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MicroRNA-21/145和pSmad3C/3L在肝细胞癌中的交互作用机制研究

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MicroRNA-21/145和pSmad3C/3L在肝细胞癌中的交互作用机制研究

作者：王极宇安徽医科大学

学位级别：硕士

原发性肝癌是当今社会人类癌症死亡的第三大原因,也是我国最常见的恶性肿瘤之一,死亡率仅次于胃癌和食道癌。其中,肝细胞癌(HCC,Hepatocellular Carcinoma)约占原发性肝癌的90%。HCC由于其发病隐匿,生存周期短,预后差,死亡率高而成为目... 详细信息

原发性肝癌是当今社会人类癌症死亡的第三大原因,也是我国最常见的恶性肿瘤之一,死亡率仅次于胃癌和食道癌。其中,肝细胞癌(HCC,Hepatocellular Carcinoma)约占原发性肝癌的90%。HCC由于其发病隐匿,生存周期短,预后差,死亡率高而成为目前研究的热点领域之一。尽管分子靶向药物增加了HCC患者的生存周期,但HCC治疗仍面临着巨大挑战。现有研究认为,HCC发生发展关联到多种信号通路失调,其中包括TGF-b/Smad,它直接或间接地与micro RNAs相互作用并在癌变过程中担任着重要角色。研究认为,micro RNA-21在HCC中表达上调,而micro RNA-145在HCC中表达下调,但是它们的异常表达是如何与TGF-b/Smad信号通路下游Smad3蛋白特定结合域磷酸化相互关联,还是未知的。本研究在此基础上,探究Smad3C末端(p Smad3C)和连接区磷酸化(p Smad3L)与micro RNA-21和micro RNA-145在HCC中的相互作用以及对HCC进展影响的作用机制。目的:1.建立裸鼠移植瘤模型,采用agomir/antagomir分别在裸鼠移植瘤中干预mi R-21和mi R-145的表达,观察分别下调micro RNA-21和上调micro RNA-145对肿瘤生长及肿瘤细胞凋亡的影响。2.分别将选择性上调p Smad3C或p Smad3L蛋白水平的稳转细胞株(Smad3EPSM,Smad3 3S-A)接种到裸鼠体内,建立肝细胞癌移植瘤模型,观察分别上调p Smad3C和p Smad3L蛋白水平对肿瘤生长和肿瘤细胞凋亡的影响。3.在肝细胞癌移植瘤模型中,检测下调micro RNA-21表达或上调micro RNA-145表达对p Smad3C和p Smad3L蛋白水平的影响;4.在分别选择性上调p Smad3C和p Smad3L蛋白水平的裸鼠移植瘤模型中检测micro RNA-21和micro RNA-145表达。5.探究在HCC中micro RNA-21/145和p Smad3C/3L的相互作用以及对HCC进展的影响。方法:1.整体动物实验:实验一:雄性BALB/c裸鼠24只,3-5周龄,14-18g,适应性饲养一周。选取状态良好,对数生长期的Hep G2细胞,调细胞密度至4.5×107细胞/ml,每只裸鼠接种0.2ml,每只裸鼠接种细胞数量9×106。分别向各组裸鼠皮下接种Hep G2细胞,待皮下形成明显瘤块后,按瘤体积均分为4组(n=6):mi R-21 antagomir NC组,mi R-21 antagomir组,mi R-145 agomir NC组和mi R-145 agomir组。分别向瘤体内注射20ml mi R-21antagomir NC,mi R-21 antagomir,mi R-145 agomir NC和mi R-145 agomir,每4天注射1次,注射7次后取材。28天后,处死动物,取出瘤块,排水法测量瘤体积,Western-blot和免疫组织化学方法检测瘤体中p Smad3C、p Smad3L和Smad3、Smad4的表达情况,HE染色检测细胞病理学改变,透射电镜检测细胞凋亡情况。雄性BALB/c裸鼠24只,3-5周龄,14-18g,适应性饲养一周。随机分为四组(n=6):Hep G2组,WT组,EPSM组和3S-A组。分别向裸鼠皮下接种稳转Hep G2细胞的Smad3 WT,Smad3 EPSM和Smad3 3S-A细胞(细胞数9×106),待皮下形成明显瘤块后,每4天1次测量肿瘤体积。28天后,处死动物,取出皮下瘤块,测量瘤重瘤体积。Western-blot法检测瘤组织中p Smad3C,p Smad3L和Smad3蛋白表达情况;HE染色和透射电镜检测细胞凋亡情况;q RT-PCR法检测各组中micro RNA-21/145的表达情况。2.体外细胞实验:体外常规培养HepG2细胞,传代培养,选取生长状态良好,对数生长期的细胞,待培养瓶中细胞长至单层铺展面积达90%-95%时,弃培养液,每瓶加胰酶消化(1 ml,17℃,2 min),加DMEM混悬细胞(1.5 ml),转移至10 ml管中(四瓶细胞),离心沉淀细胞(低速离心机,1500转,5 min),弃上清,加PBS混悬细胞。调细胞密度至4.5×107细胞/ml,每只裸鼠接种0.2 ml,每只裸鼠接种细胞数量9×106。向Hep G2细胞中转染mi R-21 antagomir/NC和mi R-145 agomir/NC,体外检测p Smad3C/3L表达。体外培养Hep G2细胞,使用脂质体稳定转染法将三种质粒Smad3 WT、Smad3 EPSM、Smad3 3S-A转入Hep G2细胞中,经G418(600?g/ml)筛选,获得稳定表达转染质粒特性的三种稳转细胞株(Smad3 W

关键词：肝细胞癌 microRNA-21 microRNA-145 pSmad3C pSmad3L

SENEX基因通过活化Rb/E2F通路促进弥漫大B细胞淋巴瘤增殖与复发

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安徽医科大学学报 2020年第3期55卷 432-437页

作者：完颜智翔王极宇潘莹朱凤凤易浏颖翟志敏安徽医科大学第二附属医院血液科合肥230601

目的探讨SENEX基因在弥漫大B细胞淋巴瘤(DLBCL)中的表达及其对DLBCL复发的影响与可能的作用机制。方法分别应用qRT-PCR和Western blot法检测3例初诊DLBCL患者(初诊组)、3例复发DLBCL患者(复发组)和3例完全缓解DLBCL患者(完全缓解组)的SE... 详细信息

目的探讨SENEX基因在弥漫大B细胞淋巴瘤(DLBCL)中的表达及其对DLBCL复发的影响与可能的作用机制。方法分别应用qRT-PCR和Western blot法检测3例初诊DLBCL患者(初诊组)、3例复发DLBCL患者(复发组)和3例完全缓解DLBCL患者(完全缓解组)的SENEX基因和蛋白的表达情况;应用SiRNA转染技术沉默DLBCL细胞株OCI-LY8中的SENEX基因;Western blot和qRT-PCR法验证其转染效率;CCK-8检测转染后细胞增殖情况;ELISA法检测细胞上清液中游离与腺病毒E2启动子结合的转录因子(E2F)水平;Western blot检测细胞中p16和视网膜母细胞瘤蛋白(Rb)/磷酸化视网膜母细胞瘤蛋白(pRb)表达水平。结果复发DLBCL患者中SENEX基因和蛋白水平均增高;沉默DLBCL细胞中SENEX基因表达抑制了DLBCL细胞增殖,并抑制E2F活化和Rb活化。结论SENEX基因通过活化Rb/E2F1通路促进DLBCL增殖与复发。

关键词： SENEX Rb/E2F 弥漫大B细胞淋巴瘤增殖复发

髓源性抑制细胞在急性白血病中的表达及临床意义

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安徽医科大学学报 2020年第3期55卷 471-475页

作者：朱凤凤王会平许旋旋王芝涛王极宇陶千山翟志敏安徽医科大学第二附属医院血液科合肥230601

目的研究外周血髓源性抑制细胞(MDSCs)在急性B淋巴细胞白血病中(B-ALL)的表达及临床相关性。方法收集85例确诊B-ALL患者(缓解组34例,未缓解组51例)和15例健康对照者,采用流式细胞术(FCM)检测外周血中MDSCs的表达水平。结果未缓解组M-MD... 详细信息

目的研究外周血髓源性抑制细胞(MDSCs)在急性B淋巴细胞白血病中(B-ALL)的表达及临床相关性。方法收集85例确诊B-ALL患者(缓解组34例,未缓解组51例)和15例健康对照者,采用流式细胞术(FCM)检测外周血中MDSCs的表达水平。结果未缓解组M-MDSCs水平高于缓解组及健康对照组(P<0.05);未缓解组及缓解组G-MDSCs水平均高于健康对照组(P<0.05),且未缓解组G-MDSCs水平高于缓解组(P<0.05);高危组M-MDSCs表达水平高于中危组(P<0.05);有中枢侵犯的B-ALL患者较无中枢侵犯的G-MDSCs升高(P<0.05);与预后良好患者相比,预后不良患者M-MDSCs水平升高(P<0.05);在G-MDSCs中,预后不良及中间组均高于预后良好组(P<0.05)。结论 B-ALL患者外周血中MDSCs的水平变化可能与该病的发生发展密切相关,且对判断患者预后存在一定价值。

关键词：髓源性抑制细胞急性B淋巴细胞白血病流式细胞术

JAK2、CALR及MPL基因突变检测对BCR-ABL阴性骨髓增殖性肿瘤的诊断价值

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安徽医科大学学报 2018年第5期53卷 750-754页

作者：杨艳熊术道陶千山王极宇刘军李曼曼翟志敏安徽医科大学第二附属医院血液科安徽医科大学血液病研究中心合肥230601

目的探究JAK2、CALR及MPL突变对BCR-ABL阴性骨髓增殖性肿瘤(MPN)的诊断价值。方法对171例外周血细胞计数异常且临床表现疑似MPNs的患者进行回顾性分析,其中106例BCR-ABL阴性MPN患者作为病例组,65例非BCR-ABL阴性MPN患者作为对照组,分析J... 详细信息

目的探究JAK2、CALR及MPL突变对BCR-ABL阴性骨髓增殖性肿瘤(MPN)的诊断价值。方法对171例外周血细胞计数异常且临床表现疑似MPNs的患者进行回顾性分析,其中106例BCR-ABL阴性MPN患者作为病例组,65例非BCR-ABL阴性MPN患者作为对照组,分析JAK2、CALR及MPL突变检测诊断BCR-ABL阴性MPN患者的灵敏度、特异度、阳性预测值、阴性预测值及符合率情况。结果(1)与对照组相比,病例组JAK2、CALR及MPL突变总的阳性率明显升高(P0.05)。结论 3种基因联合检测比单独检测对BCR-ABL阴性MPN诊断的灵敏度、符合率升高,同时可保持一定特异度;3种基因突变联合检测与骨髓病理对诊断经典的BCR-ABL阴性MPN的准确率存在高度一致性。

关键词： BCR-ABL阴性骨髓增殖性肿瘤 JAK2 CALR MPL

细胞衰老诱导的抑制性细胞因子累积对DLBCL细胞功能的影响

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安徽医科大学学报 2021年第9期56卷 1350-1355页

作者：易浏颖王极宇陶千山完颜智翔朱凤凤王会平王芝涛翟志敏安徽医科大学第二附属医院血液科合肥230601

目的探讨细胞衰老在弥漫大B细胞淋巴瘤(DLBCL)细胞抵抗化疗中的作用及机制。方法将入组的DLBCL患者分为初诊(ND)组、完全缓解(CR)组、复发/难治(r/r)组。分别应用HE染色和β-半乳糖苷酶染色法检测淋巴结反应性增生患者、r/r DLBCL患者... 详细信息

目的探讨细胞衰老在弥漫大B细胞淋巴瘤(DLBCL)细胞抵抗化疗中的作用及机制。方法将入组的DLBCL患者分为初诊(ND)组、完全缓解(CR)组、复发/难治(r/r)组。分别应用HE染色和β-半乳糖苷酶染色法检测淋巴结反应性增生患者、r/r DLBCL患者淋巴结组织衰老情况;用β-半乳糖苷酶染色法检测ND、r/r组DLBCL患者外周血中的衰老情况;用10、20、40 nmol/L的阿霉素(DOX)反复诱导DLBCL细胞株LY8衰老,构建衰老模型;CCK-8法检测衰老模型细胞增殖情况;流式细胞术检测衰老模型细胞凋亡情况;ELISA法检测DLBCL患者血清和衰老模型上清液中细胞因子表达。结果r/r组DLBCL患者淋巴结组织及外周血中的衰老细胞明显增多且血清中白细胞介素(IL)-6、IL-8、IL-10、IL-35、转化生长因子-β1(TGF-β1)等促炎性和免疫抑制性细胞因子分泌增加;使用40 nmol/L DOX成功诱导LY8细胞衰老,衰老细胞比例24.77%。对对照组及DOX诱导组进行功能检测,结果提示衰老组细胞增殖率低于对照组但高于10 nmol/L和20 nmol/L DOX组(P<0.05);凋亡率高于对照组但低于10 nmol/L和20 nmol/L DOX组(P<0.05)。同时,各组IL-2、IL-6、IL-8、IL-10、TGF-β1分泌量差异有统计学意义(P<0.05),与对照组比较,衰老组细胞上清液中IL-2、IL-6、IL-8、IL-10、IL-35、TGF-β1等各种促炎和免疫抑制性细胞因子分泌增加。结论细胞衰老通过诱导抑制性细胞因子累积促进DLBCL细胞凋亡抵抗。

关键词：细胞衰老抑制性细胞因子弥漫大B细胞淋巴瘤凋亡抵抗

CD19 CAR-T细胞治疗复发/难治性B-ALL后细胞因子水平变化及其临床意义

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中国免疫学杂志 2019年第19期35卷 2385-2390页

作者：张秋叶王极宇张家奎王会平陶千山翟志敏安徽医科大学第二附属医院血液科

目的:探索CD19 CAR-T细胞治疗复发/难治性B-ALL后细胞因子水平的变化及其临床意义。方法:选取2015年8月至2018年2月我院血液科接受CD19 CAR-T细胞治疗的复发/难治性B-ALL患者23例,应用CBA技术和免疫比浊法检测输注前后血清中IL-6、IFN-... 详细信息

目的:探索CD19 CAR-T细胞治疗复发/难治性B-ALL后细胞因子水平的变化及其临床意义。方法:选取2015年8月至2018年2月我院血液科接受CD19 CAR-T细胞治疗的复发/难治性B-ALL患者23例,应用CBA技术和免疫比浊法检测输注前后血清中IL-6、IFN-γ、IL-10、TNF-α和CRP水平。然后根据CTCAE v4.0将发生CRS的患者分为轻度CRS组(1~2级)和重度CRS组(3~5级),比较两组细胞因子水平的差异及治疗反应。结果:①CD19 CAR-T细胞输注前后患者血清中IL-6(2.00~28.50 vs 34.50~112.00)、IFN-γ(2.13~3.12 vs 4.35~10.07)、IL-10(1.00~1.80 vs 4.01~39.92)、TNF-α(2.91~4.60 vs 4.99~40.18)差异均具有统计学意义(P=0.000,0.000,0.001,0.002);②轻度CRS组和重度CRS患者相比,血清中IL-6(28.75~61.25 vs 91.00~1 074.00)、IFN-γ(3.93~7.28 vs 12.53~15.30)、IL-10(3.13~7.47 vs 39.92~84.97)、TNF-α(4.60~15.77 vs 40.18~62.51)和CRP(4.95~46.86 vs 37.81~120.17)差异均具有统计学意义(P=0.004、0.004、0.003、0.000、0.045);③CD19 CAR-T治疗后完全缓解(包括血象未完全恢复患者)组与未缓解组间上述细胞因子与CRP水平均差异无统计学意义;④IL-6显著升高的重度CRS患者,应用IL-6受体拮抗剂治疗后均好转。结论:IL-6、IFN-γ、IL-10、TNF-α细胞因子的水平可作为判断CRS严重程度的实验室参考指标,并可指导临床靶向选择细胞因子拮抗剂,但对CD19 CAR-T疗效预测价值有待进一步验证。

关键词：细胞因子释放综合征细胞因子嵌合抗原受体T细胞复发/难治 B-ALL CD19

MAPK抑制因子对HSC中Smad2/3磷酸化及Smad4核转位的影响

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安徽医科大学学报 2015年第9期50卷 1243-1247页

作者：江宇峰伍超吴佳俊王极宇马成骁陈帆吴德卫杨明郑凌云杨雁安徽医科大学药理学教研室合肥230032

目的探究3种丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)抑制因子对转化生长因子-β(TGF-β)活化的大鼠肝星状细胞(HSC)中Smad2/3磷酸化及Smad4核转位的影响。方法采用Ⅳ型胶原酶和链酶蛋白酶原位肝灌流法分离正常大鼠HSC并传代培养,分别用细胞外信号调... 详细信息

目的探究3种丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)抑制因子对转化生长因子-β(TGF-β)活化的大鼠肝星状细胞(HSC)中Smad2/3磷酸化及Smad4核转位的影响。方法采用Ⅳ型胶原酶和链酶蛋白酶原位肝灌流法分离正常大鼠HSC并传代培养,分别用细胞外信号调节激酶(ERK)、c-Jun氨基末端激酶(JNK)、p38抑制因子(PD98059、SP600125、SB203580)与HSC共同培养,再加入TGF-β1活化细胞,采用免疫沉淀和Western blot法检测p Smad2C、p Smad2L、p Smad3L蛋白表达;采用细胞免疫荧光法检测Smad4蛋白表达及细胞内定位情况。结果 Western blot显示静息状态下HSC几乎不表达p Smad2C而低表达p Smad2L、p Smad3L,TGF-β1刺激后显著上调上述磷酸化蛋白表达,p38抑制因子(1、3μmol/L)、ERK抑制因子(1μmol/L)对Smad2C、Smad2L、Smad3L磷酸化无显著影响;p38抑制因子(10μmol/L)降低了p Smad3L蛋白表达;ERK抑制因子(3、10μmol/L)降低了p Smad2C蛋白表达;JNK抑制因子(1、3、10μmol/L)减少了p Smad2C、p Smad2L、p Smad3L蛋白表达。TGF-β1刺激可明显诱导Smad4核转位,而3种MAPK抑制因子不同程度地抑制TGF-β1诱导的Smad4转位入核。结论在HSC细胞中TGF-β1可能通过活化JNK通路促进Smad2/3磷酸化,活化ERK、JNK、p38通路促进Smad4核转位。

关键词：大鼠肝星状细胞丝裂原活化蛋白激酶抑制剂 Smad2 Smad3 Smad4

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生物质气化/直燃供热系统经济性分析

河北工业大学学报 2022年第4期51卷 65-72,92页

作者：丁亿极王恩宇陈冠益河北工业大学能源与环境工程学院天津300401 天津大学环境科学与工程学院天津300350

利用天津市农村地区生物质气化/直燃集中供热项目所需的总成本、总利润等因素对经济效益和投资回收期的影响进行计算分析,研究表明:研究案例的生物质气化供热方案的投资回收期为3.18 a,生物质直燃供热方案的投资回收期为1.50 a。生物质... 详细信息

利用天津市农村地区生物质气化/直燃集中供热项目所需的总成本、总利润等因素对经济效益和投资回收期的影响进行计算分析,研究表明:研究案例的生物质气化供热方案的投资回收期为3.18 a,生物质直燃供热方案的投资回收期为1.50 a。生物质气化技术供热的总投资较高,为生物质直燃技术总投资的1.63倍。在影响两种生物质供热方案全寿命总成本的因素中,物料成本影响最大,占总成本的35%以上,初投资、设备耗电费用、设备折旧费和系统维护保养费用的影响依次降低。

关键词：生物质气化生物质直燃供热经济性分析全生命周期总成本

积雪苷霜软膏对兔耳增生性瘢痕组织中Smad4蛋白表达的影响

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安徽医药 2015年第5期19卷 834-837页

作者：江宇峰伍超吴佳俊王极宇庄文豪马腾飞江洁美杨雁安徽医科大学药理学教研室安徽合肥230032

目的探讨积雪苷霜软膏对兔耳增生性瘢痕组织中Smad4蛋白表达的影响。方法新西兰大耳白兔18只,随机分为正常对照组、模型组、积雪苷霜软膏组。模型组和积雪苷霜软膏组建立兔耳腹侧面增生性瘢痕模型,术后21 d,积雪苷霜软膏组瘢痕局部涂抹... 详细信息

目的探讨积雪苷霜软膏对兔耳增生性瘢痕组织中Smad4蛋白表达的影响。方法新西兰大耳白兔18只,随机分为正常对照组、模型组、积雪苷霜软膏组。模型组和积雪苷霜软膏组建立兔耳腹侧面增生性瘢痕模型,术后21 d,积雪苷霜软膏组瘢痕局部涂抹积雪苷霜软膏,每天2次,连续用药28 d;正常组和模型组涂抹软膏基质。每周观察并拍照记录瘢痕的生长情况,于术后49 d处死动物,进行病理、羟脯氨酸和Smad4蛋白检测。结果模型组瘢痕以较快速度生长,积雪苷霜软膏组,瘢痕生长显著被抑制。病理检测显示,模型组增生性瘢痕组织纤维化明显,而积雪苷治疗可显著改善纤维化。羟脯氨酸定量显示,增生性瘢痕组织中羟脯氨酸(Hyp)含量显著升高(P<0.01),而积雪苷治疗显著降低瘢痕组织中Hyp水平(P<0.01)。免疫印迹结果显示增生性瘢痕组织中Smad4蛋白水平显著上调,而积雪苷治疗显著降低Smad4蛋白表达(P<0.01)。结论积雪苷霜抗增生性瘢痕作用可能与调控Smad4蛋白表达有关。

关键词：积雪苷霜软膏增生性瘢痕纤维化 Smad4