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猪精液中PRRSV、CSFV、JEV荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用

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猪精液中PRRSV、CSFV、JEV荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用

作者：王婕敏湖南农业大学

学位级别：硕士

目的：猪精液中携带病毒易导致疾病的扩散和流行,给养猪业造成了巨大经济损失。实时定量PCR方法已经广泛运用于疾病检测,但猪精液中RNA病毒缺乏有效的检测方法,本研究以期建立猪精液PRRSV、CSFV和JEV实时定量PCR检测方法,临床监测猪精液... 详细信息

目的：猪精液中携带病毒易导致疾病的扩散和流行,给养猪业造成了巨大经济损失。实时定量PCR方法已经广泛运用于疾病检测,但猪精液中RNA病毒缺乏有效的检测方法,本研究以期建立猪精液PRRSV、CSFV和JEV实时定量PCR检测方法,临床监测猪精液中RNA病毒感染情况。分析病毒感染对精液品质的影响。方法：查询Gen Bank中注册发表的PRRSV、CSFV和JEV相关基因序列,通过序列比对,找出各病毒的保守区域,用Primer Premier 5.0. Primer Express 3.0、Oligo7及DNASTAR等软件筛选设计符合普通PCR克隆和实时定量PCR要求的3对特异性引物,构建PRRSV、CSFV和JEV的标准质粒,并将质粒进行倍比稀释用以荧光定量PCR动力学扩增曲线和标准曲线的构建,进行敏感性实验、特异性实验、重复性实验验证方法体系,用建立的荧光定量PCR方法检测临床样品。同时取部分样品进行玻片涂抹及计数板计数,检测其精子浓度及畸形率结果：1)分别建立了有效检测精液中PRRSV、CSFV和JEV的实时定量PCR方法,PRRSV检测方法动力学扩增曲线在1.824×106拷贝/μL-1.824×101拷贝/μL之间有良好的线性关系,R2为0.996,扩增效率100.32%,其灵敏度可达1.824×101拷贝/μL,将与公猪精液混合的PRRSV疫苗株以10倍梯度稀释后经RNA和反转录后再进行荧光定量PCR检测,其可检测到的最低稀释度为102.0TCID5o/mL;CSFV检测方法的动力学扩增曲线在5.952×106拷贝/μL-5.952×101拷贝/μL之间有良好的线性关系,R2为0.998,扩增效率为104.66%,其灵敏度可达101拷贝/μL,将与公猪精液混合的CSFV疫苗株以10倍梯度稀释后经RNA和反转录后再进行荧光定量PCR检测,其可检测到的最低稀释度为30RID/mL;JEV检测方法在3.781×106拷贝/μL-3.781×101拷贝/μL之间有良好的线性关系,R2为0.991,扩增效率为101.66%,其灵敏度可达101拷贝/μL,将与公猪精液混合的JEV疫苗株以10倍梯度稀释后经RNA和反转录后再进行荧光定量PCR检测,其可检测到的最低稀释度为101.7TCID50/mL。特异性试验中仅PRRSV、CSFV及JEV相应的基因得以扩增,PCV2、PRV、PPV等猪常见病毒在实验中均呈阴性。2)采用构建的实时定量PCR方法对15个猪场的109份猪精液样品进行了3种病毒的检测,结果显示,86.67%(13/15)的猪场检出病毒阳性精液,其中PRRSV阳性率12.8%(14/109,病毒载量18.57拷贝/μL至294.41拷贝/μL), CSFV阳性率21.1%(23/109,病毒载量13.44拷贝/μL至123.39拷贝/μL),总的JEV阳性率20.2%(22/109,病毒载量为11.20拷贝/μL至246.27拷贝/μL);PRRSV与CSFV混合感染率为2.7%,CSFV与JEV混合感染率为1.8%,三种病毒混合感染率为2.7%。同时猪场规模大小及其他风险因素对疾病的传播有一定的影响,表明并对阳性精液进行精子畸形率与精子密度的检测,结果显示PRRSV、CSFV为阳性的商品化精液和CSFV阳性的原精液在精子密度与精子畸形率上与阴性精液差别不显著,但其CSFV阳性原精液的精子密度明显小于阴性精液(p敏度高的PRRSV、CSFV及JEV实时定量PCR方法临床上可用于监测公猪精液带毒情况及其对精液品质的影响,为预测和控制疫病的流行提供技术支持。

关键词：精液猪繁殖与呼吸综合征猪瘟猪乙型脑炎荧光定量PCR

血管内皮生长因子C(VEGF-C)与胃癌淋巴转移关系的研究进展

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中国微创外科杂志 2009年第11期9卷 992-995页

作者：王婕敏周丽雅北京大学第三医院消化科北京100191

根据世界卫生组织(WHO)公布的数据[1],胃癌是世界范围内发病率居第四位的恶性肿瘤,每年新发病例达87万,虽然近十年西方国家的发病率逐年下降,但是其致死亡率仍居恶性肿瘤的第二位,仅次于肺癌,是全球公共健康的巨大威胁.淋巴转移是胃癌... 详细信息

根据世界卫生组织(WHO)公布的数据[1],胃癌是世界范围内发病率居第四位的恶性肿瘤,每年新发病例达87万,虽然近十年西方国家的发病率逐年下降,但是其致死亡率仍居恶性肿瘤的第二位,仅次于肺癌,是全球公共健康的巨大威胁.淋巴转移是胃癌的主要转移形式,也是影响预后的主要因素之一.

关键词：淋巴转移血管内皮生长因子胃癌世界卫生组织恶性肿瘤世界范围新发病例西方国家

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早期胃癌淋巴结转移规律及其影响因素分析

中华内科杂志 2010年第4期49卷 297-300页

作者：王婕敏周丽雅林三仁丁士刚北京大学第三医院消化科 100191

目的探讨早期胃癌淋巴结转移规律及其影响因素，为选择合适的治疗方法提供依据。方法对北京大学第三医院1988年3月——2009年3月于外科行胃癌根治术治疗的103例早期胃癌患者临床资料进行回顾性研究，对患者的年龄、性别，肿瘤的大小、... 详细信息

目的探讨早期胃癌淋巴结转移规律及其影响因素，为选择合适的治疗方法提供依据。方法对北京大学第三医院1988年3月——2009年3月于外科行胃癌根治术治疗的103例早期胃癌患者临床资料进行回顾性研究，对患者的年龄、性别，肿瘤的大小、部位、大体类型、分化程度及浸润深度与淋巴结转移的关系进行单因素及多因素分析。结果早期胃癌的淋巴结转移率为17．5％（18／103），其中黏膜内癌的淋巴结转移率为4．1％（2／49），黏膜下层癌的淋巴结转移率为29．6％（16／54）。logistie回归分析显示，浸润至黏膜下层（P=0．001）及肿瘤〉2cm（P=0．003）为早期胃癌淋巴结转移的独立危险因子。黏膜内癌发生淋巴结转移的2例均为直径〉2Om的印戒细胞癌；黏膜下层癌中，≤2cm肿瘤的淋巴结转移率为16．1％（5／31），〉2cm肿瘤的淋巴结转移率高达47．8％（11／23）（P=0．012）。高分化程度的早期胃癌的淋巴结转移率为0（0／13），中分化癌转移率为18．2％（4／22），低分化癌转移率为16．7％（5／30），印戒细胞癌转移率为23．7％（9／38），各组间差异无统计学意义（P=0．294）。患者的年龄、性别、肿瘤部位（胃上部、中部、下部）和大体分型（隆起型、平坦型和凹陷型）与淋巴结转移无相关性。结论肿瘤大小和浸润深度与早期胃癌淋巴结转移相关，决定早期胃癌治疗方案时，可参考上述因素判断淋巴结转移风险。

关键词：危险因素早期胃癌淋巴结转移治疗方式

猪繁殖与呼吸综合征的公猪感染情况和检测研究进展

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湖南畜牧兽医 2016年第2期 52-55页

作者：王婕敏张居作薛立群湖南农业大学动物医学院湖南长沙410128

猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)因其传播途径多,传播范围广并具有高度变异性,可通过抑制宿主免疫系统,造成混合感染,从而造成养猪业每年损失惨重。同时PRRSV能在公猪的精液中检测到,并影响公猪精液的质量,能通过配种途径感染母猪感染并... 详细信息

猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)因其传播途径多,传播范围广并具有高度变异性,可通过抑制宿主免疫系统,造成混合感染,从而造成养猪业每年损失惨重。同时PRRSV能在公猪的精液中检测到,并影响公猪精液的质量,能通过配种途径感染母猪感染并产下带毒仔猪,仔猪自身排毒污染环境引起连锁反应,造成巨大的经济损失。该病检测方法很多,其中荧光定量PCR(RT-FQ-PCR)具有敏感性高,重复性好,特异性强的特点,并能准确的检测出精液中的病毒含量,可作为PRRSV的主要检测方法。

关键词：猪繁殖与呼吸综合征荧光定量PCR 精液带毒

猪胎盘PPARγ编码序列的克隆、序列分析和表达

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中国兽医学报 2016年第8期36卷 1318-1323页

作者：张居作徐君飞薛立群谢杨聂昂王婕敏湖南农业大学动物医学院湖南长沙410128 怀化学院生命科学系湖南怀化418000

过氧化物酶增殖物激活受体r(peroxisome proliferator-activated receptor type gamma,PPARγ)对人和小鼠的胎盘形成起重要作用,但在猪胎盘中其编码序列和作用还不明确。为了掌握母猪胎盘PPARγ剪辑方式和准确的编码序列,分析其结构与... 详细信息

过氧化物酶增殖物激活受体r(peroxisome proliferator-activated receptor type gamma,PPARγ)对人和小鼠的胎盘形成起重要作用,但在猪胎盘中其编码序列和作用还不明确。为了掌握母猪胎盘PPARγ剪辑方式和准确的编码序列,分析其结构与功能的关系,应用高保真PCR技术从4个不同妊娠时期的7份胎盘样品(61个胎囊)克隆出了一致性的PPARγ目的片段(KM382175),其编码序列和预测蛋白序列与人、鼠、牛、羊的具有较高的相似性;同时发现胎盘PPARγ蛋白与猪卵巢来源和猪皮下脂肪来源PPARγ蛋白在配体结合区分别存在1个和2个氨基酸残基差异。构建pET28α(+)-PPARγ表达质粒,重组蛋白应用兔抗PPARγ和鼠抗His单克隆抗体2种抗体Western blot双重检测阳性。研究表明,妊娠期猪胎盘PPARγ剪辑方式一致(1 428bp),稳定的PPARγ结构对正常生理功能的维持具有重要意义,但配体结合区氨基酸的改变可能意味着组织差异性的存在;本研究同时实现了PPARγ的原核表达,将为进一步研究PPARγ对胎盘的作用及其与母猪产仔性能的关联性提供基础理论指导。

关键词：猪胎盘 PPARγ 序列分析

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胃癌研究及诊治新进展

胃肠病学和肝病学杂志 2012年第1期21卷 3-5页

作者：王婕敏林三仁北京大学第三医院消化科北京100191

胃癌病因的基础研究中发现基因调控异常及多态性,在胃癌发病中起到重要作用。人类表皮生长因子受体2(HER2)和血管内皮生长因子(VEGF)基因的突变和过表达,以及其下游信号转导通路的异常激动与胃癌的发生、转移显著相关,已经成为胃癌分子... 详细信息

胃癌病因的基础研究中发现基因调控异常及多态性,在胃癌发病中起到重要作用。人类表皮生长因子受体2(HER2)和血管内皮生长因子(VEGF)基因的突变和过表达,以及其下游信号转导通路的异常激动与胃癌的发生、转移显著相关,已经成为胃癌分子靶向治疗的靶点。幽门螺杆菌(H.pylori)与胃癌的关系已成定论,H.pylori相关的致病因子包括CagA、VacA和外膜蛋白(OMP)。有证据表明肿瘤本质是一种干细胞疾病,胃癌干细胞研究已经成为胃癌研究新热点。胃癌筛查是胃癌早期诊断的有效方法,目前学者推荐血清PG与H.pylori抗体联合检测作为胃癌筛查的初筛方法(ABC法),已使早期胃癌诊断率高达78%。内镜及病理活检技术取得了很大的进展,多种新型内镜技术已在临床应用,内镜下黏膜下剥离术(ESD)作为早期胃癌治疗的主要手段,已经受到广泛认可,内镜下病变整体切除率达到95%以上。胃癌分子靶向治疗的研究进展很快,很多相关药物已进入临床试验阶段,有望取得重大突破。

关键词：胃癌诊断治疗

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猪肝微粒体的制备与活性测定

黑龙江畜牧兽医 2013年第5期 136-138页

作者：田世杰刘兆颖唐昭山刘琪王婕敏朱若岑伍勇孙志良湖南农业大学动物医学院长沙410128 湖南农业大学东方科技学院长沙410128

为了获得高活性的猪肝微粒体用于药物代谢研究,试验采用钙沉淀法制备猪肝微粒体,考马斯亮蓝法测定肝微粒体蛋白浓度,可见光-紫外分光光度法测定肝微粒体细胞色素P450酶系含量。结果表明:猪肝微粒体的蛋白含量为(10.653±0.256)mg/g,细... 详细信息

为了获得高活性的猪肝微粒体用于药物代谢研究,试验采用钙沉淀法制备猪肝微粒体,考马斯亮蓝法测定肝微粒体蛋白浓度,可见光-紫外分光光度法测定肝微粒体细胞色素P450酶系含量。结果表明:猪肝微粒体的蛋白含量为(10.653±0.256)mg/g,细胞色素P450含量为(0.903±0.021)nmol/mg,细胞色素b5含量为(0.429±0.038)nmol/mg,氨基比林-N-脱甲基酶活性为(0.226±0.010)μmol/(min.mg),红霉素-N-脱甲基酶活性为(0.055±0.008)μmol/(min.mg),NADPH-细胞色素C还原酶活性为(4.658±1.170)nmol/(min.mg)。说明钙沉淀法制备的猪肝微粒体具有较好的活性,所用的可见光-紫外分光光度法灵敏、可靠,重复性较好。

关键词：猪肝微粒体钙沉淀法可见光-紫外分光光度法细胞色素P450

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莱克多巴胺对小鼠热敏感性的影响

畜牧兽医科技信息 2012年第9期28卷 24-25页

作者：王婕敏文荻琛曲凌玄湖南农业大学动物医学院长沙410128

目的研究莱克多巴胺的镇痛作用。方法:以小鼠为实验对象,热刺激反应出现时间为指标。小鼠40只,体重20～40g,随机分为A、B、C、D四组,分别饮用自来水、20mg/kg、200mg/kg和2000mg/kg莱克多巴胺水溶液。结果:和对照组相比,B、C、D三组小... 详细信息

目的研究莱克多巴胺的镇痛作用。方法:以小鼠为实验对象,热刺激反应出现时间为指标。小鼠40只,体重20～40g,随机分为A、B、C、D四组,分别饮用自来水、20mg/kg、200mg/kg和2000mg/kg莱克多巴胺水溶液。结果:和对照组相比,B、C、D三组小鼠痛阈逐渐提高,说明莱克多巴胺具有镇痛作用,镇痛效果与剂量呈正相关。

关键词：莱克多巴胺镇痛热刺激

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湖南口岸进口盐渍生牛皮检疫处理效果评价

湖南畜牧兽医 2012年第5期 3-6页

作者：王婕敏徐鹏刘峰陈鑫黄迎波袁晓芬陈天印湖南农业大学湖南长沙410128 湖南出入境检验检疫局湖南长沙410004

为了全面了解硫酰氟熏蒸对进口生皮携带病媒生物的检疫处理效果,对口岸集装箱内的进口生皮检疫处理前后成蝇死亡情况进行观察,对蝇蛹、蛆杀灭情况进行孵化培养和对比分析。结果表明,(1)熏蒸前蛹、蛆均有较高的孵化率,熏蒸后蛹、蛆的孵... 详细信息

为了全面了解硫酰氟熏蒸对进口生皮携带病媒生物的检疫处理效果,对口岸集装箱内的进口生皮检疫处理前后成蝇死亡情况进行观察,对蝇蛹、蛆杀灭情况进行孵化培养和对比分析。结果表明,(1)熏蒸前蛹、蛆均有较高的孵化率,熏蒸后蛹、蛆的孵化率相对低;(2)硫酰氟对集装箱内活蝇杀灭作用明显有效,对蛹、蛆有部分杀灭作用,对积水中蛹、蛆杀灭作用有限;(3)熏蒸前不同取样部位与试验结果无相关性。并提出了加强对进口盐渍生皮的风险分析和分类管理、继续开展检疫处理评价、开展加工厂蝇类本底调查等建议措施。

关键词：湖南口岸进口生皮检疫处理效果评价