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探索分枝杆菌噬菌体应用于结核病治疗的潜力

探索分枝杆菌噬菌体应用于结核病治疗的潜力

作者：甘易玲重庆医科大学

学位级别：硕士

目的目前结核病疫情仍相当严峻，化疗疗程过长和结核菌耐药是当前急待解决的两大主要难题。国内外研究发现部分分枝杆菌噬菌体能有效裂解结核菌标准株，甚至耐药的结核菌，而鸡尾酒制剂抗结核的效果更好，还能延缓结核菌对噬菌体产生抗... 详细信息

目的目前结核病疫情仍相当严峻，化疗疗程过长和结核菌耐药是当前急待解决的两大主要难题。国内外研究发现部分分枝杆菌噬菌体能有效裂解结核菌标准株，甚至耐药的结核菌，而鸡尾酒制剂抗结核的效果更好，还能延缓结核菌对噬菌体产生抗性。同时也有研究发现尾部卷尺蛋白含motif3基序的分枝杆菌噬菌体能有效感染静止期的耻垢分枝杆菌，且motif3具有复苏促进因子类似的水解肽聚糖的作用。故本实验首先是继续筛选能作为分枝杆菌噬菌体鸡尾酒制剂配方的噬菌体，同时也进一步明确尾部卷尺蛋白含motif3基序的分枝杆菌噬菌体能否复苏休眠的结核菌。方法1分枝杆菌噬菌体Bo4抗结核潜力研究1.1分枝杆菌噬菌体Bo4裂解不同pH值7H9固体培养基上耻垢分枝杆菌mc2155能力的比较。1.2体外研究分枝杆菌噬菌体Bo4阻止结核菌生长的能力，结果使用统计软件SPSS17.0进行统计分析。2分枝杆菌噬菌体Bo4基因组生物信息学分析2.1采用EditSeq软件分析基因组的一般特点：①应用DNAStar软件包中Editseq分析基因组大小及GC含量。②应用TRF软件推测Bo4基因组中可能的串联重复序列。③应用tRNAscan软件预测Bo4基因组中可能的tRNA区域。2.2采用Glimmer3.0软件进行基因预测，预测分枝杆菌噬菌体Bo4的编码区域。2.3将分枝杆菌噬菌体Bo4核苷酸序列与数据库的核苷酸序列做Blast分析对比，并将分析对比最好的结果制作成点阵图。2.4将分枝杆菌噬菌体Bo4基因与数据库基因进行Blast m8比对，将比较的最好结果生成svg的共线性图。2.5分枝杆菌噬菌体Bo4与其他6株G簇分枝杆菌噬菌体序列两两比对，采用邻接法，最后用tree view软件生成进化树图。3分枝杆菌噬菌体TM4促使结核休眠菌复苏的初步探索3.1采用密闭培养对数生长期的结核分枝杆菌标准株H37Rv构建结核休眠菌模型。3.2采用药敏检测、直接培养法和电镜观察作为结核休眠菌模型的检测方法。3.3采用双层固体培养基法扩增分枝杆菌噬菌体TM4及采用小平板法测定噬菌体TM4滴度。3.3采用肉眼观察、菌落计数和电镜观察作为结核休眠菌复苏的检测指标。结果1分枝杆菌噬菌体Bo4抗结核潜力研究1.1分枝杆菌噬菌体Bo4裂解不同pH值7H9固体培养基上耻垢分枝杆菌mc2155能力的比较。1.2分枝杆菌噬菌体Bo4感染组与空白对照组比较，在分别培养1天、3天及5天后，两组结核菌量均有明显差异，说明分枝杆菌噬菌体Bo4能有效裂解结核菌，阻止其生长。2分枝杆菌噬菌体Bo4基因组生物信息学分析2.1分枝杆菌噬菌体Bo4基因组大小为39318bp，GC含量为66.76%。通过TRF软件在噬菌体Bo4基因组中未找到串联重复序列。通过tRNAscan软件在噬菌体Bo4基因组中未找到tRNA。2.2根据Glimmer3.0软件分析，共预测出58个推测基因，对这些基因逐个进行同源检索分析，得到19个已知功能的基因，35个基因与未知功能的基因有同源性，4个基因未找到同源性基因。通过生物学信息分析在分枝杆菌噬菌体Bo4基因组中未发现有毒基因。2.3分枝杆菌噬菌体Bo4基因组的58个基因中只有4个基因与BPs和Angel无同源性，相似度达93.10%，共线性清晰，所以我们推测Bo4属于G簇分枝杆菌噬菌体，并且基因组是双链线性DNA。2.4分枝杆菌噬菌体Bo4核苷酸序列与数据库核苷酸序列比较分析发现，其与目前已经测序的6株G簇分枝杆菌噬菌体核苷酸序列相似性均较高（平均相似性>90%），也证明分枝杆菌噬菌体Bo4属于G簇分枝杆菌噬菌体。2.5从系统发育树分析可知距离越近的噬菌体，亲缘关系越近。分枝杆菌噬菌体Bo4与其他6株G簇分枝杆菌噬菌体核苷酸相似性均较高，系统发育学分析发现其与分枝杆菌噬菌体Legendre的关系最近。说明这两株分枝杆菌噬菌体具有共同的祖先。3分枝杆菌噬菌体TM4促使结核休眠菌复苏的初步探索3.1结核休眠菌模型的构建及检测密闭培养18天的含亚甲蓝的结核分枝杆菌标准株H37Rv试管变为无色，说明此时试管已变为缺氧。密闭培养50天还有部分结核菌可培养，未完全进入休眠菌状态。密闭培养93天的模型液接种在罗培养基上无菌落生长。将对数生长期的结核分枝杆菌标准株H37Rv和密闭培养120天的结核分枝杆菌标准株H37Rv行电镜观察，见密闭培养120天的结核分枝杆菌标准株H37Rv的细胞壁比对数生长期的结核分枝杆菌标准株H37Rv的细胞壁厚，交联更紧密。3.2噬菌体液的制备按照双

关键词：分枝杆菌噬菌体裂解结核分枝杆菌结核休眠菌复苏

分枝杆菌噬菌体DNAⅢ的遗传学信息及抗结核潜力初步研究

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上海交通大学学报（医学版） 2013年第10期33卷 1323-1327,1332页

作者：甘易玲刘平邬亭亭郭述良重庆医科大学附属第一医院呼吸与危重症医学科重庆400016 重庆市长寿区人民医院呼吸内科重庆401220 成都市第三人民医院呼吸内科成都610031

目的了解分枝杆菌噬菌体DNAⅢ的遗传学信息,初步探索其在抗结核治疗中的应用潜力。方法试剂盒提取噬菌体DNA,鸟枪法测序,Phred/Phrad/Consed软件包组装、拼接重叠群,PCR扩增连接重叠群缺口。通过DNAStar软件包中的EditSeq软件、Glimmer ... 详细信息

目的了解分枝杆菌噬菌体DNAⅢ的遗传学信息,初步探索其在抗结核治疗中的应用潜力。方法试剂盒提取噬菌体DNA,鸟枪法测序,Phred/Phrad/Consed软件包组装、拼接重叠群,PCR扩增连接重叠群缺口。通过DNAStar软件包中的EditSeq软件、Glimmer 3.0基因预测软件、共线性分析及构建DNAⅢ的系统发育树等对DNAⅢ基因组的遗传学信息进行分析。检测DNAⅢ对理化因素的抵抗力并行体外抗结核菌实验。结果 DNAⅢ基因组是含39 520 bp的线性双链DNA,G+C含量是66.83%,不含tRNA和串联重复序列;DNAⅢ有60个基因,gene 32编码整合酶,但未发现编码阻遏蛋白的基因;DNAⅢ与Angel和BPs核苷酸序列相似度高,且具有清晰的共线性;与DNAⅢ关系最近的是Liefie。DNAⅢ对温度、乙醇及酸碱度均敏感;抗结核菌实验第1、2、3天的DNAⅢ组结核菌数量与对照组比较差异均有统计学意义(P<0.05)。结论 DNAⅢ是一株能有效杀灭结核菌的G簇烈性分枝杆菌噬菌体。

关键词：噬菌体DNAⅢ 基因组结核菌抗结核菌

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结核休眠菌的治疗及控制策略

中国人兽共患病学报 2014年第2期30卷 191-194页

作者：甘易玲郭述良重庆医科大学附属第一医院呼吸与危重症医学科重庆400016

目前全球结核病疫情严峻,全世界约有1/3的人口存在潜伏结核菌感染。目前主要采用长疗程化疗来彻底清除结核病患者体内的结核菌,但机体仍可能有少量休眠菌潜伏下来,成为以后结核病复发的根源。所以控制潜伏感染的休眠菌至关重要。根据休... 详细信息

目前全球结核病疫情严峻,全世界约有1/3的人口存在潜伏结核菌感染。目前主要采用长疗程化疗来彻底清除结核病患者体内的结核菌,但机体仍可能有少量休眠菌潜伏下来,成为以后结核病复发的根源。所以控制潜伏感染的休眠菌至关重要。根据休眠菌在体内的生长周期,将控制休眠菌的方法分为药物直接杀灭潜伏期的结核菌、疫苗阻止休眠菌复苏和制剂或药物主动复苏休眠菌后再予以杀灭,其中主动复苏休眠菌后再予以杀灭时间短,易控制,将是未来控制潜伏感染的主要方法。

关键词：潜伏感染休眠菌控制治疗

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解氯乙醇酊治疗大鼠急性氯气中毒的作用机制

华中科技大学学报（医学版） 2018年第6期47卷 684-690页

作者：甘易玲徐红英夏薇刘小媛朱佑明重庆市职业病防治院呼吸内科重庆400060

目的探讨解氯乙醇酊缓解氯气中毒导致的肺部炎症的作用机制。方法将64只SD大鼠随机分为空白组、正常组、染毒组和解氯乙醇酊组,每组16只,空白组及正常组不进行染毒,以空气为对照;染毒组和解氯乙醇酊组分别以浓度为1000ppm和1500ppm的氯... 详细信息

目的探讨解氯乙醇酊缓解氯气中毒导致的肺部炎症的作用机制。方法将64只SD大鼠随机分为空白组、正常组、染毒组和解氯乙醇酊组,每组16只,空白组及正常组不进行染毒,以空气为对照;染毒组和解氯乙醇酊组分别以浓度为1000ppm和1500ppm的氯气动式染毒,各组每个浓度8只,均染毒10min。将所有SD大鼠染毒后30min进行灌胃给予1.2mL生理盐水(正常组、染毒组)或解氯乙醇酊(空白组、解氯乙醇酊组)。分别在染毒后12h和24h采集标本,以ELISA法测定肺泡灌洗液和血清中炎症因子(TNF-α、IL-1β和IL-8)水平,以硫代巴比妥酸反应产物(TBARs)实验测定肺组织脂质过氧化物水平,ELISA法检测肺泡灌洗液及肺组织中脂氧素,采用免疫火箭电泳法检测血浆纤维结合蛋白的含量,测定肺湿干重比值,观察肺组织病理变化。结果与空白组及正常组相比,染毒组肺泡灌洗液和血清中炎性细胞因子含量、肺组织中的TBARs含量、肺泡灌洗液及肺组织中脂氧素水平和肺湿干重比值均显著增加,而血浆纤维结合蛋白水平显著降低。与染毒组相比,解氯乙醇酊组肺泡灌洗液和血清中细胞因子含量、肺组织中的TBARs、肺湿干重比值均显著下降,而肺泡灌洗液及肺组织中脂氧素和血浆纤维结合蛋白的含量显著升高。结论氯气中毒后肺组织水肿、炎症反应明显,解氯乙醇酊可通过降低炎症因子、肺组织中的TBARs含量及上调脂氧素和血浆纤维结合蛋白水平等缓解氯气中毒导致的肺部炎症。

关键词：氯气中毒炎症反应解氯乙醇酊

噬菌体TM4诱导结核分枝杆菌休眠菌复苏作用的初步探索

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噬菌体TM4诱导结核分枝杆菌休眠菌复苏作用的初步探索

分枝杆菌噬菌体Chy3对人气道上皮细胞16HBE生长及功能的影响

中华医学会呼吸病学年会——2013（第十四次全国呼吸病学学术会议）

作者：甘易玲郭述良重庆医科大学附属第一医院呼吸内科

目的明确噬菌体TM4对结核分枝杆菌休眠菌的复苏作用。方法采用密闭培养对数生长期结核分枝杆菌1 35天构建结核分枝杆菌休眠菌模型;采用药敏检测、接种培养和电镜观察作为模型检测方法;采用菌落计数和电镜观察作为复苏的检测指标。结果培...

目的明确噬菌体TM4对结核分枝杆菌休眠菌的复苏作用。方法采用密闭培养对数生长期结核分枝杆菌1 35天构建结核分枝杆菌休眠菌模型;采用药敏检测、接种培养和电镜观察作为模型检测方法;采用菌落计数和电镜观察作为复苏的检测指标。结果培养3天复苏促进因子组可见管底白色菌量多于其余组;培养18天噬菌体TM4组管底白色菌量多余空白组;后续观察见TM4组及Rpf组管底菌量较前均有增加,培养上清液明显变黄,空白组与之前比较无明显变化:混合

关键词：

来源： cnki会议评论

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重庆医科大学学报 2014年第9期39卷 1202-1206页

作者：熊欣甘易玲徐莉江莉莎张莉郭述良重庆医科大学附属第一医院呼吸内科重庆400016

目的:探讨不同滴度的分枝杆菌噬菌体Chy3对人气道上皮细胞16HBE生长及功能的影响。方法:不同滴度噬菌体Chy3作用于人气道上皮细胞后,采用倒置显微镜观察细胞生长形态变化,CCK-8法检测细胞存活率,流式细胞仪检测细胞凋亡率,ELISA法检测... 详细信息

目的:探讨不同滴度的分枝杆菌噬菌体Chy3对人气道上皮细胞16HBE生长及功能的影响。方法:不同滴度噬菌体Chy3作用于人气道上皮细胞后,采用倒置显微镜观察细胞生长形态变化,CCK-8法检测细胞存活率,流式细胞仪检测细胞凋亡率,ELISA法检测细胞上清液中细胞因子分泌水平,RT-PCR和Western blot分别检测上皮细胞黏蛋白MUC5AC mRNA和蛋白表达水平。结果:不同滴度噬菌体Chy3作用于人气道上皮细胞一段时候后,细胞的生长形态、存活率、凋亡率、细胞因子分泌水平以及黏蛋白MUC5AC表达与正常组比较差异均无统计学意义(P>0.05)。结论:分枝杆菌噬菌体Chy3无论高低滴度对体外培养人气道上皮细胞生长和功能均无明显影响,有较好的安全性。

关键词：分枝杆菌噬菌体人气道上皮细胞安全性白细胞介素-6/白细胞介素-8 MUC5AC

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潜伏结核菌感染诊疗进展及评价

国际呼吸杂志 2014年第4期34卷 294-298页

作者：甘易玲郭述良重庆医科大学附属第一医院呼吸内科 400016

目前全球结核病疫情严峻，约1／3的人口存在潜伏结核菌感染。传统诊疗方法对潜伏结核菌感染效果不理想。结核菌素皮肤试验一直是临床诊断潜伏结核菌感染的唯一方法，而国内外研究发现7干扰素释放试验不仅能够诊断潜伏结核菌感染，尤其... 详细信息

目前全球结核病疫情严峻，约1／3的人口存在潜伏结核菌感染。传统诊疗方法对潜伏结核菌感染效果不理想。结核菌素皮肤试验一直是临床诊断潜伏结核菌感染的唯一方法，而国内外研究发现7干扰素释放试验不仅能够诊断潜伏结核菌感染，尤其在诊断特殊人群的潜伏结核菌感染时更有优势。临床一直是以抗结核治疗6～9个月来彻底杀灭结核菌，但时间长。而短时间集中促使结核休眠菌复苏再给予传统抗结核药物治疗，时间短，能够规范用药，因此这将成为未来治疗潜伏结核菌感染的主要方法。

关键词：潜伏结核菌感染诊断治疗

慢性阻塞性肺疾病患者自我管理量表的编制策略及条目筛选

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世界最新医学信息文摘 2017年第64期 180-180页

作者：夏薇徐红英甘易玲朱佑明重庆市第六人民医院

目的为了探索适合以疗效评价的方法,建立起慢性阻塞性肺疾病的疗效指标评价体系,形成对该病统一的疗效评价标准。方法采用理论与经验相结合的方法。理论依据:采用社会认知论、自我效能理论、我自我决定理论等作为编制量表的基本依据。... 详细信息

目的为了探索适合以疗效评价的方法,建立起慢性阻塞性肺疾病的疗效指标评价体系,形成对该病统一的疗效评价标准。方法采用理论与经验相结合的方法。理论依据:采用社会认知论、自我效能理论、我自我决定理论等作为编制量表的基本依据。结果研制出症状的管理和日常生活管理、情绪管理信息管理、自我管理五个维度的管理量表。结论患者的自我管理是可靠的、有效的和灵敏的,慢性阻塞性肺疾病患者的自我管理水平评价有着很高的作用。

关键词：慢性阻塞性肺疾病慢性阻塞性肺疾病患者自我管理医疗

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民间文学艺术表达专有权的构建

法律科学(西北政法大学学报) 2024年 23-35页

作者：易玲中南大学法学院中南大学中国文化法研究中心

伴随着全球化的深入推进,民间文学艺术保护日益重要,加快推进我国民间文学艺术保护立法迫在眉睫。从价值基础的一致性、理论依据的贯通性与实践要求的符合性三个方面来看,构建民间文学艺术表达专有权不失为一条切实可行的路径。民间文... 详细信息

伴随着全球化的深入推进,民间文学艺术保护日益重要,加快推进我国民间文学艺术保护立法迫在眉睫。从价值基础的一致性、理论依据的贯通性与实践要求的符合性三个方面来看,构建民间文学艺术表达专有权不失为一条切实可行的路径。民间文学艺术的开发和利用应符合来源群体特定的传统与习惯,在遵循来源群体知情同意原则的同时,应保障来源群体对他人利用民间文学艺术表达获得的惠益。在此基础上,创设以民间文学艺术表达来源群体为权利主体,经审查认定的民间文学艺术表达为权利客体的精神权利、以事先知情同意和事后开发利益分享为内容的经济权利,但应对上述权利做合理限制。应根据民间文学艺术的特点,确定适当的保护期限和救济规则。

关键词：民间文学艺术表达专有权权利构建知情同意惠益分享