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作者：王臣荣河南农业大学

学位级别：硕士

隐孢子虫是重要的人兽共患原虫之一,也是导致儿童腹泻的第二大病原。目前,未见针对隐孢子虫病有效的药物及疫苗,唯一被FDA批准的硝唑尼特对隐孢子虫的效果也是有限的。miRNAs是一类内源性非编码小RNA分子,其通过调控基因的表达,进而影... 详细信息

隐孢子虫是重要的人兽共患原虫之一,也是导致儿童腹泻的第二大病原。目前,未见针对隐孢子虫病有效的药物及疫苗,唯一被FDA批准的硝唑尼特对隐孢子虫的效果也是有限的。miRNAs是一类内源性非编码小RNA分子,其通过调控基因的表达,进而影响机体许多生物学过程,如细胞的增殖、分化、凋亡以及生物体的发育等。研究表明,miRNAs可以调节超过60%的哺乳动物蛋白编码mRNAs,在调控隐孢子虫感染和宿主防御中发挥重要作用。TLRs(Toll-like receptor,TLRs)是一种常见的病原模式识别受体,其在病原体入侵细胞期间起着非常重要的作用。研究表明,宿主细胞TLRs在隐孢子虫的识别和宿主对隐孢子虫免疫应答方面起着重要作用。小肠作为微小隐孢子虫的主要寄生部位,然而关于微小隐孢子虫感染对肠道上皮细胞miRNAs和TLRs的影响尚未见报道。本研究旨在分析微小隐孢子虫Ⅱd亚型卵囊早期感染HCT-8细胞对细胞miRNAs和TLRs的影响。牛源微小隐孢子虫Ⅱd亚型卵囊分离纯化。本试验通过感染未食初乳荷斯坦奶牛,成功的对微小隐孢子虫Ⅱd亚型卵囊进行了体外传代,感染第三天,出现拉稀症状,并开始排微小隐孢子虫卵囊,感染后第五到九天为排卵囊高峰期,排卵囊期为十五天;利用改良饱和食盐水漂浮法(饱和食盐水漂浮法+氯化铯密度梯度离心法),成功分离纯化了牛源微小隐孢子虫Ⅱd亚型卵囊,最终得到了牛源微小隐孢子虫Ⅱd亚型高纯度的3.5×10个卵囊,其脱囊率为76%,可用于下一步细胞感染试验。微小隐孢子虫Ⅱd亚型卵囊早期感染对HCT-8细胞miRNAs的影响。本实验室利用miRNA芯片技术,分析微小隐孢子虫Ⅱd亚型卵囊早期感染(4 h和12 h)对HCT-8细胞miRNAs的影响,结果发现感染4 h共有7个表达差异显著miRNAs(1个显著上调和6个显著下调);感染12 h共有13个表达差异显著miRNAs(3个显著上调和10个显著下调)。挑选6个miRNA芯片分析表达差异显著的miRNAs:hsa-miR-122-5p(4 h显著上调)、hsa-miR-3591-3p(4 h显著下调)、hsa-miR-454-5p(4 h显著下调)、hsa-miR-5580-3p(12 h显著上调)、hsa-miR-181d-3p(12 h显著下调)和hsa-let-7b-3p(12 h显著下调),利用qPCR相对定量方法分析微小隐孢子虫Ⅱd亚型卵囊早期感染HCT-8细胞对上述6个miRNAs的影响。结果显示,qPCR技术相对定量方法与miRNA芯片技术分析的结果相吻合,证明miRNA芯片分析的结果可靠。miRNAs靶基因预测及GO分类和KEGG通路分析。利用Targetscan human7.1和miRDBR分别预测20个表达差异显著的miRNAs的靶基因,只有18个表达差异显著miRNAs能被TargetScanHuman7.1和miRDB进行靶基因预测并取交集,结果显示,表达差异显著miRNAs的靶基因数量从10个到1034不等。利用DAVID分析方法对靶基因进行注释,并用GO分类的方法对每个miRNA靶基因进行功能分析,发现表达差异显著miRNAs参与的生物学过程有调节转录过程、细胞黏附、调节细胞凋亡、参与炎症应答、天然免疫反应、适应性免疫反应、钙离子的平衡、钾离子的转运、调节蛋白磷酸化/去磷酸化、调节干扰素的合成和酪氨酸激酶跨膜蛋白信号通路等(P<0.05);细胞组成成分主要有细胞膜、顶端质膜、线粒体膜等(P<0.05);分子功能主要有蛋白质结合、ATP激活、RNA聚合酶Ⅱ转录因子激活、肿瘤坏死因子受体激活、蛋白运输、钙离子通道激活、丝氨酸激酶激活、蛋白酶K激活等(P<0.05),hsa-miR-34b-5p、hsa-miR-942-5p、hsa-miR-6721-5p、hsa-miR-3591-3p、hsa-miR-18b-3p、hsa-miR-3976和hsa-miR-3121-5p可以调节细胞凋亡过程,hsa-let-7b-3p、hsa-miR-3591-3p、hsa-miR-34b-5p、hsa-miR-6721-5p和hsa-miR-3121-5p可以调节小肠上皮细胞免疫反应。对表达差异显著的miRNAs进行KEGG通路分析,发现表达差异显著miRNAs可以调节与免疫相关的肿瘤坏死因子信号通路、趋化因子受体相互作用、炎症介质的TRP的调控信号通路和干扰素信号通路;与凋亡相关的p53信号通路、MAPK和ErbB信号通路;与细胞骨架重排相关的的肌动蛋白细胞骨架和Wnt信号通路;与入侵相关的细胞粘附分子;与离子转运调节相关的钙/钾离子信号通路等。利用Cytoscape 3.4.0建立miRNAs-靶基因网络图,发现hsa-miR-34b-5p和hsa-miR-35

关键词：微小隐孢子虫 Ⅱd亚型 HCT-8细胞 miRNAs TLRs

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Puf蛋白的功能及作用机制

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动物医学进展 2021年第5期42卷 119-123页

作者：王臣荣刘晶刘群中国农业大学动物医学院北京海淀100193 农业农村部动物流行病学与人畜共患病重点实验室农业农村部国家动物寄生原虫实验室北京海淀100193

基因调控包括转录调控、转录后调控和翻译调控。基因的转录后调节在快速应对环境变化中起着重要的作用,它通常由各种RNA结合蛋白介导。在大多数真核生物中,Puf(果蝇Pumilio蛋白和秀丽隐杆线虫Fem-3结合因子合称)蛋白是一种高度保守的RN... 详细信息

基因调控包括转录调控、转录后调控和翻译调控。基因的转录后调节在快速应对环境变化中起着重要的作用,它通常由各种RNA结合蛋白介导。在大多数真核生物中,Puf(果蝇Pumilio蛋白和秀丽隐杆线虫Fem-3结合因子合称)蛋白是一种高度保守的RNA结合蛋白,并且其在基因的转录后调控过程中起着重要的作用。目前许多Puf蛋白的研究主要集中在果蝇和线虫上,但是对人和原虫Puf蛋白的研究比较少。论文主要对人和原虫Puf蛋白的生物学功能和作用机制进行总结,以期为原虫新药或疫苗的开发提供新思路。

关键词：基因调控 Puf蛋白功能机制

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miRNA在顶复门原虫感染中的作用机制

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中国兽医杂志 2017年第10期53卷 73-76页

作者：王臣荣许瑞勤王荣军张龙现河南农业大学牧医工程学院河南郑州450002

顶复门原虫是一类专一性的细胞内寄生原虫,如疟原虫、弓形虫和隐孢子虫,严重危害人类和动物的健康,而且给全球公共卫生和畜牧业带来巨大的经济损失。宿主通过启动免疫反应、凋亡及自噬等一系列细胞反应清除体内寄生原虫,而顶复门原虫也... 详细信息

顶复门原虫是一类专一性的细胞内寄生原虫,如疟原虫、弓形虫和隐孢子虫,严重危害人类和动物的健康,而且给全球公共卫生和畜牧业带来巨大的经济损失。宿主通过启动免疫反应、凋亡及自噬等一系列细胞反应清除体内寄生原虫,而顶复门原虫也形成了多种机制逃避宿主的识别和清除,如干扰宿主一些重要信号通路、调节宿主细胞凋亡、细胞因子的产生、细胞周期及脂代谢等。

关键词：寄生原虫 miRNA 机制感染细胞凋亡隐孢子虫经济损失公共卫生

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新孢子虫Pufs蛋白的鉴定及功能

新孢子虫Pufs蛋白的鉴定及功能

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2021中国畜牧兽医学会兽医寄生虫学分会第16次学术研讨会

作者：王臣荣刘晶刘群中国农业大学动物医学院

新孢子虫是一种专性细胞内寄生的顶复亚门原虫,其感染会导致母牛流产及新生胎儿运动障碍和神经系统疾病。新孢子虫速殖子引起宿主急性感染,含缓殖子的包囊引起宿主慢性感染,迄今尚未有药物或者疫苗对缓殖子有效。我们通过生物信息学分析... 详细信息

新孢子虫是一种专性细胞内寄生的顶复亚门原虫,其感染会导致母牛流产及新生胎儿运动障碍和神经系统疾病。新孢子虫速殖子引起宿主急性感染,含缓殖子的包囊引起宿主慢性感染,迄今尚未有药物或者疫苗对缓殖子有效。我们通过生物信息学分析及CRISPR/cas9技术发现新孢子虫表达四个Puf蛋白(NcPuf1/2/3/4)。NcPuf1在细胞内定位于细胞质,在细胞外定位于Processing body;NcPuf2在细胞内和细胞外均定位于细胞质;NcPuf3和NcPuf4在细胞内和细胞外均定位于核仁。过表达NcPuf1或NcPuf2缺失均不影响新孢子虫速殖子增殖、对小鼠致病性及体内外包囊的形成,而NcPuf1缺失会抑制新孢子虫速殖子增殖及减弱对小鼠的致病性,但不会影响其体内外包囊的形成。为了进一步研究NcPuf1和NcPuf2对速殖子及包囊形成的影响,我们构建了NcPuf1 NcPuf2双缺失虫株,发现NcPuf1 NcPuf2双缺失会导致速殖子的分裂异常并显著抑制新孢子虫速殖子增殖及减弱对小鼠的致病性。有趣的,在正常培养环境中,NcPuf1 NcPuf2双缺失会增加缓殖子转录本进而显著促其进体外成囊,而NcPUF1 NcPUF2双缺失会显著抑制其体内成囊,推测可能是NcPuf1 NcPuf2双缺失的速殖子中表达缓殖子特异性蛋白进而引起宿主过早的产生针对缓殖子的抗体,进而抑制其体内包囊的产生。

关键词：新孢子虫 Pufs 速殖子缓殖子

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新孢子虫PUF1与PUF2的鉴定及功能

新孢子虫PUF1与PUF2的鉴定及功能

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中国畜牧兽医学会兽医寄生虫学分会第一届青年科学家学术论坛

作者：王臣荣刘晶刘群中国农业大学动物医学院

新孢子虫是一种专性细胞内寄生的顶复亚门原虫,几乎能够感染所有哺乳动物和禽类。在中间宿主内存在速殖子和缓殖子两种形态,迄今尚未有药物能够穿透包囊壁降低缓殖子存活和增殖能力。速殖子和缓殖子基因的表达受到严格的调控,真核生物中... 详细信息

新孢子虫是一种专性细胞内寄生的顶复亚门原虫,几乎能够感染所有哺乳动物和禽类。在中间宿主内存在速殖子和缓殖子两种形态,迄今尚未有药物能够穿透包囊壁降低缓殖子存活和增殖能力。速殖子和缓殖子基因的表达受到严格的调控,真核生物中RNA结合蛋白PUF不仅可以调控基因的翻译和定位,还可以调控miRNA对基因的翻译调控;新孢子虫是否存在PUF以及其是否调控为虫体速殖子和缓殖子转换的重要因子尚不见报道。我们通过生物信息学分析发现新孢子虫存在两个PUF基因,分别命名为PUF1和PUF2,利用CRISPR/cas9技术对其进行内源性标记,证明新孢子虫表达PUF1和PUF2,胞内虫体的PUF1定位于细胞质,胞外虫体的PUF1呈颗粒状分布于细胞质中。对胞内和胞外的虫体施加不同的压力,发现PUF1的颗粒大小随不同压力发生变化;通过RNA FISH试验发现PUF1与mRNA共定位。PUF2弥散分布整个虫体。进一步研究发现新孢子虫表达Processing body(PB)的标志蛋白DOZI及Dcp1蛋白,通过与PUF1共定位实验发现细胞外PUF1定位于PB中,其RNA结合域不影响其定位,且PUF1缺失不影响PB小体及压力颗粒的形成。为研究PUF在速殖子中的作用,我们利用CRISPR/cas9技术构建PUF基因调控虫株,发现PUF1缺失会抑制新孢子虫增殖及减弱对小鼠的致病性,正常培养条件下PUF1缺失不影响虫株的入侵能力,但在碱性环境(pH=8.2)及高温(40℃)孵育2h,其入侵能力显著下降;饥饿处理胞外的新孢子虫后,PUF1缺失虫株更易发生自噬;过表达NcPUF1虫株及NcPUF2缺失虫株的增殖及对小鼠致病性不受影响;NcPUF1 NcPUF2双缺失虫株的增殖能力和对小鼠的致病性显著下降;NcPUF1 NcPUF2双缺失虫株会显著促进体外成囊。

关键词：新孢子虫 PUF 速殖子缓殖子

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新孢子虫Ncgrx5的鉴定及功能

新孢子虫Ncgrx5的鉴定及功能

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中国畜牧兽医学会兽医寄生虫学分会第一届青年科学家学术论...

作者：宋星桔刘晶王臣荣刘群中国农业大学动物医学院国家动物寄生原虫实验室

新孢子虫是隶属于顶复亚门的专性胞内寄生原虫,其主要危害是引起孕畜流产、死胎等繁殖障碍和犬的神经系统机能障碍,给奶牛养殖业造成巨大的经济损失。谷氧还蛋白(glutaredoxin,grx)是普遍存在于细胞质的小分子硫醇-二硫化物氧化还原酶,... 详细信息

新孢子虫是隶属于顶复亚门的专性胞内寄生原虫,其主要危害是引起孕畜流产、死胎等繁殖障碍和犬的神经系统机能障碍,给奶牛养殖业造成巨大的经济损失。谷氧还蛋白(glutaredoxin,grx)是普遍存在于细胞质的小分子硫醇-二硫化物氧化还原酶,在细胞信号转导过程中发挥重要作用。grx 5在哺乳动物及酵母中研究比较深入,主要功能是将Fe-S簇转运给下游的铁硫蛋白。寄生虫中grx的研究主要在锥虫和疟原虫上,未见在其他顶复门原虫上的报道。我们通过生物信息学分析发现,新孢子虫表达6个grx,均有谷氧还蛋白样结构域。Ncgrx1,Ncgrx2和Ncgrx3定位在细胞质,Ncgrx S16和NcgrxC5定位在顶质体,Ncgrx5定位在线粒体。分别对6个基因进行敲除,发现缺失Ncgrx5导致新孢子虫出现明显的生长缺陷,其入侵和增殖能力显著减弱,对小鼠的毒力显著下降。突变Ncgrx5 CGFS上的176位半胱氨酸,发现突变表型与敲除Ncgrx5后一致,证明其是关键活性位点。通过邻近生物素标记法我们找到100多种Ncgrx5的邻近蛋白,根据后期的分析,找到最可能的互作蛋白是铁硫簇装配转运的关键蛋白(Iscs、Iscu1、Iscu2、HSC70)。为了证实上述互作蛋白的推测,我们先在Ncgrx5-HA虫株中Iscs,Iscu2,Iscu1基因后面添加Flag内源性标签,确认Iscs,Iscu2与Iscu1均定位在线粒体上;免疫共沉淀结果证明Ncgrx5能与铁硫簇装配的关键蛋白Iscu1和Iscs互作。进一步研究Ncgrx5缺失后对互作蛋白Iscu1和Iscs的影响,发现Ncgrx5缺失虫体的Fe-S簇装配上游通路的Iscs转录水平上升,Fe-S簇装配转运基因Iscu1和HSC70转录水平下降;同时,Ncgrx5缺失影响互作蛋白Iscs和Iscu1在线粒体上的定位,呈现无序的颗粒状,说明Ncgrx5在铁硫簇装配转运中发挥重要功能。蛋白组和修饰组学分析发现grx5敲除后,Ncgrx5缺失会影响线粒体电子传递链上的复合体Ⅰ和复合体Ⅱ中铁硫蛋白的表达量,同时会导致复合体Ⅰ上NADH脱氢酶半胱氨酸残基上巯基的氧化修饰累积,处于谷胱甘肽化状态。

关键词：新孢子虫谷氧还蛋白微线蛋白入侵

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河南省奶牛安氏隐孢子虫感染的流行病学调查

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畜牧与兽医 2015年第8期47卷 109-112页

作者：齐萌罗楠楠黄建营崔朝辉余复昌王臣荣李俊强张龙现河南农业大学牧医工程学院/河南省人兽共患病国际联合实验室河南郑州450002

为了解河南省奶牛安氏隐孢子虫病流行情况,采用饱和蔗糖溶液漂浮法和改良抗酸染色法对河南省12个规模化奶牛场和7个奶牛养殖小区共计2 268份粪便样本进行检查,发现109份为阳性粪便样本,感染率为4.8%。卵囊呈长椭圆形,平均大小为7.8μm×... 详细信息

为了解河南省奶牛安氏隐孢子虫病流行情况,采用饱和蔗糖溶液漂浮法和改良抗酸染色法对河南省12个规模化奶牛场和7个奶牛养殖小区共计2 268份粪便样本进行检查,发现109份为阳性粪便样本,感染率为4.8%。卵囊呈长椭圆形,平均大小为7.8μm×6.4μm,卵囊指数为1.22;12个养殖场中10个为阳性场,7个养殖小区中4个为阳性小区,不同地区奶牛安氏隐孢子虫感染率统计学差异显著(P0.05)。结果表明:奶牛隐孢子虫感染流行范围较广,存在一定人兽共患风险。

关键词：奶牛安氏隐孢子虫流行病学

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我国猪群隐孢子虫感染情况及人兽共患风险分析

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畜牧与饲料科学 2024年第4期45卷 121-128页

作者：王臣荣许瑞勤刘向阳安康学院现代农业与生物科技学院陕西安康725000

隐孢子虫(Cryptosporidium)是一种重要的人兽共患寄生原虫,是引起隐孢子虫病(cryptosporidiosis)的病原。隐孢子虫可以通过水和食物感染包括人和家畜、家禽在内的多种宿主,引起宿主出现腹泻等症状,严重时可导致死亡,这不仅给畜禽养殖业... 详细信息

隐孢子虫(Cryptosporidium)是一种重要的人兽共患寄生原虫,是引起隐孢子虫病(cryptosporidiosis)的病原。隐孢子虫可以通过水和食物感染包括人和家畜、家禽在内的多种宿主,引起宿主出现腹泻等症状,严重时可导致死亡,这不仅给畜禽养殖业造成巨大的经济损失,而且对公共卫生安全造成严重威胁。目前尚未见针对隐孢子虫病的有效疫苗或特效药物,因此,隐孢子虫病的流行病学调查显得尤为重要。对我国猪群隐孢子虫感染率、感染虫种分布、感染风险因素方面的研究进展进行综述,并对其人兽共患风险进行分析,以期为我国猪隐孢子虫病的综合防控提供参考。

关键词：隐孢子虫猪分子流行病学人兽共患病风险因素

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抗隐孢子虫卵黄抗体制备及间接ELISA方法建立

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中国兽医学报 2020年第1期40卷 135-139页

作者：张璐党秀丽刘珍珍胡苏辉王臣荣菅复春河南农业大学牧医工程学院/河南省人兽共患病国际联合实验室河南农业大学理学院

用纯化的隐孢子虫卵囊,经反复冻融、冰浴超声波处理制备免疫抗原,免疫产蛋鸡,收集免疫后的鸡蛋,采用水稀释二步硫酸铵法纯化IgY抗体,用棋盘滴定法建立的间接ELISA方法测得IgY抗体的效价为1∶12 800,经ELISA检测,该抗体特异性强、重复性... 详细信息

用纯化的隐孢子虫卵囊,经反复冻融、冰浴超声波处理制备免疫抗原,免疫产蛋鸡,收集免疫后的鸡蛋,采用水稀释二步硫酸铵法纯化IgY抗体,用棋盘滴定法建立的间接ELISA方法测得IgY抗体的效价为1∶12 800,经ELISA检测,该抗体特异性强、重复性好,可用于隐孢子虫抗体检测及流行病学调查。

关键词：隐孢子虫卵黄抗体间接ELISA

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规模化引种场进口奶牛隐孢子虫种类、基因亚型鉴定及其生物安全评价

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中国人兽共患病学报 2015年第11期31卷 1005-1009页

作者：王臣荣齐萌李俊强张振杰刘鹏飞余复昌曹建科宁长申张龙现河南农业大学牧医工程学院、河南省人兽共患病国际联合实验室郑州450002

目的为了解进口奶牛寄生的隐孢子虫对引种场污染情况及是否影响隐孢子虫种类和基因型在当地的分布。方法采用PCR方法检测河南省某规模化引种场奶牛隐孢子虫感染情况。结果基于18SrRNA基因位点进行PCR检测,奶牛隐孢子虫总感染率为17.8%(9... 详细信息

目的为了解进口奶牛寄生的隐孢子虫对引种场污染情况及是否影响隐孢子虫种类和基因型在当地的分布。方法采用PCR方法检测河南省某规模化引种场奶牛隐孢子虫感染情况。结果基于18SrRNA基因位点进行PCR检测,奶牛隐孢子虫总感染率为17.8%(90/507),鉴定出4种隐孢子虫,分别为微小隐孢子虫、牛隐孢子虫、芮氏隐孢子虫和安氏隐孢子虫,隐孢子虫感染率随牛年龄增长而呈递减趋势,差异有统计学意义(P<0.01)。断奶前犊牛以微小隐孢子虫为优势感染种,断奶前犊牛腹泻与微小隐孢子虫感染呈正相关性,差异有统计学意义(P<0.01)。基于gp60基因位点,43份微小隐孢子虫阳性样品成功扩增出35份,序列分析显示35个微小隐孢子虫均为人兽共患基因亚型IIdA19G1,而奶牛引种地(澳大利亚)的牛源微小隐孢子虫均为IIa亚型家族存在显著不同。结论证实微小隐孢子虫为犊牛腹泻病原之一,IId亚型为中国独特分布的微小隐孢子虫亚型,其基因亚型存在地理隔离遗传特征,引种青年牛和成年牛不影响当地重要人兽共患虫种微小隐孢子虫基因亚型分布,从这个角度考虑不具有生物安全重要性。

关键词：隐孢子虫种类基因亚型鉴定奶牛

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