萎蔫病菌TAL效应器蛋白质(pthBXam)靶序列的6个位点设计4条特异性引物,并对反应温度和内引物浓度等参数进行了优化,设计的引物与试验中提供的其他黄单胞近缘种都没有扩增反应,表现了较好的特异性。LAMP方法对木薯细菌性萎蔫病菌菌株DNA的检测下限为1pg/μL,比常规PCR灵敏度高100倍。该方法采用SYBR Green I染料法对扩增产物闭管检测,裸眼观察颜色变化判断反应结果,能快速、准确地对田间样品进行检测,没有出现假阳性和假阴性。与其他检测方法相比,LAMP方法检测时间短,效率高,降低了设备投入,易于操作,适合木薯细菌性萎蔫病菌的现场检疫和大规模监测。

关键词：木薯细菌性萎蔫病菌环介导等温扩增检测

基于gpd基因的大蒜黑腐病菌实时荧光定量PCR鉴定技术

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中国农业科学 2015年第2期48卷 390-397页

作者：王英超甘琴华厉艳纪瑛吴兴海邵秀玲山东出入境检验检疫局

【目的】大蒜黑腐病菌(Embellisia allii(Campanile)Simmons)的检疫鉴定主要采用形态鉴定方法。不仅耗时长,而且大蒜黑腐病菌与本属其他种以及其他属的分生孢子非常相似,极难分辨,需要建立快速、有效的分子诊断方法。研究旨在建立实时... 详细信息

【目的】大蒜黑腐病菌(Embellisia allii(Campanile)Simmons)的检疫鉴定主要采用形态鉴定方法。不仅耗时长,而且大蒜黑腐病菌与本属其他种以及其他属的分生孢子非常相似,极难分辨,需要建立快速、有效的分子诊断方法。研究旨在建立实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR,q PCR)体系以准确、灵敏地鉴定大蒜黑腐病菌。【方法】从NCBI的Gen Bank数据库中,选取大蒜黑腐病菌和其他大蒜病害以及近似种的3-磷酸甘油脱氢酶(gpd)基因核酸序列数据15种,应用引物设计软件Primer express,根据探针设计原则从理论上选出1条探针和3对引物。根据试验结果对上述引物进行筛选,筛选出能够鉴定出大蒜黑腐病菌的特异性引物对和Taq Man探针。同时对反应体系中复性-延伸温度的反应参数进行优化,设计56、58、60℃3个温度梯度;将大蒜黑腐病菌基因组DNA在紫外核酸分析仪上进行定量后进行10倍的梯度稀释,对探针灵敏性进行测试,从而建立大蒜黑腐病菌Taq Man水解探针法q PCR检测体系。【结果】从基于Gen Bank上的15种gpd基因核酸序列设计的引物和探针中,筛选出能够鉴定大蒜黑腐病菌的特异性引物对Emb21/Emb32和Taq Man探针Emb。在供试的6种菌株中,只有靶标菌大蒜黑腐病菌利用该引物对和探针能够被特异性的检测到阳性,空白对照和其他参试菌均没有荧光信号的增加,检测为阴性。复性-延伸温度反应参数优化中,△Rn荧光信号增加值在58℃时达最大,56、60℃荧光信号增加值降低,经过多次重复试验,确定最佳的复性-延伸温度为58℃。灵敏度测试中,大蒜黑腐病菌DNA浓度稀释到140 pg时,所得的图形较好;当体系中模板浓度稀释到14 pg时,所得的图形较差。最终DNA检测灵敏度为140 pg。应用该引物和探针建立的q PCR检测方法能够从供试的菌株中特异性地检出大蒜黑腐病菌。【结论】建立了大蒜黑腐病菌Taq Man探针法q PCR检测体系,该检测技术能够从供试的6种病原菌中特异性检测出大蒜黑腐病菌,检测灵敏度可达140 pg。建立的基于gpd基因的大蒜黑腐病菌q PCR方法具有高度的特异性和灵敏度,适合口岸大蒜黑腐病菌的快速检测。

关键词：大蒜黑腐病菌 3-磷酸甘油脱氢酶基因实时荧光定量PCR

法国进境葡萄砧木中啤酒花矮化类病毒的检测与序列分析

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植物保护学报 2014年第3期41卷 346-351页

作者：甘琴华王英超魏晓棠邵秀玲刘彩霞厉艳山东检验检疫技术中心青岛266002

为检测法国进境葡萄砧木中啤酒花矮化类病毒(Hop stunt viroid,HSVd),对其进行了RTPCR检测及序列测定,并构建系统进化树比较了不同地域来源HSVd间的分子差异性。结果表明基于HSVd基因序列设计合成的1对引物能够扩增出302 bp大小的目标片... 详细信息

为检测法国进境葡萄砧木中啤酒花矮化类病毒(Hop stunt viroid,HSVd),对其进行了RTPCR检测及序列测定,并构建系统进化树比较了不同地域来源HSVd间的分子差异性。结果表明基于HSVd基因序列设计合成的1对引物能够扩增出302 bp大小的目标片段,而健康植株无此扩增产物。法国葡萄砧木中检出的HSVd分离物,与国内外已报道毒株的核酸序列同源性达90%~97%,与已报道的HSVd全基因组序列间差异较小,表明HSVd的序列变异与地域、寄主等无明显相关性。

关键词：啤酒花矮化类病毒法国进境葡萄砧木 RT-PCR检测序列分析

基于Brn1基因的大蒜紫斑病菌PCR检测技术

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植物检疫 2015年第1期29卷 30-32页

作者：王英超纪瑛厉艳王健力江庆生甘琴华邵秀玲吴兴海封立平山东出入境检验检疫局山东青岛266002 烟台出入境检验检疫局荆州市农业科学院

大蒜紫斑病菌是一种严重危害大蒜生产的真菌性病害,是中国大蒜出口中需要检疫的一种病害。根据1,3,8-三羟基萘还原酶基因(Brn1)的部分序列,设计出一对大蒜紫斑病菌特异性引物AP4/CTU,该引物特异性好,能专一扩增出480 bp电泳条带,而供试... 详细信息

大蒜紫斑病菌是一种严重危害大蒜生产的真菌性病害,是中国大蒜出口中需要检疫的一种病害。根据1,3,8-三羟基萘还原酶基因(Brn1)的部分序列,设计出一对大蒜紫斑病菌特异性引物AP4/CTU,该引物特异性好,能专一扩增出480 bp电泳条带,而供试大蒜上的其他病害、不同属的真菌及空白对照均无扩增条带,建立了大蒜紫斑病菌的PCR鉴定方法。该方法灵敏度较高,DNA检测灵敏度为4 ng。该方法快速简便,适用于出入境检验检疫及大蒜健康检测领域。

关键词：大蒜紫斑病菌 Brn1基因 PCR 检测

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利用实时荧光PCR技术检测风信子黄腐病菌

植物检疫 2009年第5期23卷 25-27页

作者：邵秀玲甘琴华赵文军厉艳王英超庞国兴山东出入境检验检疫局青岛266002 中国检验检疫科学研究院青岛出入境检验检疫局

风信子黄腐病菌是我国禁止入境的病原细菌之一,我国目前尚无该病的发病报道。本研究根据风信子黄腐病菌基因组16S-23SribosomalRNAintergenicspacer保守序列,设计并合成了1对特异性引物和1条具有稳定点突变特异性探针进行实时荧光PCR检... 详细信息

风信子黄腐病菌是我国禁止入境的病原细菌之一,我国目前尚无该病的发病报道。本研究根据风信子黄腐病菌基因组16S-23SribosomalRNAintergenicspacer保守序列,设计并合成了1对特异性引物和1条具有稳定点突变特异性探针进行实时荧光PCR检测,风信子黄腐病菌有很强的荧光信号,供试的其它7种病原细菌菌株均没有荧光产生。与常规PCR相比,实时荧光PCR检测特异性强,灵敏度高,适合病害的快速诊断和口岸检验检疫应用。经优化反应条件,建立了稳定的风信子黄腐病菌实时荧光PCR检测方法。

关键词：风信子黄腐病菌 TaqMan探针实时荧光PCR 检测

利用TaqMan探针实时荧光PCR方法检测香石竹细菌性萎蔫病菌

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植物病理学报 2011年第1期41卷 24-30页

作者：邵秀玲甘琴华厉艳赵文军吴兴海粟智平山东出入境检验检疫局青岛266002 中国检验检疫科学研究院北京100029 烟台出入境检验检疫局烟台264000

根据香石竹细菌性萎蔫病菌基因组16S-23S rRNA保守序列,设计并合成了一对特异性引物和一条具有稳定点突变特异性探针,建立了对香石竹细菌性萎蔫病菌的TaqMan实时荧光PCR检测方法。除香石竹细菌性萎蔫病菌外,还对其他7种病原细菌菌株进... 详细信息

根据香石竹细菌性萎蔫病菌基因组16S-23S rRNA保守序列,设计并合成了一对特异性引物和一条具有稳定点突变特异性探针,建立了对香石竹细菌性萎蔫病菌的TaqMan实时荧光PCR检测方法。除香石竹细菌性萎蔫病菌外,还对其他7种病原细菌菌株进行了荧光PCR检测。结果表明,只有香石竹细菌性萎蔫病菌产生荧光,其他病原细菌均没有荧光产生。与常规PCR相比,实时荧光PCR检测特异性强,灵敏度高,能检测到浓度为0.4 pg/μL的DNA,且能直接用于苗木等样品的检测,适合病害的快速诊断和口岸检验检疫应用。

关键词：香石竹细菌性萎蔫病菌 TaqMan探针实时荧光PCR 检测