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作者：王悄悄南京师范大学

学位级别：硕士

猪链球菌(Streptococcus suis,***)是重要的人兽共患病病原菌,人类可通过接触患病动物或食用带菌猪肉制品等途径感染。荚膜多糖(Capsular Polysaccharide,CPS)是***重要毒力因子之一,不仅能够介导细菌黏附和侵袭,还可以抑制宿主炎症反... 详细信息

猪链球菌(Streptococcus suis,***)是重要的人兽共患病病原菌,人类可通过接触患病动物或食用带菌猪肉制品等途径感染。荚膜多糖(Capsular Polysaccharide,CPS)是***重要毒力因子之一,不仅能够介导细菌黏附和侵袭,还可以抑制宿主炎症反应及补体介导的杀伤和吞噬作用。研究发现大多数细菌酪氨酸激酶(Bacterial protein-tyrosine kinases,BY-kinases)基因位于CPS合成操纵子上,常以自磷酸化方式参与CPS的生物合成和转运。在革兰阳性厚壁菌门中,BY-kinases由跨膜激活蛋白和酪氨酸激酶蛋白组成,只有跨膜激活蛋白的胞内段和酪氨酸激酶蛋白的催化结构域之间发生相互作用,BY-kinases才具有完整激酶活性。实验室前期分析2型猪链球菌(Streptococcus suis serotype 2,*** 2)05ZYH33菌株全基因组注释,发现cps基因簇中的cps2B和cps2C基因分别编码跨膜激活蛋白和酪氨酸激酶蛋白,并且发现在*** BL21中单独表达的Cps2B和Cps2C均不能发生磷酸化,与Cps2B C末端23个氨基酸融合表达的Cps2Bct C则可以发生丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸磷酸化。酪氨酸激酶编码基因cps2C在*** 2中的具体生物学功能尚不清楚,本文构建cps2C基因敲除株,通过比较野生株和敲除株生物学性状的变化揭示cps2C的生物学功能,主要研究内容和结果如下:***2C基因敲除株的构建及鉴定构建中间为壮观霉素抗性基因Spc (S片段)、两侧为cps2C基因上、下游同源臂(L和R片段)的p UC19::cps2C基因敲除质粒。将p UC19::cps2C电转化05ZYH33感受态细胞进行同源重组,通过Spc抗性筛选及cps2C内部引物PCR筛选获得cps2C候选敲除株,对候选菌株进行组合PCR、RT-PCR、Western blot及DNA测序鉴定后,成功获得敲除株并命名为Δcps2C。2.Δcps2C基本生物学特性及致病性分析革兰染色观察细菌形态并对细菌链长进行统计分析,结果显示Δcps2C菌株每链平均细胞数(7.24±3.38)显著少于05ZYH33菌株(13.01±10.24)(P<0.01),提示cps2C基因可能参与*** 2的链长调节。通过透射电镜观察细菌荚膜,发现Δcps2C典型荚膜结构缺失,表明cps2C基因缺失后荚膜合成受阻,提示Cps2C可能参与了细菌荚膜合成或调控过程。通过小鼠攻毒实验检测细菌毒力,结果显示Δcps2C组小鼠存活率(10/10)显著高于05ZYH33组(0/10)(P<0.05),说明Δcps2C菌株毒力显著下降。通过小鼠保护性实验分析Δcps2C的免疫保护能力,发现免疫组小鼠存活率(6/10)显著高于对照组(0/10)(P<0.05),表明Δcps2C敲除株具有作为减毒疫苗的潜能。***2C缺失对CPS操纵子转录水平及蛋白质磷酸化水平的影响在cps基因簇中设计跨基因引物,通过RT-PCR鉴定相邻基因是否为共转录,从而鉴定出CPS操纵子基因组成,结果表明CPS操纵子共包含orf2X、cps2A-cps2K 12个连续转录的基因。通过q RT-PCR分析Δcps2C菌株CPS操纵子中各基因转录水平,发现cps2B基因相对表达水平上调2.6倍,其他10个基因转录水平无显著差异,结果说明酪氨酸激酶基因cps2C的缺失影响跨膜激活蛋白基因cps2B的转录水平,但Cps2C不参与CPS操纵子中其他CPS合成相关基因(除cps2B以外)的转录调控,提示Cps2C以转录后方式调控*** 2 CPS的生物合成过程。采用Western blot方法对Δcps2C、Δcps2B和05ZYH33细菌全蛋白进行丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸磷酸化检测,结果显示在05ZYH33菌株30 k Da蛋白位置处可见丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸磷酸化条带,而Δcps2C菌株在30 k Da蛋白位置处未见相应磷酸化条带,表明Cps2C参与细菌蛋白丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸磷酸化调控,实验结果不仅进一步为Cps2C蛋白具有酪氨酸激酶特性提供了实验证据,还提示Cps2C可能具有丝氨酸和苏氨酸激酶特性;结果还显示Δcps2B菌株30 k Da蛋白位置处丝氨酸和酪氨酸磷酸化条带消失,苏氨酸磷酸化条带减弱,推测在*** 2中Cps2B是Cps2C激酶活性必不可少的激活剂。综上所述,本研究成功构建了Δcps2C敲除株;与*** 2 05ZYH33野生株相比,Δcps2C敲除株典型荚膜结构缺失、细菌链长变短、对小鼠致病性显著减弱;CPS操纵子由orf2X、cps2A-cps2K 12个荚膜合成相关基因组成,C

关键词： 2型猪链球菌荚膜多糖毒力因子酪氨酸激酶基因敲除

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刑法评价的相对独立性——以刑法与前置法的实体关系为视角

刑法评价的相对独立性——以刑法与前置法的实体关系为视角

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作者：王悄悄华东政法大学

学位级别：硕士

在漫长的法制史长河中,刑法与前置法的关系可谓是学者们关注的本原性问题。对于立法者而言,犯罪圈如何准确设定,刑法如何保障促进而不是干扰阻碍蓬勃发展的前置法行为,值得深思;而对于司法者而言,如何根据法律规范进行刑法上的评价,刑... 详细信息

在漫长的法制史长河中,刑法与前置法的关系可谓是学者们关注的本原性问题。对于立法者而言,犯罪圈如何准确设定,刑法如何保障促进而不是干扰阻碍蓬勃发展的前置法行为,值得深思;而对于司法者而言,如何根据法律规范进行刑法上的评价,刑法评价是否具有自主性,又是一个长久不衰的问题。本文以司法实践中的三个典型案例为引子,提出本文拟研究的三个问题:一、刑法对同一规范用语的解释判断是否具有独立性?二、刑法违法性的判断是否具有独立性?其是否需以具有前置法的违法性为前提?三、若刑法评价具有独立性,其是否违背法秩序的统一性?并进而通过对这三个问题的深入分析得出本文的结论,即刑法评价具有相对独立性,首先刑法规范用语的解释判断不以前置法的解释判断结果为限;其次,违法性判断具有相对性,我国刑法违法性判断不以前置法违法性的判断结果为依据。本文主要包括以下四个部分:第一部分是通过对案例的分析提出问题并对问题存在的原因进行分析。此部分首先通过分析司法实践中的三个典型案例提出本文拟要研究的问题,即刑法评价是否具有独立性;其次分析司法实践中存在大量刑民交叉、行刑交叉等疑难案件的原因,本文认为原因主要在于各规范的目的、立法效果及规制方式的不同,此外我国立法泛刑法化的趋势使刑法与前置法之间的界限愈发模糊,从而使这一问题更为严峻。第二部分是对问题一“刑法对同一规范用语的解释判断是否具有独立性”的深入分析。此部分通过对刑法的“二次规范”属性以及我国“大一统”的立法模式的分析,阐释我国刑法规范用语与其他法领域的规范用语在一定程度上具有同一性;在此基础上,通过对刑法的独立性以及刑法与其他法领域在立法目的、价值上的不同的分析,表明刑法对规范用语的评价并不必然根据前置法的规定而严格解释,其可对该用语在文义的基础上进行合刑法目的性的解释;最后对本文第一部分所引的案例一进行深入分析,以案例的方式进一步证实刑法在规范用语的解释上具有相对独立性,前置性规范的解释判断结果对刑法用语的解释判断仅具有参考作用。第三部分是对问题二“刑法违法性判断是否具有独立性”的深入分析。在分析德日刑法理论中就刑法上违法性与其他法领域违法性的关系所涉及的理论——违法统一性与违法相对性的基础上,将德日刑法理论中的违法性与我国的刑事违法性作比较,引入德日刑法理论中的违法相对性理论;其次立足于我国刑法规范,通过分析我国的立法模式及构罪模式,表明在我国,刑法上的违法性判断具有相对独立性,前置法的违法判断内化于刑法违法判断过程中;最后从前置法角度进行分析,在我国,民事侵权责任中的违法性判断其本身没有定式,难以成为刑法违法性判断的前置依据,并且前置法上法律行为的有效性与合法性是两个相互独立的问题,行为的效力评价与违法性判断是相分离的,两者不能完全等同,因而刑法违法性判断不能直接以前置性违法判断结果为依据,前置法上有效的行为并不一定能排除其刑法上的违法性。最后一部分是对问题三“是否违背法秩序统一性”的深入分析。法秩序统一性可以从不同层面来理解,而不同的层面能得出不同的结论,我们认为,法秩序的统一性是相对的,不是绝对的,是合目的性体系角度的统一,其不要求消除所有的矛盾,只需这一评价在体系内合各规范的目的性,且不违背公理与正义。

关键词：刑法评价独立性违法判断法秩序统一性

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快速消费品的渠道建设研究

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企业活力 2008年第5期 38-39页

作者：王悄悄陈鹏浙江万里学院商学院

一、快速消费品渠道建设的现状思考在20世纪90年代，市场经济体制的施行，对于具有生产能力的厂家来说，是一场必然的革命，而对于活跃在市场终端与中层的零售商与分销商来说也是一场变革，前所未有的市场环境对于厂家来说是一个挑战，... 详细信息

一、快速消费品渠道建设的现状思考在20世纪90年代，市场经济体制的施行，对于具有生产能力的厂家来说，是一场必然的革命，而对于活跃在市场终端与中层的零售商与分销商来说也是一场变革，前所未有的市场环境对于厂家来说是一个挑战，而对于商家来说也是一个考验。由于渠道管理的混乱，快速消费品市场一度出现了不少问题。时至今日，这些问题依旧是影响快速消费品渠道建设的重要因素。

关键词：快速消费品市场渠道建设 20世纪90年代市场经济体制生产能力市场终端市场环境渠道管理

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保安不法出租他人房屋案之我见——兼谈盗窃罪的犯罪对象

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广西政法管理干部学院学报 2015年第4期30卷 121-125页

作者：王悄悄华东政法大学上海200042

保安冒用房主名义将房屋出租并将租金据为己有,这一行为的性质在理论与实践中均引发巨大争议。要确定能否对其行为进行刑法上的评价以及如何评价,首先得明确其犯罪对象。我们认为,财产性利益在刑法作出明确规定之前不能仅依解释论成为... 详细信息

保安冒用房主名义将房屋出租并将租金据为己有,这一行为的性质在理论与实践中均引发巨大争议。要确定能否对其行为进行刑法上的评价以及如何评价,首先得明确其犯罪对象。我们认为,财产性利益在刑法作出明确规定之前不能仅依解释论成为财产罪的犯罪对象;相反,不动产作为财物的一种,可以成为盗窃罪的犯罪对象。

关键词：不法出租财产性利益不动产犯罪对象

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对5081例狂犬病疫苗接种者出现不良反应情况的研究

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当代医药论丛 2017年第17期15卷 53-54页

作者：王悄悄潘杨红陈巧红杭州市西溪医院浙江杭州310023

目的:对5081例狂犬病疫苗接种者出现的不良反应进行观察和研究。方法:选取2015年12月至2017年3月期间在杭州市西溪医院接种狂犬病疫苗的5081例接种者作为研究对象。调查这些接种者在注射狂犬病疫苗后不良反应的发生情况。结果:调查的结... 详细信息

目的:对5081例狂犬病疫苗接种者出现的不良反应进行观察和研究。方法:选取2015年12月至2017年3月期间在杭州市西溪医院接种狂犬病疫苗的5081例接种者作为研究对象。调查这些接种者在注射狂犬病疫苗后不良反应的发生情况。结果:调查的结果显示,在这5081例狂犬病疫苗接种者中,有42例接种者出现了不良反应,其不良反应的发生率为8.27‰。在出现不良反应的这42例接种者中,出现发热、头痛和寒战症状的接种者有35例,出现皮疹、皮肤瘙痒症状的接种者有4例,出现恶心、呕吐和四肢酸痛症状的接种者有3例。结论:发热、头痛、寒战、皮疹、皮肤瘙痒、恶心、呕吐和四肢酸痛是狂犬病疫苗接种者较常见的不良反应。临床上在为接种者注射狂犬病疫苗期间,应严密监测其不良反应的发生情况,及时对其出现的不良反应进行处理。

关键词：狂犬病疫苗不良反应接种效果

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穴位贴敷缓解肝硬化患者恶心症状的疗效分析

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中国高等医学教育 2019年第11期 131-132页

作者：王悄悄邬菊英张少群浙江中医药大学附属杭州西溪医院

目的:探讨穴位贴敷联合常规护理措施缓解肝硬化患者恶心的疗效。方法:选取2018年1月-2019年1月于我院就诊的肝硬化患者120例纳入研究,根据随机数字表法分为实验组和对照组,各60例。对照组患者实施常规护理措施,实验组患者在常规护理基... 详细信息

目的:探讨穴位贴敷联合常规护理措施缓解肝硬化患者恶心的疗效。方法:选取2018年1月-2019年1月于我院就诊的肝硬化患者120例纳入研究,根据随机数字表法分为实验组和对照组,各60例。对照组患者实施常规护理措施,实验组患者在常规护理基础上实施穴位贴敷。比较干预后两组患者恶心症状有效缓解率和护理满意度。结果:干预后,实验组患者护理满意度为100%,对照组患者护理满意度为80.0%,差异有统计学意义(P<0.05)。实验组58例患者恶心症状缓解(96.7%),对照组20例患者恶心症状缓解(33.3%),两组比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论:穴位贴敷作为一种中医治疗方法能够缓解肝硬化患者恶心症状,提升患者护理满意度。

关键词：肝硬化恶心穴位贴敷

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《劳动合同法》颁行以来在杭高校务工人员劳动权益保障问题调查研究

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法制与社会 2013年第22期 238-239页

作者：曹洁琼何肖莉杨纱纱王悄悄陈晓铭浙江工商大学法学院

本文对《劳动合同法》颁行以来在杭高校务工人员劳动权益保障问题进行了调查研究。通过调研发现中国普通劳动者权益维护方面还存在这很多问题。针对这写问题,本文提出了一些针对性的措施。

关键词：《劳动合同法》权益维护高校务工人员

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2型猪链球菌cps2D基因敲除株的构建及其基本生物学特性的研究

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中国人兽共患病学报 2022年第4期38卷 285-290页

作者：刘旭苗王悄悄林苗倪华郑峰王怡雯汪春晖潘秀珍曹祥荣南京师范大学生命科学学院南京210023 东部战区疾病预防控制中心南京210002 新疆帕米尔高原生物资源与生态重点实验室喀什大学生命与地理科学学院喀什844000

目的构建2型猪链球菌荚膜多糖基因簇中cps2D基因敲除株(Δcps2D),比较野毒株05ZYH33与敲除株Δcps2D基本生物学特性的差异。方法设计合成引物L1/L2、R1/R2、Spc1/Spc2,分别扩增cps2D基因上、下游同源臂L片段、R片段及Spc^(R)抗性基因S片... 详细信息

目的构建2型猪链球菌荚膜多糖基因簇中cps2D基因敲除株(Δcps2D),比较野毒株05ZYH33与敲除株Δcps2D基本生物学特性的差异。方法设计合成引物L1/L2、R1/R2、Spc1/Spc2,分别扩增cps2D基因上、下游同源臂L片段、R片段及Spc^(R)抗性基因S片段,将3个片段连接至pUC19线性载体上,构建敲除质粒pUC19::cps2D。将敲除质粒电转导入05ZYH33感受态细胞后,利用Spc^(R)抗性平板筛选敲除株,并通过组合PCR和RT-PCR进一步验证。比较野毒株05ZYH33和敲除株Δcps2D细菌生长特性、溶血活性、革兰染色、细菌链长、荚膜形态等方面的异同。结果L1/L2、R1/R2、Spc1/Spc2三组引物分别扩增出L(1030 bp)、R(1030 bp)以及S(1130 bp)基因片段;通过无缝克隆的方法成功构建出敲除质粒pUC19::cps2D;电转入感受态细胞后获得69个克隆,筛选出26个疑似敲除株;组合PCR以及RT-PCR筛选后获得cps2D基因敲除株Δcps2D;与野毒株05ZYH33相比,Δcps2D对数期生长变缓,链长显著变短,荚膜稀疏变薄。结论成功构建cps2D基因敲除株,为后续进一步研究其调控荚膜合成的作用机制奠定基础。

关键词： 2型猪链球菌荚膜多糖酪氨酸激酶Cps2D 基因敲除生物学性状

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2型猪链球菌酪氨酸激酶Cps2C基因过表达株的构建

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中国病原生物学杂志 2022年第7期17卷 770-773,778页

作者：王悄悄郑峰刘旭苗林苗倪华王怡雯曹祥荣汪春晖潘秀珍东部战区疾病预防控制中心江苏南京210002 南京师范大学生命科学学院新疆帕米尔高原生物资源与生态重点实验室喀什大学生命与地理科学学院

目的构建2型猪链球菌酪氨酸激酶Cps2C基因过表达株,为cps2C基因功能研究提供实验材料。方法使用重叠延伸PCR技术将延伸因子TufA(又名EF-Tu,编码基因为SSU05_0530)的启动子(命名为P0530)与cps2C基因连接为P0530cps2C片段,将P0530cps2C酶... 详细信息

目的构建2型猪链球菌酪氨酸激酶Cps2C基因过表达株,为cps2C基因功能研究提供实验材料。方法使用重叠延伸PCR技术将延伸因子TufA(又名EF-Tu,编码基因为SSU05_0530)的启动子(命名为P0530)与cps2C基因连接为P0530cps2C片段,将P0530cps2C酶切后连接至猪链球菌-大肠埃希菌穿梭质粒pSET2,构建过表达质粒pSET2::P0530cps2C。将pSET2::P0530cps2C电转化导入*** 2野生毒株05ZYH33感受态细胞,抗性及组合PCR筛选得到cps2C过表达株。qRT-PCR检测过表达株cps2C基因的转录水平。结果重叠延伸PCR成功将P0530启动子片段(300 bp)和cps2C基因片段(696 bp)拼接为P0530cps2C(996 bp),片段及载体经BamH I和EcoR I酶切后连接,成功构建出过表达质粒pSET2::P0530cps2C;将pSET2::P0530cps2C电转化导入*** 205ZYH33感受态细胞,抗性筛选及组合PCR检测结果显示cps2C过表达株构建成功。提取野生株05ZYH33和cps2C过表达株总RNA后进行qRT-PCR实验,结果显示过表达株cps2C基因的相对表达水平较05ZYH33株上调2.4倍。结论本研究选用*** 205ZYH33的延伸因子TufA强启动子P0530作为启动子,成功构建过表达质粒pSET2::P0530cps2C并导入*** 2感受态细胞,成功获得cps2C过表达株,为进一步研究酪氨酸激酶Cps2C功能提供实验材料。

关键词： 2型猪链球菌酪氨酸激酶Cps2C 过表达株

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2型猪链球菌二元信号系统孤儿调控因子CovR磷酸化位点鉴定

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中国人兽共患病学报 2021年第5期37卷 392-397页

作者：王悄悄李超龙张会芳刘旭苗郑峰汪春晖潘秀珍曹祥荣南京师范大学生命科学学院南京210023 东部战区疾病预防控制中心南京210002

目的利用Escherichia coli BL21原核表达系统共表达2型猪链球菌丝氨酸/苏氨酸激酶STK与孤儿调控因子CovR蛋白,通过质谱鉴定CovR蛋白磷酸化位点,探究STK对CovR的磷酸化作用。方法构建CovR蛋白表达载体pCDFDuet-1::covR及pCDFDuet-1::covR... 详细信息

目的利用Escherichia coli BL21原核表达系统共表达2型猪链球菌丝氨酸/苏氨酸激酶STK与孤儿调控因子CovR蛋白,通过质谱鉴定CovR蛋白磷酸化位点,探究STK对CovR的磷酸化作用。方法构建CovR蛋白表达载体pCDFDuet-1::covR及pCDFDuet-1::covR/stk,重组表达蛋白分别命名为CovR1与CovR2。通过蛋白磷酸化质谱技术检验CovR2蛋白的关键磷酸化位点。分别构建CovR苏氨酸突变体CovRT、丝氨酸突变体CovRS、酪氨酸突变体CovRY及丝/苏/酪氨酸全突变体CovRA,与STK共表达后分析其磷酸化状态,确定CovR磷酸化靶点。结果在*** BL21表达系统中成功表达并纯化CovR1与CovR2蛋白,Western blot分析发现CovR1无磷酸化信号,CovR2可以被磷酸化。进一步对CovR2磷酸化质谱检测发现其第45、148、150、159、168、194、219位苏氨酸,第40、172、215位丝氨酸以及第225位酪氨酸为关键磷酸化位点。对CovRT、CovRS、CovRY及CovRA突变体磷酸化状态检测,结果表明CovR2的丝/苏/酪氨酸均可发生磷酸化。结论在*** BL21中共表达STK与CovR可导致CovR丝/苏/酪氨酸磷酸化,通过质谱技术鉴定了CovR的磷酸化位点,提示CovR可能是STK的磷酸化调控靶点。

关键词： 2型猪链球菌丝氨酸/苏氨酸激酶孤儿调控因子CovR 磷酸化检测

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