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当归芍药散治疗原发性痛经的效应物质基础研究

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当归芍药散治疗原发性痛经的效应物质基础研究

作者：王言才江苏大学

学位级别：硕士

原发性痛经为妇科常见疾病,临床常采用NASIDS、口服避孕药、Ca拮抗剂等治疗,由于存在对消化道、心脏或肝肾等不良反应而限制了临床应用。当归芍药散系张仲景《金匮要略》方,由当归、芍药、川芎、白术、茯苓、泽泻组成,主治妊娠“腹中疼... 详细信息

原发性痛经为妇科常见疾病,临床常采用NASIDS、口服避孕药、Ca拮抗剂等治疗,由于存在对消化道、心脏或肝肾等不良反应而限制了临床应用。当归芍药散系张仲景《金匮要略》方,由当归、芍药、川芎、白术、茯苓、泽泻组成,主治妊娠“腹中疼痛”,以及妇人杂病“腹中诸疾痛”,后世医家常用本方治疗妇科疾病。本文在前期建立了原发性痛经器官模型的工作基础上,遵循方剂配伍与方病结合原则,采用多效应评价平台和活性追踪与化学分离分析紧密结合的思路,对当归芍药散治疗原发性痛经的效应物质基础进行研究。本论文工作主要包括三部分: 一、样品制备方法研究和样品制备: 全方水提取物和50%乙醇提取物经小鼠离体子宫原发性痛经模型效应评价和化学成分分析,结果显示,当归芍药散治疗原发性痛经的主要效应物质可能为醇溶性成分,仅采用水提取均有可能遗漏部分效应成分。基于此研究结果,我们制定了水提醇沉、残渣醇提、大孔吸附树脂吸附洗脱分离和溶剂萃取结合的样品制备方法,将全方系统分为21个部位,为进一步的系统生物效应评价和化学成分分析奠定基础。二、当归芍药散治疗原发性痛经效应评价平台的建立和各分离部位的效应评价: ①建立小鼠离体子宫原发性痛经模型:催产素诱发离体子宫强烈收缩,模拟痛经时子宫的痉挛状态,用于当归芍药散治疗原发性痛经效应部位的筛选;②建立环氧化酶-Ⅱ抑制剂筛选平台:比较ELISA、放免法、荧光活性法、比色法等检测NIH3T3细胞株、RAW264.7细胞株、大鼠腹腔巨噬细胞中PGE的含量或环氧化酶-Ⅱ的活性时方法的优点,以比色法最为简便、快捷、高效,适合环氧化酶-Ⅱ抑制剂的高通量筛选和当归芍药散效应物质基础研究。③当归芍药散对大鼠腹腔巨噬细胞NO产量的调控:选择与原发性痛经和炎症的发生、体内PGs的产生等高度生物相关NO为对象,Griess法检测含量,研究当归芍药散对其NO产量的调控。上述三个生物效应评价方法结果可靠、稳定,且后两个具备高通量优势,适合作为当归芍药散治疗原发性痛经效应物质基础的筛选评价平台。对所分离得到的各化学物质部位的生物效应进行评价,结果发现主要有效部位为:当归芍药散挥发油部位(DSS-1)、大孔吸附树脂30%、40%、50%、70%乙醇洗脱部位(DSS-10、DSS-11、DSS-12、DSS-14)和水提残渣90%乙醇提取石油醚萃取部位(DSS-18)。三、当归芍药散治疗原发性痛经效应物质部位的成分分析: 采用HPLC-DAD-ESI-MS、GC-MS、对照品对照等方法并结合文献,对当归芍药散效应部位进行成分分析。结果表明,当归芍药散挥发油(DSS-1)主要化学成分为桉叶烯、古香油烯、大根香叶烯、匙叶桉油烯醇、苍术酮、丁烯基苯酞内酯、Z-藁本内酯、新蛇床内酯、川芎内酯A,且以藁本内酯(42.75%)的含量最大。大孔吸附树脂吸附30%、40%乙醇洗脱(DSS-10,DSS-11)主要化学成分为芍药内酯苷和芍药苷,50%乙醇洗脱(DSS-12)主要化学成分为阿魏酸,70%乙醇洗脱(DSS-14)和水提残渣90%乙醇提取石油醚萃取部位(DSS-18)中白术内酯-Ⅰ、白术内酯-Ⅱ、白术内酯-Ⅲ含量占较大比例。上述化学成分在当归芍药散治疗原发性痛经效应评价平台中效应显著,为阐明其作用机理和相互影响,对效应部位有待进一步分离分析和定量研究,对所得化合物进行效应研究,最终为揭示配伍规律和应用开发研究奠定基础,并为方剂研究思路提供参考。本文创新点①研究思路:遵循“方剂配伍与方病结合”,采用“化学分离分析与多指标效应评价结合”,准确地发现效应物质;②研究模式:本论文建立的三个效应评价平台除对当归芍药散进行了效应评价,还对本课题组内另外6个复方进行了活性筛选和效应评价,有利于效率提高和资源节约,有利于各复方间的横向比较和配伍规律的阐明。

关键词：当归芍药散原发性痛经效应物质基础环氧化酶-II抑制剂

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小鼠离体子宫收缩模型定量药理学研究

中国药理学通报 2009年第11期25卷 1527-1530页

作者：华永庆段金廒王言才范麒如张燕朱荃南京中医药大学科技部规范化中药药理实验室江苏南京210029 南京中医药大学江苏省方剂研究重点实验室江苏南京210046

目的该文探索建立了小鼠离体子宫收缩模型,以此为对象,对药物效应定量方法进行了评价研究,并与大鼠模型进行了比较。方法缩宫素诱导离体子宫收缩,观察10-8.5～10-5mol·L-1浓度范围内维拉帕米对子宫收缩的抑制作用,采用两次归一化的方... 详细信息

目的该文探索建立了小鼠离体子宫收缩模型,以此为对象,对药物效应定量方法进行了评价研究,并与大鼠模型进行了比较。方法缩宫素诱导离体子宫收缩,观察10-8.5～10-5mol·L-1浓度范围内维拉帕米对子宫收缩的抑制作用,采用两次归一化的方法对数据进行处理,计算各浓度的抑制率,并根据实验结果计算药物的ED50,以上述方法观察维拉帕米对大鼠及小鼠离体子宫的不同作用。结果随着维拉帕米浓度增加,其对离体子宫收缩抑制作用不断增强,在10-5mol·L-1浓度下子宫收缩被完全抑制。两次归一化的方法对结果进行计算后,得到维拉帕米对大鼠及小鼠离体子宫收缩抑制作用的ED50分别为10-7.24(10-7.46～10-7.04)mol·L-1及10-7.58(10-7.78～10-7.38)mol·L-1。结论采用本方法进行实验及数据处理,可以较好的排除多种因素的干扰,从而对药物效应的强弱进行量化。经工具药物进行验证,认为该方法灵敏、可靠、经济,可以用于离体子宫活性药物的评价。

关键词：小鼠离体子宫缩宫素定量药理累加给药实验方法

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姜黄素纳米混悬液的抗癌活性及细胞摄取研究

中药新药与临床药理 2013年第4期24卷 416-420页

作者：毕超王言才陈修平郑颖澳门大学中华医药研究院中药质量研究国家重点实验室中国澳门999078

目的制备姜黄素纳米混悬液(CUR-NS)并进行体外抗癌活性及细胞摄取研究。方法采用反溶剂沉淀法制备CUR-NS。用粒度分析仪测定其粒径大小,同时用原子力显微镜进行形态学考察。采用MTT法检测姜黄素原药和CUR-NS对肿瘤细胞MCF-7的增殖抑制... 详细信息

目的制备姜黄素纳米混悬液(CUR-NS)并进行体外抗癌活性及细胞摄取研究。方法采用反溶剂沉淀法制备CUR-NS。用粒度分析仪测定其粒径大小,同时用原子力显微镜进行形态学考察。采用MTT法检测姜黄素原药和CUR-NS对肿瘤细胞MCF-7的增殖抑制作用。同时,运用高效液相色谱法对药物细胞摄取进行定量研究。结果 CUR-NS的平均粒径为(69.65±0.50)nm,多分散系数为0.34±0.03,zeta电位为(-8.67±0.26)mV。原子力显微镜下观察发现,CUR-NS中粒子基本呈球形,粒径与粒度分析仪所测结果基本相符,且分散性良好,无聚合粘连。短期物理稳定性研究表明,CUR-NS在4℃下避光保存1个月后,粒径大小和分布基本保持稳定。MTT细胞毒性实验表明,24 h内姜黄素原药和CUR-NS的半数抑制浓度(IC50)分别为(44.09±0.93)μmol.L-1和(36.23±0.58)μmol.L-1,CUR-NS对肿瘤细胞MCF-7增殖的抑制作用明显强于姜黄素原药。定量摄取研究发现将姜黄素制成纳米混悬液,可在一定程度上改善其化学稳定性,增加肿瘤细胞对药物的摄取。结论纳米混悬技术是改善姜黄素类难溶性及化学不稳定药物的理化及生物活性的有效制剂方法。

关键词：姜黄素纳米混悬液抗癌细胞摄取高效液相色谱法

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不同品种葛根中葛根素及总黄酮的含量测定

时珍国医国药 2008年第1期19卷 132-133页

作者：王言才段金廒华永庆宿树兰南京中医药大学江苏省方剂研究重点实验室

目的建立不同品种葛根中葛根素及总黄酮的含量测定方法。方法采用RP—HPLC法，以甲醇-水（32：68）为流动相，检测波长为250nm测葛根素含量；紫外分光光度法测柴葛、粉葛中总黄酮含量。结果葛根素峰分离度提高，峰形改善；葛根素0．204... 详细信息

目的建立不同品种葛根中葛根素及总黄酮的含量测定方法。方法采用RP—HPLC法，以甲醇-水（32：68）为流动相，检测波长为250nm测葛根素含量；紫外分光光度法测柴葛、粉葛中总黄酮含量。结果葛根素峰分离度提高，峰形改善；葛根素0．204—2．04μg范围内与峰面积线性关系良好（r=0．9999），回收率为98．7％（n=5），精密度RSD=0．86％。总黄酮浓度在4．08—16．32μg／ml范围内与吸收度线性关系良好（r=0．9998）。结论该法灵敏、准确、简便易行，重复性好，可用于中药葛根药材及饮片的质量控制。

关键词：柴葛粉葛葛根素总黄酮高效液相色谱

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LC/MS法测定犬血浆中的水飞蓟宾浓度

中国药理学通报 2010年第5期26卷 679-683页

作者：王言才刘兆平张典瑞许家星段存贤王飞虎张强山东大学药学院山东大学新药评价中心山东济南250012 北京大学药学院北京100083

目的建立犬血浆中水飞蓟宾浓度的LC-MS测定方法。方法取犬血浆400μl,加200μl磷酸氢二钠(0.1mol.L-1)和50μl内标萘酚(10mg·mL-1),3ml乙醚萃取后取上清液挥干,100μl甲醇复溶,离心并取10μl进行LC-MS测定。色谱条件:色谱柱为ODS-C18柱... 详细信息

目的建立犬血浆中水飞蓟宾浓度的LC-MS测定方法。方法取犬血浆400μl,加200μl磷酸氢二钠(0.1mol.L-1)和50μl内标萘酚(10mg·mL-1),3ml乙醚萃取后取上清液挥干,100μl甲醇复溶,离心并取10μl进行LC-MS测定。色谱条件:色谱柱为ODS-C18柱(2.1mm×150mm,5μm,Phenomenex,USA),流动相为甲醇:2%乙酸水=55∶45,流速为***-1;质谱条件:电喷雾离子化(ESI)方式,以选择性负离子方式检测,水飞蓟宾和内标萘酚的选择检测离子质荷比分别为m/z481.00([M-H]-)和m/z142.92([M-H]-)。结果水飞蓟宾的线性范围为25～8000μg.L-1,定量下限(LOQ)为25μg.L-1。准确度、精密度及回收率均符合有关要求。结论本方法专属性强,检测限低,灵敏度高,线性关系良好,方法简便快捷、经济,适用于水飞蓟宾药代及毒代动力学研究。

关键词：水飞蓟宾液相色谱-质谱联用血浆药物浓度葡糖醛酸糖苷酶 Beagle犬药代动力学

当归芍药散抑制小鼠离体子宫收缩效应与效应物质分析评价

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中国天然药物 2008年第3期6卷 196-200页

作者：王言才段金廒华永庆宿树兰鲍邢杰江苏大学药学院镇江212013 南京中医药大学江苏省方剂研究重点实验室南京210046

目的:探讨当归芍药散水提取物和50%乙醇提取物对小鼠离体子宫收缩效应及效应物质的异同。方法:采用小鼠离体子宫平滑肌收缩模型评价两种提取物的效应差异;采用HPLC-TOF/MS及对照品对照,分析了不同提取方法样品中化学成分组成的异同。结... 详细信息

目的:探讨当归芍药散水提取物和50%乙醇提取物对小鼠离体子宫收缩效应及效应物质的异同。方法:采用小鼠离体子宫平滑肌收缩模型评价两种提取物的效应差异;采用HPLC-TOF/MS及对照品对照,分析了不同提取方法样品中化学成分组成的异同。结果:水提物对小鼠离体子宫收缩频率、收缩幅度和平均肌张力抑制效应均不及50%乙醇提取物;水提物中化学信号不及50%乙醇提物中化学信号丰富;从水提取物和50%乙醇提取物中分析鉴定了14个化合物。结论:当归芍药散不同溶剂提取物在小鼠离体子宫收缩效应和化学成分上存在较大差异,为当归芍药散的制备方式和效应物质基础的阐明提供了依据。

关键词：当归芍药散生物效应效应成分分析

当归-川芎挥发性成分与其抗子宫痉挛活性相关性分析

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中国实验方剂学杂志 2009年第2期15卷 64-67页

作者：宿树兰华永庆段金廒王言才鲍邢杰唐于平南京中医药大学江苏省方剂研究重点实验室江苏南京210046 江苏大学药学院江苏镇江212013

目的:评价当归-川芎不同配比药对挥发性成分与其抑制小鼠离体子宫平滑肌收缩效应的相关性。方法:采用小鼠离体子宫收缩模型评价当归-川芎不同配比药对挥发性成分的生物效应,采用气相色谱-质谱(GC-MS)联用技术对挥发性成分进行分析鉴定,... 详细信息

目的:评价当归-川芎不同配比药对挥发性成分与其抑制小鼠离体子宫平滑肌收缩效应的相关性。方法:采用小鼠离体子宫收缩模型评价当归-川芎不同配比药对挥发性成分的生物效应,采用气相色谱-质谱(GC-MS)联用技术对挥发性成分进行分析鉴定,探讨两者的相关性。结果:离体子宫平滑肌收缩试验表明不同配比当归-川芎药对挥发油对小鼠离体子宫收缩效应强弱依次为:当归-川芎(2∶1)>当归-川芎(3∶1)>当归-川芎(1∶1)>当归-川芎(3∶2);GC-MS分析结果表明对离体子宫收缩效应最佳的当归-川芎(2∶1)药对挥发油中主要成分的比例关系为:(Z)-ligustilide:(Z)-3-butylidene phthalide:4,5-dihydro-3-butyl-phathalide:(E)-ligustilide:Unknown compound:8,9-dehydro-Cycloisolongifolene:Neocnidilide:(E)-3-butylidene phthalide(80.75∶4.02∶2.07∶1.66∶0.81∶0.61∶0.53∶0.52)。结论:不同配比当归、川芎药对挥发性成分抑制离体子宫平滑肌收缩效应强度不同,可能是由于挥发油中各组成成分比例不同引起;挥发油中以内酯类成分为主,提示该类成分可能为抑制子宫收缩的主要活性成分。

关键词：当归-川芎药对挥发性成分气相色谱-质谱子宫平滑肌收缩

当归-川芎挥发性成分与其抗子宫痉挛活性相关性分析

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当归-川芎挥发性成分与其抗子宫痉挛活性相关性分析

冬凌草甲素纳米结晶黏附性缓释片的制备及体外评价

中华中医药学会中药分析分会第三届学术交流会

作者：宿树兰华永庆段金廒王言才鲍邢杰唐于平南京中医药大学江苏省方剂研究重点实验室江苏大学药学院

目的:评价当归-川芎不同配比药对挥发性成分与其抑制小鼠离体子宫平滑肌收缩效应的相关性。方法:采用小鼠离体子宫收缩模型评价当归-川芎不同配比药对挥发性成分的生物效应,采用气相色谱-质谱(GC-MS)联用技术对挥发性成分进行分析鉴定,探讨两者的相关性。结果:离体子宫平滑肌收缩试验表明不同配比当归—川芎药对挥发油对小鼠离体子宫收缩效应强弱依次为:当归-川芎(2:1)>当归-川芎(3:1)>当归-川芎(1:1)>当归-川芎(3:2);GC-MS分析结果表明对离体子宫收缩效应最佳的当归-川芎(2:1)药对挥发油中主要成分的比例关系为:(Z)-ligustilide:(Z)-3-butylidene phthalide:4,5-dihydro-3-butylphathalide:(E)-ligustilide:Unknown compound:8,9-dehydro-Cycloisolongifolene:Neocnidilide:(E)-3-butylidene phthalide(80.75:4.02:2.07:1.66:0.81:0.61:0.53:0.52)。结论:不同配比当归、川芎药对挥发性成分抑制离体子宫平滑肌收缩效应强度不同,可能是由于挥发油中各组成成分比例不同引起;挥发油中以内酯类成分为主,提示该类成分可能为抑制子宫收缩的主要活性成分。

关键词：当归-川芎药对挥发性成分气相色谱-质谱子宫平滑肌收缩

来源： cnki会议评论

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中国生化药物杂志 2009年第3期30卷 145-149页

作者：段存贤张典瑞代文婷贾乐娇王言才山东大学药学院药剂教研室山东济南250012

目的制备冬凌草甲素纳米结晶黏附片,考察其体外释放性、黏附性和结晶药物形态。方法采用高压均质法将冬凌草甲素制成纳米结晶,以羟丙甲纤维素(HPMC)和卡波姆为生物黏附材料,甘露醇为稀释剂和支架剂制备冬凌草纳米结晶生物黏附性缓释片... 详细信息

目的制备冬凌草甲素纳米结晶黏附片,考察其体外释放性、黏附性和结晶药物形态。方法采用高压均质法将冬凌草甲素制成纳米结晶,以羟丙甲纤维素(HPMC)和卡波姆为生物黏附材料,甘露醇为稀释剂和支架剂制备冬凌草纳米结晶生物黏附性缓释片。采用紫外分光光度法测定冬凌草甲素的含量,采用正交设计结合多元线性回归,以累计释放率为主要考察指标,考察了HPMC、卡波姆、甘露醇的用量对药物溶出的影响,确定了片剂的优化处方,并对片剂的黏附性和体外药物释放做了考察。结果最佳处方含HPMC31.0%,卡波姆21.7%,甘露醇7.44%。片剂中药物以纳米结晶形式从片剂中溶出,而且具有黏附和缓释作用。结论以最佳制备工艺条件制备纳米结晶片,制备工艺简单,重现性好。同时体外实验表明,冬凌草甲素纳米结晶生物黏附性缓释片显示了纳米结晶与生物黏附的双重优点。

关键词：冬凌草甲素纳米结晶生物黏附缓释片