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变异猪流行性腹泻病毒M和N融合双基因的原核表达及表达产物免疫原性分析

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畜牧兽医学报 2018年第6期49卷 1249-1255页

作者：王隆柏王晨燕吴学敏陈秋勇车勇良陈如敬周伦江福建省农业科学院畜牧兽医研究所/福建省畜禽疫病防治工程技术研究中心福州350013

旨在构建变异猪流行性腹泻病毒(PEDV)的M和N双基因融合质粒,并分析表达蛋白免疫原性。通过扩增变异PEDV FJFQ2014毒株(GenBank登陆号KJ646580)的M基因和N基因,将M基因克隆至pEASY-Blunt E2(pE2)表达载体,构建出pE2-M质粒。利用同源重组... 详细信息

旨在构建变异猪流行性腹泻病毒(PEDV)的M和N双基因融合质粒,并分析表达蛋白免疫原性。通过扩增变异PEDV FJFQ2014毒株(GenBank登陆号KJ646580)的M基因和N基因,将M基因克隆至pEASY-Blunt E2(pE2)表达载体,构建出pE2-M质粒。利用同源重组原理,采用无缝拼接试剂盒将N基因克隆至E2-M片段,转化到Trans 1-T1感受态细胞中,构建出pE2-M-N融合双基因质粒并转化Transetta(DE3),表达出相应的融合蛋白,采用SDS-PAGE和Western blot验证蛋白的表达情况。将纯化的M-N融合蛋白皮下接种BLAB/c小鼠,通过ELISA方法检测融合蛋白的免疫原性。结果表明:扩增出M和N基因,成功构建了pE2-M质粒,并将E2-M基因与N基因进行有效连接,构建出pE2-M-N融合双基因质粒,表达出了具有免疫原性的M-N融合蛋白,该蛋白能够诱导小鼠产生相应的特异性抗体。变异PEDV的pE2-M-N双基因融合质粒的构建,为进一步开展变异PEDV的诊断技术和免疫学等研究,奠定良好基础。

关键词：猪流行性腹泻病毒 PEDV M基因 N基因双基因表达

变异猪流行性腹泻病毒(PEDV)S和N融合双基因质粒的构建及鉴定

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中国兽医学报 2018年第12期38卷 2241-2246页

作者：王隆柏王晨燕吴学敏陈秋勇车勇良周伦江福建省农业科学院畜牧兽医研究所福建省畜禽疫病防治工程技术研究中心

为构建变异猪流行性腹泻病毒(PEDV)的S和N融合双基因质粒并表达出相应的蛋白,通过扩增变异PEDV的S和N基因,将S基因连接到pEAS-Blunt M2(M2)真核表达载体,构建M2-S质粒,通过同源重组原理,采用无缝拼接试剂盒将N基因克隆至M2-S基因片段,... 详细信息

为构建变异猪流行性腹泻病毒(PEDV)的S和N融合双基因质粒并表达出相应的蛋白,通过扩增变异PEDV的S和N基因,将S基因连接到pEAS-Blunt M2(M2)真核表达载体,构建M2-S质粒,通过同源重组原理,采用无缝拼接试剂盒将N基因克隆至M2-S基因片段,再转化到Trans1-T1感受态细胞中,构建M2-S-N融合双基因质粒。将M2-S-N融合双基因质粒转染到293T细胞,可表达出相应的S-N融合双基因蛋白。利用RT-PCR、Western blot技术和免疫BLAB/c鼠试验鉴定载体及蛋白表达的免疫活性,结果成功构建了M2-S-N融合双基因质粒,并表达出具有免疫原性的S-N融合双基因蛋白,且该蛋白能够诱导小鼠产生特异性抗体。变异PEDV的S和N基因融合双基因质粒的构建,为进一步开展变异PEDV的诊断技术及基因工程疫苗等研究奠定良好基础。

关键词：猪流行性腹泻病毒(PEDV) S基因 N基因 M2-S-N融合双基因

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母猪胎次对猪瘟抗体水平的影响

福建畜牧兽医 2011年第3期33卷 77-79页

作者：陈荣杰修金生陈如敬王隆柏曾新斌陈小权福州穗丰牧业科技开发有限公司福州350003 福建农林大学动物科学学院福州350001 福建省农业科学院畜牧兽医研究所福州350013

采用HerdChek猪瘟抗体检测试剂盒对福建省一个大型规模化猪场的全部种用母猪1290份血清检测进行猪瘟抗体的检测,评价不同母猪胎次对种猪群猪瘟抗体合格率的影响。结果显示:该场猪瘟抗体阳性(合格)的种猪有980头,合格率为75.97%,并统计... 详细信息

采用HerdChek猪瘟抗体检测试剂盒对福建省一个大型规模化猪场的全部种用母猪1290份血清检测进行猪瘟抗体的检测,评价不同母猪胎次对种猪群猪瘟抗体合格率的影响。结果显示:该场猪瘟抗体阳性(合格)的种猪有980头,合格率为75.97%,并统计母猪胎次对猪瘟抗体合格率的影响,结果发现后备母猪(P=0)和青年母猪(P=1,2,3)合格率最高,均超过80%;中年母猪(P=4,5,6)的合格率分别为67.35%、64.22%和69.47%;老龄母猪(P≥7)的合格率最低。随后对347头猪瘟抗体不合格种猪进行加强免疫后测定猪瘟抗体,其中合格种猪129头,以后备母猪合格率最高,为73.81%;并且随着胎次的增加,猪瘟抗体合格率呈下降趋势而变异系数。结果表明:母猪胎次对猪场猪瘟抗体合格率具有重要的影响,及时淘汰生产繁殖性能差的老龄母猪有助于提高规模化猪场猪群的猪瘟抗体水平和生产水平。

关键词：猪瘟抗体后备母猪胎次

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一例紫色色杆菌感染小熊猫的诊治报告

福建畜牧兽医 2020年第6期42卷 85-86页

作者：修云芳徐素慧王隆柏罗伟铭何晓聪周伦江曾显成海峡(福州)大熊猫研究交流中心福州350003 福建省农业科学院畜牧兽医研究所福州350013 福建农林大学动物科学学院(蜂学学院) 福州350002

自2020年7月9日以来,福州大熊猫研究中心发现饲养的20只小熊猫群体中,陆续有6只出现精神萎顿、食欲减退或废绝、部分卧地不起、体温升高、呼吸困难及死亡等为主要临床特征的疫病。根据发病情况、临床症状、病理变化及实验室检测,确诊为... 详细信息

自2020年7月9日以来,福州大熊猫研究中心发现饲养的20只小熊猫群体中,陆续有6只出现精神萎顿、食欲减退或废绝、部分卧地不起、体温升高、呼吸困难及死亡等为主要临床特征的疫病。根据发病情况、临床症状、病理变化及实验室检测,确诊为紫色色杆菌感染。根据药敏试验结果,采取相应紧急防控措施,疫情最终获得有效控制。

关键词：紫色色杆菌小熊猫诊治

O_(78)血清型大肠杆菌对蛋鸡的致病性及丙/丁酸单甘油酯的保护效果

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福建农业学报 2019年第2期34卷 209-213页

作者：刘玉涛凌清标黄宝钦吴学敏王隆柏周伦江福建省农业科学院畜牧兽医研究所福建福州350013 福建省莆田市秀屿区笏石畜牧兽医站福建莆田351146 福建圣农发展股份有限公司福建南平354100

【目的】研究O_(78)血清型大肠杆菌对蛋鸡的致病性,以及单甘油酯对蛋鸡O_(78)血清型大肠杆菌不同致病方式的保护效果,为绿色无抗养鸡提供理论支撑和实践经验。【方法】对福建省某鸡场分离的血清型O_(78)禽源致病性大肠杆菌(APEC),采用... 详细信息

【目的】研究O_(78)血清型大肠杆菌对蛋鸡的致病性,以及单甘油酯对蛋鸡O_(78)血清型大肠杆菌不同致病方式的保护效果,为绿色无抗养鸡提供理论支撑和实践经验。【方法】对福建省某鸡场分离的血清型O_(78)禽源致病性大肠杆菌(APEC),采用口服、颈部皮下和气管内壁接种不同日龄的试验鸡,评价菌株的致病性,建立攻毒模型,然后评估以丙酸单甘油酯、丁酸单甘油酯为主要成分的水溶性液态添加物FraC34对鸡大肠杆菌病的保护效果。【结果】(1)12日龄海兰蛋鸡雄雏口服接种细菌3.0×10~9CFU·羽^(-1),可造成100%发病;但22日龄海兰蛋鸡雄雏分别口服接种细菌3.0×10~9CFU·羽^(-1)和6.0×10~9CFU·羽^(-1)时不发病。12日龄海兰蛋鸡雄雏颈部皮下接种细菌0.4×10~9CFU·羽^(-1),可造成70%的试验鸡发病,22日龄海兰蛋鸡雄雏气管内壁接种细菌1.5×10~9CFU·羽^(-1),可造成25%鸡只发病;(2)在饮水中添加FraC34,早期可改善鸡肠道健康,降低肠道对APEC的易感性,在饮水中添加2～3 L·m^(-3)的FraC34,能够显著降低经由口服途径感染APEC造成的发病率和死亡率,还能够降低经气管内壁接种APEC所造成的死亡率,并且显著降低发病率;当饮水添加3 L·m^(-3)时,可以维持感染鸡的日增重。【结论】鸡O_(78)血清型的APEC对幼雏具有极大的危害性,造成严重经济损失,而中大雏对该菌株具有一定的耐受性;养殖环节添加FraC34,对于鸡感染APEC具有一定的保护作用,并且可以维持鸡的生产性能,可替代部分抗生素的使用,达到较为理想的保护效果。

关键词：禽致病性大肠杆菌丙/丁酸单甘油酯海兰蛋鸡保护效果

福建省部分地区规模化猪场伪狂犬病感染情况调查

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养猪 2010年第1期 38-40页

作者：陈如敬王隆柏魏宏车勇良庄向生周伦江福建省农业科学院畜牧兽医研究所福建福州350013

为掌握现有防疫体系下福建省部分地区规模化猪场猪伪狂犬病野毒感染情况,采用HerdChek PRV gE-ELISA检测试剂盒对2009年10月送检的8个市40个规模化猪场1214份血清样品进行伪狂犬病野毒抗体检测。结果显示,伪狂犬病野毒抗体阳性猪场有25... 详细信息

为掌握现有防疫体系下福建省部分地区规模化猪场猪伪狂犬病野毒感染情况,采用HerdChek PRV gE-ELISA检测试剂盒对2009年10月送检的8个市40个规模化猪场1214份血清样品进行伪狂犬病野毒抗体检测。结果显示,伪狂犬病野毒抗体阳性猪场有25个,占检测猪场总数的62.5%;各猪场血清样品中伪狂犬病野毒抗体平均阳性率为23.56%;不同地区规模化猪场母猪群的伪狂犬病野毒抗体平均阳性率为22.46%,其中阳性率最高为55.83%;不同胎次母猪群的伪狂犬病野毒抗体阳性率差异不显著。本次调查结果表明,福建省不同地区规模化猪场均存在不同程度的伪狂犬病野毒感染,其中以莆田和南平地区较为严重。

关键词：猪伪狂犬病血清学调查 ELISA

猪伪狂犬病毒荧光重组酶介导核酸扩增快速检测方法的建立与应用

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福建农业学报 2024年第7期39卷 753-758页

作者：谢明杰康龙滨陈秋勇吴学敏王隆柏周伦江刘玉涛福建农林大学动物科学学院福建福州350002 福建省农业科学院畜牧兽医研究所/福建省畜禽疫病防治工程技术研究中心福建福州350013

【目的】基于荧光重组酶介导核酸扩增(Recombinase-aided amplification,RAA)技术,建立一种猪伪狂犬病毒(Porcine pseudorabies virus,PRV)快速检测方法。【方法】根据PRV gE基因序列,设计特异性引物及探针,优化扩增体系,建立PRV荧光重... 详细信息

【目的】基于荧光重组酶介导核酸扩增(Recombinase-aided amplification,RAA)技术,建立一种猪伪狂犬病毒(Porcine pseudorabies virus,PRV)快速检测方法。【方法】根据PRV gE基因序列,设计特异性引物及探针,优化扩增体系,建立PRV荧光重组酶介导核酸扩增检测方法,检验其特异性、敏感性和重复性,应用该方法对临床样品进行检测。【结果】该方法在43℃恒温反应23 min即可完成PRV核酸扩增,最低检出限为111 copies·μL^(-1);与猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)、猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemicdiarrheavirus,PEDV)、猪轮状病毒(Porcinerotavirus,PoRV)、猪传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus,TGEV)、猪圆环病毒2型(Porcine circovirus 2,PCV2)、猪圆环病毒3型(Porcine circovirus 3,PCV3)均无交叉反应。重复性试验显示,组内和组间变异系数均小于5%;40份临床样品检测结果显示PRV阳性率为15%(6/40),检测结果与常规聚合酶链式反应(PCR)一致。【结论】成功建立了简便快速、高效准确的PRV实时荧光RAA检测方法,为PRV的快速检测和流行病学调查提供了新的检测手段。

关键词：猪伪狂犬病毒荧光重组酶介导核酸扩增检测方法

用RT-PCR方法检测猪瘟与猪蓝耳病混合感染

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福建畜牧兽医 2012年第1期34卷 7-9页

作者：王隆柏周伦江修金生吴学敏陈如敬严山福建省农业科学院畜牧兽医研究所福建省畜禽疫病防治工程技术研究中心福州350013 福建农林大学动物科学学院福州350002

福建省某规模化猪场暴发一种以保育猪精神沉郁、体温升高、腹泻、消瘦等为主要特征的传染性疾病。利用RT-PCR和PCR分别对采集的病料进行猪瘟病毒、猪蓝耳病病毒、猪伪狂犬病毒、猪圆环病毒和猪细小病毒检测,结果猪瘟病毒和猪蓝耳病病毒... 详细信息

福建省某规模化猪场暴发一种以保育猪精神沉郁、体温升高、腹泻、消瘦等为主要特征的传染性疾病。利用RT-PCR和PCR分别对采集的病料进行猪瘟病毒、猪蓝耳病病毒、猪伪狂犬病毒、猪圆环病毒和猪细小病毒检测,结果猪瘟病毒和猪蓝耳病病毒为阳性,其他病毒均为阴性。对病料进行细菌分离鉴定,结果为阴性。根据诊断结果紧急接种疫苗,提高疫病综合防控等措施,疫情最终得到有效控制。

关键词： RT—PCR 猪瘟猪蓝耳病混合感染

PRV FB株gE/gI基因缺失株的构建及其灭活疫苗免疫保护效力评价

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中国预防兽医学报 2021年第9期43卷 965-971页

作者：侯博王晨燕彭瑶舜戢婷刘玉涛王隆柏陈少莺周伦江福建省农业科学院畜牧兽医研究所/福建省畜禽疫病防治工程技术研究中心福建福州350013

自2011年以来,新型伪狂犬病病毒(PRV)变异株在我国免疫猪场不断出现,导致目前商品化疫苗免疫效果不佳。为研究PRV FB株gE/gI基因缺失株疫苗防控新型PRV变异株感染的效果,本研究以PRV自然弱毒FB株作为亲本株,通过同源重组的方法构建了PRV... 详细信息

自2011年以来,新型伪狂犬病病毒(PRV)变异株在我国免疫猪场不断出现,导致目前商品化疫苗免疫效果不佳。为研究PRV FB株gE/gI基因缺失株疫苗防控新型PRV变异株感染的效果,本研究以PRV自然弱毒FB株作为亲本株,通过同源重组的方法构建了PRV g E/gI基因缺失株,将不同代次PRV FBΔgE/gI株与亲本PRV FB株分别接种BHK-21细胞,观察CPE和测定TCID50效价,分析缺失株的遗传稳定性,结果显示FBΔgE/gI株感染BHK-21细胞后产生与亲本株FB相似的CPE,且不同代FBΔgE/gI株的TCID50与亲本株相比均无明显变化。将FB株、FBΔgE/gI株、Bartha-K61株分别接种健康新西兰兔,比较三者的安全性,结果显示,接种BarthaK61株的家兔全部死亡(5/5),接种FB株的家兔死亡2只(2/5),而接种FBΔgE/gI株的家兔全部(5/5)健活,表明FBΔgE/gI株对新西兰兔的致病力较低,安全性更高。将FBΔgE/gI株分别与水相佐剂GEL02和两性佐剂ISA 206制成灭活疫苗免疫绵羊28 d后,采用ELISA法检测各组绵羊的gB和gE抗体,并且以PRV变异株FJ-2012攻毒,评估FBΔgE/gI株灭活疫苗对绵羊的保护效力,结果显示,接种GEL02和ISA 206为佐剂的FBΔgE/gI灭活疫苗绵羊在免疫后28 d,抗体均全部转阳;对照组绵羊在攻毒后6 d内全部死亡(5/5),以GEL02作为佐剂的灭活疫苗组绵羊死亡2只(2/5),而以ISA 206为佐剂的绵羊全部存活(5/5),保护率达到100%,表明以ISA 206作为佐剂的FBΔgE/gI株灭活疫苗能够完全保护绵羊抵御PRV变异株的攻击。本研究首次基于PRV自然弱毒FB株构建的FBΔgE/gI株,与Bartha-K61株相比具有更高的安全性,与佐剂ISA 206制成灭活疫苗免疫绵羊后能够完全抵抗新发变异PRV的攻击,具有完全保护作用。本研究为我国新发变异PRV疫苗的研发提供了新的参考依据。

关键词：伪狂犬病毒 gE/gI基因缺失有效性安全性灭活疫苗