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酿酒酵母不同特性杂合启动子的构建与分析

酿酒酵母不同特性杂合启动子的构建与分析

作者：王佳静山东大学

学位级别：硕士

启动子在基因表达调控中起着不可替代的重要作用,是最重要的表达调控元件之一。目前在酿酒酵母中常用的天然启动子通常分为组成型启动子和诱导型启动子。但天然启动子的表达强度相对有限,即使是目前报道的最强的启动子常常也达不到研究... 详细信息

启动子在基因表达调控中起着不可替代的重要作用,是最重要的表达调控元件之一。目前在酿酒酵母中常用的天然启动子通常分为组成型启动子和诱导型启动子。但天然启动子的表达强度相对有限,即使是目前报道的最强的启动子常常也达不到研究的需求;此外,诱导型启动子通常需要诱导剂的添加,而可以自动响应生长状态的变化而诱导基因表达的启动子的研究也较少,不能满足代谢工程及合成生物学的需求,因此,对启动子的研究和改造对于人们更好的调节基因的表达具有重要的意义。为了解决这些问题,我们的工作主要从以下两个方面展开:1、组成型杂合启动子的构建与分析天然组成型启动子,即使是最强的启动子如TEF1启动子等也常常不能满足表达的需求,且常用的启动子的表达强度的范围较窄,因此,我们利用上游激活元件（Upstream Activation Sequence,UAS）的串联,和核心元件的调试,构建了一系列具有不同启动强度的杂合启动子。首先,我们选取了 10个来源于组成型启动子的UAS元件,与CYC1启动子来源的核心元件组装,利用黄色荧光蛋白作为报告基因检测启动子的转录强度。通过荧光测定,选取出表达强度较高的UAS元件 UASYEF3,UASTEF1,UASENO2,UASTpI1 和 UASTDH3。然后,再将筛选出的UAS元件进行杂合组装,或者将相同UAS元件进行串联。荧光测定发现,两个UAS串联或组合后,绝大多数启动子的转录能力都有了明显的提高,但是三个UAS串联或组合后,只有UASENO2的串联重复,进一步提高了启动子的启动强度,其他UAS的串联或组合,均未使启动子的强度进一步提高,这可能与UAS和转录起始位点的距离有关,但具体原因还需要进一步分析。接下来,我们选取了 4个启动子的核心元件,包括PTEF1,PTDH3,PGAL1和PCYC1,与UASENO2进行组装,测定发现PTEF1核心元件具有最高的转录强度。因此,我们将启动强度较高的杂合启动子的核心元件替换为PTEF1。荧光结果显示,替换核心元件后,这些杂合启动子的启动强度都有了进一步的提高,提高幅度大约为1倍。其中,杂合启动子UASENO2-PTEF1具有最高的启动强度,大约是之前文献构建的强杂合启动子p41 6mcstefcit3x的1.4倍,为目前报告的最强的杂合启动子之一。2、生长状态自动调控杂合启动子的构建与分析当表达具有毒性的蛋白,或者一些途径的持续表达会对细胞生长造成负担时,则不能选择组成型表达的方式,需要先维持细胞生长,待细胞生长到一定程度后,再启动相关基因的表达,这时通常需要利用诱导型启动子来实现调控。但是,常用的诱导型启动子需要诱导剂的添加,增加了生产成本,不利于真正工业应用。而受生长状态调控的自动诱导型启动子,在无需添加任何诱导物的条件下,可感应细胞的生长状态自动启动表达,从而实现细胞增殖与产物积累的分开。但目前天然的受生长状态调控的自动诱导型启动子即使在诱导条件下,转录能力也弱于组成型启动子,这限制了其广泛应用。本节研究选取了受葡萄糖抑制的启动子PHXK1,PM4AL32的UAS元件,低pH值响应的启动子PCWP2的UAS元件,以及热激胁迫响应的启动子PSSA1,PSSA3和PHSP30的UAS元件,与CYC1启动子的核心元件组装,构建杂合启动子。其中,UASHSP30-Pcyc1、UASMAL32-PCYC1和UASSSA3-PCYC1启动子在葡萄糖存在时,也就是细胞生长旺盛的对数期,受到抑制,转录活力很低,甚至低于PCYC1核心元件;但当葡萄糖耗尽,细胞进入二次生长期后,转录活力显著增强,提高了 2-6倍。UASSSA1-PCYC1的转录活性在细胞生长的后期也比指数生长期强,不过其指数生长期的本底转录活力也相对较高（高于PCYC1）。为进一步提高这些启动子的强度,我们将核心启动子替换为PTEF1的核心元件,发现,这些启动子的转录活力又进一步提高2-3倍。其中UASSSA1-PTEF1的转录活力最高,与UASTPI1-Pcyc1 相当。而 UASHSP30-PTEF1 和 UASMAL32-PTEF1启动子的转录活性在细胞生长的后期比指数生长期提高了 3-6倍,实现了感应细胞生长状态,自动诱导的高效表达。综上所述,通过串联UAS元件以及替换核心元件的组装策略,我们构建了两类杂合启动子:组成型杂合启动子和生长状态自动调控杂合启动子。这些启动子的构建不仅丰富了目前启动子的启动强度,而且生长状态自动诱导型杂合启动子的构建,也为需要生长阶段控制的表达调控的实现,提供了可能。

关键词：酿酒酵母杂合启动子 UAS元件核心元件

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新型抗肿瘤药物研发/生产的科学监管

上海医药 2022年第S2期43卷 121-125页

作者：王佳静曹萌张景辰上海药品审评核查中心上海201210

新型抗肿瘤药一直是新药研发最为活跃也集中度最高的领域,这类小分子靶向药物和大分子单克隆抗体药物在给患者提供积极有效治疗方案的同时,也面临着靶点过于集中导致的研发扎堆以及临床试验科学性屡受质疑等诸多问题;另一方面,近年来不... 详细信息

新型抗肿瘤药一直是新药研发最为活跃也集中度最高的领域,这类小分子靶向药物和大分子单克隆抗体药物在给患者提供积极有效治疗方案的同时,也面临着靶点过于集中导致的研发扎堆以及临床试验科学性屡受质疑等诸多问题;另一方面,近年来不断涌现的细胞和基因治疗技术、新型递送技术等创新技术,升级定义了“新型抗肿瘤药物”的概念,引发了全球新一轮的研发热潮。如何鼓励源头创新、合理引导此类药物研发方向和药物临床试验的科学开展,如何正面迎接这些新兴技术对原有的监管框架要求和技术评价体系的挑战,进而科学评价和监管此类新兴技术产品,是全球药品监管部门近年来一直探索的问题。本文通过对于全球新型抗肿瘤药物研发和生产现状和面临问题的分析,梳理目前国内外监管部门应对此类挑战的技术层面科学监管措施和思路,以期为后续新型抗肿瘤药物的研发和生产提供一定的方向性建议,也为监管科学研究提供借鉴和参考。

关键词：新型抗肿瘤药物科学监管新兴技术研发与生产监管科学

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旅行社服务承诺对游客抱怨行为影响研究

旅行社服务承诺对游客抱怨行为影响研究

作者：王佳静东北财经大学

学位级别：硕士

近些年来随着我国产业结构发生的重大变化,服务业的重要地位逐渐凸显出来。旅游作为典型的服务行业,导游与游客较一般的服务接触时间长,在服务的传递过程中,难免会出现服务失误：服务的无形性、生产消费的同时性等特点也决定了实现服务... 详细信息

近些年来随着我国产业结构发生的重大变化,服务业的重要地位逐渐凸显出来。旅游作为典型的服务行业,导游与游客较一般的服务接触时间长,在服务的传递过程中,难免会出现服务失误：服务的无形性、生产消费的同时性等特点也决定了实现服务零缺陷是不可能的：一旦发生服务失败,游客心理产生巨大的落差,就会引发不满的情绪,最终导致抱怨行为,其中只有直接投诉行为能够帮助旅行社发现并及时的解决问题,同时有利于服务质量的改善;而负面口碑和沉默抵制行为都会影响企业声誉的建设、忠诚顾客的培养。那么如何主动有效地管理游客的抱怨行为成为旅行社迫切需要解决的问题。通过对相关文献整理发现,过去曾有学者指出实施服务承诺有利于激发游客的投诉热情,但将二者放入一个框架中进行的实证研究还很欠缺。故本文从一个新的视角,在服务失败与补救情景下,探究不同旅行社服务承诺（无服务承诺、多属性适度服务承诺及无条件服务承诺）对游客抱怨行为的作用效果,同时考虑了不同服务失败程度与企业声誉的干扰作用。寄希望通过本文的研究理清旅行社服务承诺对游客抱怨行为影响的一般规律,填补理论上的空白,为旅行社事前控制游客抱怨行为提供指导意见。本文在前测问卷的基础上设计了12种不同情景的调查问卷共360份,向被调查者随机发放,最后收集有效问卷303份。运用SPSS16.0统计软件对收集的数据进行分析,结论如下： 1.总体上旅行社实施服务承诺能够增强游客抱怨期望,但影响效果不显著。同时实施服务承诺能够显著降低游客的抱怨风险感知。 2.总体上旅行社服务承诺能够有效增加游客直接投诉、减少沉默抵制行为;但对游客负面口碑行为没有显著影响。 3.服务承诺的实施效果受企业声誉与服务失败程度的影响。企业声誉高的旅行社发生服务失败发生后,实施服务承诺特别是多属性适度承诺能够增强游客的抱怨期望和直接投诉行为,降低抱怨风险感知和沉默抵制行为;企业声誉低的旅行社,服务失败不严重时,服务承诺的作用趋势与声誉高的旅行社相同,但是服务失败严重时,反而会有反向作用,降低游客抱怨期望和直接投诉行为,增加抱怨风险感知和沉默抵制行为,因此,企业声誉低的旅行社当服务失败严重时,实施服务承诺并非最佳的管理游客抱怨行为的手段。全文按照研究逻辑分为五个部分,具体内容如下：第一章绪论;通过研究背景及动机的分析,发现研究意义,最终确立了研究的目的与框架。第二章相关文献综述：对国内外关于服务承诺、顾客抱怨行为及二者相关理论研究进行评述,总结当前的研究成果与发展趋势,发现理论上的空白,从而确定本文的研究选题。第三章研究设计;确定本文研究的概念框架与假设,通过前测问卷为实验设计提供12组情景模拟假设并设计正式调查问卷。第四章数据收集与假设检验;收集问卷,运用SPSS16.0统计软件,进行描述性统计分析,实验操作性检验及验证所提出的研究假设。第五章研究结论与展望;通过上章的分析得出本文的研究结论,并为旅行社管理游客抱怨行为提供指导性建议,最后提出了本文的不足及展望。

关键词：服务承诺抱怨期望抱怨风险感知游客抱怨行为

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基于供应链的天润乳业营运资金管理研究

基于供应链的天润乳业营运资金管理研究

作者：王佳静湖南科技大学

学位级别：硕士

企业营运资金是最能代表企业周转能力以及企业流动率的资金,营运资金应用在生产经营活动的方方面面,是保证企业能顺利运行的基础。市场竞争越来越激烈,营运资金管理也逐渐成为公司财务管理的重中之重,慢慢的从单一项目的管理转向系统性... 详细信息

企业营运资金是最能代表企业周转能力以及企业流动率的资金,营运资金应用在生产经营活动的方方面面,是保证企业能顺利运行的基础。市场竞争越来越激烈,营运资金管理也逐渐成为公司财务管理的重中之重,慢慢的从单一项目的管理转向系统性和整体性的管理,营运资金管理也逐渐与渠道理论、价值链理论等相结合。由此,供应链管理理论与营运资金管理理论的结合,是公司营运资金管理重心从―资金‖向―营运‖,从―财务‖向―业务‖的改变。基于供应链的营运资金管理,企业应当从供应链的角度探究如何优化供应链结构,同时也要考虑供应链中各企业之间的关系,从本质上提高企业营运资金的运转能力。乳制品行业是一个有自身特色的行业,也是一个与居民基本生活关系密切而受到争议的行业。乳制品行业供应链特征独特,乳制品生产全程冷链管理系统应用、原材料采购战略在供应链管理中的地位、乳制品加工企业与奶农的利益博弈以及乳制品加工企业纵向整合供应链的趋势等特点,这些都对营运资金管理提出了更多的要求。本文通过运用营运资金管理理论和供应链管理理论,同时将企业战略与乳品行业供应链的营运资金管理理论相结合,概括乳制品行业其供应链特点和营运资金管理的现状。从上述理论基础,首先概括公司战略整体性的影响,然后分析原材料采购战略、产品战略、分销战略分别对采购渠道、生产渠道、销售渠道的影响,联合供应链的其他要素判断其对营运资金管理的作用;文章以天润乳业作为案例,将天润乳业与行业平均以及其他的乳制品上市企业的业绩进行对比分析,从营运资金管理绩效的基础上分析,运用企业战略分析以及供应链的各个渠道分析,总结了在供应链基础上营运资金管理的特点和待提升之处:从总的企业战略来看,企业要依据公司情况的发展制订合适的企业战略,同时依据企业战略改变供应链的各个渠道营运资金管理的措施:从采购环节来看,加强企业自有牧场建设,同时采购高质量的进口原料奶以生产高档产品,与供应商建立稳定关系,运用信息技术加强采购管理;从生产环节来看,天润乳业越来越重视研发支出,不断地投入领先生产技术,开发新产品,提髙生产效率,加快物料周转率;从销售环节来看,营运资金管理绩效仍待提升,天润乳业要加强重视与客户之间的管理,在多元化的分销渠道的基础上加快全国销售渠道的布局,制定合理的应收账款信用政策。最后,从天润乳业的企业案例分析中得出优化建议,为我国乳制品加工行业的营运资金管理提供一定的借鉴作用。

关键词：营运资金管理供应链天润乳业

从平底瓶到尖底瓶--黄河中游新石器时期酿酒器的演化和酿酒方法的传承

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中原文物 2020年第3期 94-106页

作者：刘莉王佳静邸楠美国斯坦福大学东亚语言与文化系美国斯坦福大学考古中心陕西省考古研究院陕西西安710054

根据以往的类型学分析,仰韶文化的小口尖底瓶是从小口平底瓶发展而来,而后者的前身是小口鼓腹罐。近年来多项研究已经证明尖底瓶和鼓腹罐都是酒器,但不清楚平底瓶是否也具有酿酒功能。为了回答这一问题,我们对陕西临潼零口遗址出土的20... 详细信息

根据以往的类型学分析,仰韶文化的小口尖底瓶是从小口平底瓶发展而来,而后者的前身是小口鼓腹罐。近年来多项研究已经证明尖底瓶和鼓腹罐都是酒器,但不清楚平底瓶是否也具有酿酒功能。为了回答这一问题,我们对陕西临潼零口遗址出土的20件零口期平底瓶和半坡期尖底瓶陶片进行了残留物分析,发现具有酿酒发酵特征的淀粉粒、谷物颖壳和植物茎叶及花序的植硅体,以及酵母细胞,证明这两种器物都是酒器。酿酒方法是以发芽的黍、稻谷和野生小麦族作为糖化剂来酿造谷芽酒;最主要的原料是黍,同时也包括粟、薏苡、水稻、小麦族、野豌豆、栝楼根、芡实及姜;另外还加入一些植物茎叶及花序。加入植物块根、茎叶和花序的目的,也许是利用其药用功能。使用芦苇吸管咂酒可能是当时饮酒的方法之一。零口陶器的分析结果有助于研究黄河中游地区新石器时代早、中期酒器器形的演化以及酿酒方法的传承。

关键词：零口遗址零口期文化仰韶文化谷芽酒酿酒方法酒器

适用于嵌入式五口SRAM的多频率内建自测电路

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固体电子学研究与进展 2003年第3期23卷 270-275页

作者：华林王佳静俞军章倩苓复旦大学专用集成电路与系统国家重点实验室上海200433

提出了一种多频率带有扫描链的 BIST方案 ,用于五口的 32× 32嵌入式 SRAM的可测性设计。分析了多口 SRAM的结构并确定其故障模型 ,在此基础上提出了一种名为“对角线移动变反法”( OMOVI)的新算法及其电路实现。与传统的“移动变反法”... 详细信息

提出了一种多频率带有扫描链的 BIST方案 ,用于五口的 32× 32嵌入式 SRAM的可测性设计。分析了多口 SRAM的结构并确定其故障模型 ,在此基础上提出了一种名为“对角线移动变反法”( OMOVI)的新算法及其电路实现。与传统的“移动变反法”( MOVI)相比 ,在保证故障覆盖率前提下 ,测试图形的测试步数由原来的12 N log2 N减小为 N/ 2 +2 N log2 N( N为 SRAM的容量 )。该方案集功能测试、动态参数提取和故障分析定位于一体。

关键词：嵌入式SRAM 多频率内建自测电路寄存器堆扫描链可测性设计存储器

固相萃取-毛细管气相色谱法测定黄芪中多种有机氯农药残留量

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药物分析杂志 2007年第7期27卷 1113-1118页

作者：邓鸣郭青王佳静伍乃英王玉中国药科大学药学院南京210008 江苏省药品检验所南京210009

目的:建立黄芪中20种有机氯农药残留量的固相萃取——毛细管气相色谱(SPE-CGC)分析方法。方法:样品以乙酸乙酯超声波提取,弗罗里硅土固相萃取快速净化提取物。采用 DB-1701与 DB-5弹性石英毛细管柱分离样品,GC-ECD 检测黄芪药材中20种... 详细信息

目的:建立黄芪中20种有机氯农药残留量的固相萃取——毛细管气相色谱(SPE-CGC)分析方法。方法:样品以乙酸乙酯超声波提取,弗罗里硅土固相萃取快速净化提取物。采用 DB-1701与 DB-5弹性石英毛细管柱分离样品,GC-ECD 检测黄芪药材中20种有机氯农药的残留量。以保留时间定性,标准曲线定量。结果:20种农药的峰面积与其质量浓度均有良好的线性关系,相关系数均大于0.995。最小检测量为0.020～0.299ng·mL^(-1),农药的三个水平添加回收率都在74%～110%之间,相对标准偏差在3.5%～15%之间。结论:该法简便快速、灵敏准确,可用于各类中草药有机氯农药残留量测定。

关键词：毛细管气相色谱法固相萃取黄芪有机氯类农药

浙江浦江上山遗址打制石器微痕与残留物初步分析

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南方文物 2016年第3期 117-121页

作者：王佳静蒋乐平美国斯坦福大学东亚语言文化系浙江省文物考古研究所

本研究对上山遗址上山文化时期的部分石片石器进行了微痕和残留物的初步分析。结果显示,这些打制石器的功能包括收割水稻、芦苇、莎草等植物,也有用于竹木加工等多功能用途。水稻从野生到驯化是一个漫长的过程,历经数千年。收割行为是... 详细信息

本研究对上山遗址上山文化时期的部分石片石器进行了微痕和残留物的初步分析。结果显示,这些打制石器的功能包括收割水稻、芦苇、莎草等植物,也有用于竹木加工等多功能用途。水稻从野生到驯化是一个漫长的过程,历经数千年。收割行为是是人类对植物干预并促使其进化产生的方式之一。本文结论与之前的关于水稻植硅体和小穗轴形态学的研究相符,说明在上山文化时期人类已经利用工具对水稻进行收割及利用。同时,本文也对中国南方更新世晚期出现的典型小型石片石器提供了新的研究视角。

关键词：水稻起源农业起源打制石器上山文化植硅体微痕分析

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葡萄糖激酶激动剂的研究进展

中国药物化学杂志 2012年第1期22卷 68-73页

作者：解鹏王佳静李建其上海医药工业研究院上海200437

糖尿病是一种多发的慢性代谢性疾病,对于2型糖尿病,目前临床上主要是采取注射胰岛素来控制糖尿病,至今还没有较为理想的治疗药物。葡萄糖激酶(glucokinase,GK)在促进肝糖合成和降低促使胰岛素释放的葡萄糖调定点两个方面发挥着重要作用... 详细信息

糖尿病是一种多发的慢性代谢性疾病,对于2型糖尿病,目前临床上主要是采取注射胰岛素来控制糖尿病,至今还没有较为理想的治疗药物。葡萄糖激酶(glucokinase,GK)在促进肝糖合成和降低促使胰岛素释放的葡萄糖调定点两个方面发挥着重要作用,进而控制着体内葡萄糖水平的稳定。近年来,关于GK的研究倍受关注,已成为抗糖尿病药物研究的热点之一,GK激动剂有望成为新一代治疗2型糖尿病的药物。该文对近几年报道的小分子GK激动剂进行简要综述。

关键词：葡萄糖激酶激动剂 2型糖尿病构效关系