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microRNA-21参与锶促细胞成骨分化及外泌体提取方法改良

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microRNA-21参与锶促细胞成骨分化及外泌体提取方法改良

作者：王仁峰天津医科大学

学位级别：硕士

目的:锶(Sr)是人体内一种重要的微量元素,在元素周期表中与钙同族,具有相似的化学性质。作为骨的重要成分,由于具有促进骨生成和抑制骨吸收的双重作用,锶及相关生物材料在骨质疏松治疗及骨缺损填充中的应用受到高度关注,比如雷奈酸锶广... 详细信息

目的:锶(Sr)是人体内一种重要的微量元素,在元素周期表中与钙同族,具有相似的化学性质。作为骨的重要成分,由于具有促进骨生成和抑制骨吸收的双重作用,锶及相关生物材料在骨质疏松治疗及骨缺损填充中的应用受到高度关注,比如雷奈酸锶广泛的应用于预防和治疗骨质疏松。到目前为止,关于锶作用机制的探讨已经深入到分子层次,包括:锶与细胞膜上的钙受体或其它受体结合,激活细胞内信号通路,调节细胞分化和成熟行为,进而促进骨基质的合成等,但锶具体作用机制,仍需要进一步完善。近年来研究发现miRNA是调控成骨分化的重要转录后调节因子,对成骨细胞的分化发育具有重要调控作用,包括正性和负性双重调节作用,但miRNA这一重要转录后调节因子是否也在锶促进成骨分化机制中发挥作用尚不明确。本课题就锶促进细胞成骨分化过程中miRNA-21表达变化以及其在锶促进成骨分化过程中的作用加以探讨。外泌体(exosome)是具有脂质双层结构的膜源性小囊泡,直径多介于30-100 nm,可以由多种细胞合成。外泌体内含有不同种类的micro RNAs、蛋白质、脂质、m RNAs、t RNAs、信号分子等生物学活性物质,易与邻近细胞膜发生融合,将生物学活性物质选择性地递呈至受体细胞,从而完成信息传递,调节细胞间的信号传导,发挥生物学功能。锶促进成骨分化过程中,外泌体是否也发挥重要调控机制尚不清楚,而获得高纯度、无丢失的外泌体样本是进一步探寻该机制的研究基础。因此本课题同时就外泌体提取方法的改良比较进行探讨,为外泌体深入研究奠定基础。方法:一、采用不同浓度(0,1,3,6,9,12 mM)的氯化锶(SrCl)溶液对小鼠前成肌细胞C2C12进行成骨诱导72h,MTT法检测不同浓度锶对细胞增殖的影响作用,确定适宜的锶诱导浓度;实验组以1mM和3mM锶诱导C2C12细胞,对照组培养条件与实验组相同,但不加锶诱导,72h后分别提取细胞总蛋白和总RNA,以蛋白免疫印迹(Western blotting,WB)检测成骨标志phospho1蛋白表达水平变化,以实时荧光定量PCR法检测phospho1以及micro RNA-21基因表达情况;同时,实验组和对照组细胞均培养7d后,进行碱性磷酸酶(ALP)染色;对C2C12细胞转染miR-21 inhibitor,6h后加入3mM锶诱导72h,检测phospho1基因以及蛋白表达情况;以PI3K/AKT信号通路抑制剂LY294002对细胞预处理2h,随后加入3mM锶诱导72h,检测phospho1基因及蛋白表达水平改变。二、分别用ExoQuick试剂盒及改良方法、超速离心法提取血清外泌体。利用透射电镜对外泌体进行形态学观察;样本进行2,2-联喹啉-4,4-二甲酸二钠(BCA)法蛋白定量;Western blotting检测外泌体表面标志物CD63;十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析样本蛋白表达差异。结果:一、MTT结果显示,低浓度锶(1,3mM)诱导细胞后,其增殖情况与对照组相比无明显差异(p>0.05),而较高浓度的锶(6,9,12mM)对细胞增殖具有一定的损害作用(p<0.05),因此本课题采用低浓度锶诱导C2C12细胞成骨分化;分别以1mM和3mM锶对C2C12细胞诱导72h后,phospho1基因和蛋白表达均升高(p<0.05),且3mM锶对C2C12细胞的诱导成骨分化作用较1mM锶明显;同时检测小RNA miR-21发现,其表达也较对照组明显上调(p<0.05);对C2C12细胞进行miR-21 inhibitor转染后,锶促进成骨作用消失,phospho1基因以及蛋白表达明显下调(p<0.05);以PI3K/AKT通路抑制剂LY294002对细胞预处理后,同样抑制了锶对C2C12的诱导成骨作用,phospho1基因和蛋白表达水平下降。二、ExoQuick试剂盒及改良方法、超速离心法均可获得血清exosome,电镜下可观察到圆形或椭圆形膜性囊泡结构;传统超速离心法提取样本蛋白浓度显著低于ExoQuick试剂盒法及其改进方法(P<0.05);SDS-PAGE显示三种方法提取样本蛋白表达强度及丰度存在差异;western blotting表明三种方法提取的外泌体均表达表面特异性标志物CD63,且含同浓度蛋白的情况下,ExoQuick Precipitation及改良法其CD63含量明显高于传统超速离心法。结论:一、低浓度的锶对细胞无明显毒性且具有明显的促成骨作用。结果表明,锶可通过上调miR-21促进PI3K/AKT通路活化以促进促成骨因子phsopho1的表达促进细胞成骨。二、ExoQuick试剂盒及改良方法、超速离心法均能提取血清中外泌体,ExoQuick试剂盒法及改良方法具有更高的提取外泌体效率,同时改进方法能够有效

关键词：锶成骨分化 miR-21 phospho1 外泌体

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基于资源评价的匿名P2P信任模型的研究

基于资源评价的匿名P2P信任模型的研究

作者：王仁峰大连海事大学

学位级别：硕士

在信息化不断发展的今天,对等网络(P2P)作为一种优势显著的网络结构已经成为不可或缺的网络应用系统。P2P在文件共享、协同计算等领域都有着广泛的应用,并且具有较大的发展空间。尤其是在网络文件共享领域,开放性、自治性、匿名性等特... 详细信息

在信息化不断发展的今天,对等网络(P2P)作为一种优势显著的网络结构已经成为不可或缺的网络应用系统。P2P在文件共享、协同计算等领域都有着广泛的应用,并且具有较大的发展空间。尤其是在网络文件共享领域,开放性、自治性、匿名性等特点使得数据共享变得更加高效,但较高的开放性导致了网络资源的虚假性、网络数据的滥用以及严重的恶意攻击行为,最终导致资源的低可信度。为解决P2P中资源滥用并有效抵抗攻击问题,本文采用资源评价的手段在P2P系统中建立起有效的信任评价机制,通过综合考量共享资源节点的信誉度以及资源本身的满意度值,保证了网络交易行为的高可靠性。本文对现有文件共享P2P网络信任模型进行了深入的研究,仔细分析了多种信任模型的信任机制,考虑典型信任模型的优缺点,提出了一种高可靠性、高效率的P2P信任模型。相较以往的基于共享节点的交互评价以及只将共享节点作为信任计算主体的一般信任建模方式,本文模型将交互评价对象主体从共享节点转移到了共享资源本身。通过对资源本身的满意度值计算,间接作用到共享资源的节点,有效避免了资源质量受共享节点单向决定的局限性。在计算效率方面,通过综合考虑节点历史评价行为的有效评价反馈,以及节点共享资源的综合满意度值,迅速得到节点可靠的信誉度,降低了传统信任模型迭代运算的复杂性。在安全性方面,由于评价计算主体的转化,将可信的概念一部分移植到资源本身。同时通过CAN(Content Addressable Networks)机制的改进与实现,结合MIX技术的思想,将模型交易关系匿名化,从根源限制了虚假、恶意资源的传播,有效抵抗了资源共享环境中常见的恶意攻击行为。该模型同时提出了有效的激励机制,鼓励网络节点积极地参与资源共享,同时对恶意行为给予有效的惩罚,很好地抑制了虚假资源在网络中的传播。通过仿真实验,有效证明本文模型在交易可靠性以及抵抗恶意攻击行为等方面的性能提高。

关键词： P2P网络信任模型节点评价资源评价匿名

反流对食管粘膜细胞凋亡相关因子作用的实验研究

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反流对食管粘膜细胞凋亡相关因子作用的实验研究

作者：王仁峰河北医科大学

学位级别：硕士

目的:本实验通过建立反流性食管炎(Reflux Esophagitis,RE)动物模型(单纯酸反流、混合反流)及假手术动物模型,观察各模型组动物存活情况及食管标本肉眼表现,食管标本组织学检测,并应用免疫组织化学方法检测TNF-α、Caspease-3、Survivi... 详细信息

目的:本实验通过建立反流性食管炎(Reflux Esophagitis,RE)动物模型(单纯酸反流、混合反流)及假手术动物模型,观察各模型组动物存活情况及食管标本肉眼表现,食管标本组织学检测,并应用免疫组织化学方法检测TNF-α、Caspease-3、Survivin的表达情况。探讨反流对食管下段粘膜细胞凋亡相关因子作用的研究,为临床防治胃食管反流性疾病提供试验性理论依据。方法:选择健康雄性SD大鼠200只,体重(220-280)克,随机分为三组:假手术组(A组)40只,单纯酸反流组(B组)80只,混合反流组(C组)80只。反流模型制备成功后,分别于术后第20、24、28、32周各组随机选取8只大鼠分三批颈椎离断处死,后立即取出大鼠食管组织,用苏木素伊红(HE)染色,光镜下观察各组大鼠食管粘膜上皮病理变化,采用免疫组织化学方法测定食管粘膜上皮TNF-α、Caspease3、Survivin的表达。实验结果均以均数±标准差( x±s)表示,各组间比较采用单因素方差分析,组内比较采用t检验,应用SPSS11.5统计分析软件对实验数据进行统计学处理,P<0.05为有统计学意义。结果:术后B组与C组大鼠体重明显下降,与对照组有明显差异(P<0.01);术后20天,存活大鼠大部分体重恢复到术前水平,饮食、活动基本正常,体重逐渐增长,但与假手术组比较增长较慢。大鼠死亡时间多发生在术后一个月内,死亡原因多因术后进食伤口感染、出血、吻合口瘘、腹腔感染、肺部感染等多种原因引起。大体观察:A组大鼠食管颜色淡红,有光泽,粘膜光滑;B组大鼠模型20周时部分大鼠出现食管颜色变淡白,粘膜稍粗糙,随时间延长出现病变的大鼠数量增多,粘膜增厚及粗糙感亦加重;C组大鼠模型与B组大鼠模型相比:病变表现较同期B组大鼠明显加重,24周时部分大鼠食管扩张,可见粘膜层出现点状糜烂,粘膜增厚亦明显;28周时病变大鼠数量增多,食管粘膜明显增厚,粘膜皱襞灰白色斑块加重,导致食管粘膜凹凸不平。32周时灰白色斑块明显隆起,呈脑沟回状,与食管的长轴平行。光镜下观察,HE染色,A组大鼠食管各层结构完整,粘膜厚薄适中,粘膜表面可见较少的角化。B组大鼠模型随时间延长,粘膜层逐渐增厚,基底细胞层及棘细胞层细胞数目增多,角化层逐渐增厚,32周时可见粘膜层表层出现小的糜烂;C组大鼠模型病变表现较同期B组大鼠明显加重,除出现上述病变外,24周时部分大鼠食管局部粘膜基底细胞层明显增生,部分粘膜组织向外呈乳头样突起,棘细胞层细胞层次明显增加,出现颗粒层细胞增加,细胞角化现象逐渐明显;随造模时间延长,粘膜明显增生的范围不断增大,从食管与十二指肠及胃吻合口手术部位逐渐发展至食管中段乃至上段,乳头样突起亦明显增多;与此同时,贲门部胃黏膜上皮发生肠上皮化生,杯状细胞明显增多。28周时部分模型大鼠食管粘膜明显增生区向外膨出形成乳头状瘤,粘膜表面有大量的不完全角化;部分区域上皮角向粘膜下层插入,基底细胞增生明显;发生不典型增生,并可见散在的单个细胞浆嗜酸性增强,细胞核固缩。此三者皆为食管鳞状细胞癌的癌前病变表现。C组32周时上述病变进一步加重,但仍未出现典型的食管鳞状细胞癌病变。免疫组化:在A组各时间点,TNF-α蛋白在棘细胞层可见微弱的阳性表达。B组、C组TNF-α蛋白的表达呈逐渐增加趋势;与同期B组相比,28、32周C组大鼠模型TNF-α蛋白的表达明显增加(P<0.05)。Caspease-3正常对照组的基底细胞层及棘细胞层细胞中有基础阳性表达,B组、C组随造模时间延长,阳性细胞表达率逐渐升高,阳性细胞的表达也从基底细胞增加至棘细胞层乃至全层;C组与同期B组大鼠模型相比,第28、32周粘膜阳性细胞表达率明显升高(P<0.05)。在正常对照组各时间点,Survivin蛋白均未见阳性表达, 20周时B组各动物食管粘膜层内未见细胞核Survivin蛋白的阳性表达,但在棘细胞层部分细胞浆中可见阳性表达,并随时间延长表达逐渐增多,28、32周时阳性细胞表达数目明显增多,阳性表达部位灰度值降低;C组大鼠模型各时间点阳性细胞灰度值及阳性细胞数较A组明显增高(P<0.05)。结论:单酸返流、混合返流手术均能导致大鼠模型食管粘膜上皮凋亡的改变,混合返流手术较单酸返流手术的表现更为明显,混合返流手术后24周光镜下可出现粘膜上皮基底细胞层及棘细胞层细胞层次增加,细胞过度角化;并可见非典型增生的区域的细胞凋亡的增加。免疫组织化学法检测可见模型组TNF-α表达的上调,Caspease3表达上调,Survivin蛋白表达升高,提示胃酸返流、十二指肠液返流等刺激可通过影响一系列凋亡相关基因蛋白的表达来导致食管粘膜上皮细胞的凋亡。

关键词：反流性食管炎 TNF-α Caspease3 Survivin

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老年人认知功能与血清同型半胱氨酸水平

中国临床康复 2005年第20期9卷 156-157页

作者：王善信王仁峰赵贵芳山东大学医学院精神病与心理卫生教研室山东省济南市250012 山东省精神卫生中心精神科山东省济南市250014

目的:认知功能损害是老年痴呆的重要病理特征,近年来许多研究表明同型半胱氨酸水平升高是引起老年认知功能损害的一个重要因素。为此,对同型半胱氨酸与老年人认知功能关系的研究结果进行回顾,以阐明同型半胱氨酸引起老年人认知功能损害... 详细信息

目的:认知功能损害是老年痴呆的重要病理特征,近年来许多研究表明同型半胱氨酸水平升高是引起老年认知功能损害的一个重要因素。为此,对同型半胱氨酸与老年人认知功能关系的研究结果进行回顾,以阐明同型半胱氨酸引起老年人认知功能损害的机制,进而及早采取有效干预措施。资料来源:应用计算机检索Medline数据库1990-01/2004-12期间的关于同型半胱氨酸对老年人认知功能影响的文章,检索词“homocysteine,seniledementia,cognitivefunction″,限定文章语言种类为“English”。资料选择:对资料进行初审,选取流行病学研究、随机对照临床试验和实验研究。资料提炼:共收集到35篇关于同型半胱氨酸与老年人认知功能损害关系的流行病学研究、随机对照临床试验和实验研究,15项研究符合纳入标准,排除的20项研究中,11项研究因系重复的同一研究,9项为Meta分析或综述。资料综合:老年痴呆患者血浆同型半胱氨酸水平升高,认知功能损害与同型半胱氨酸水平显著相关,B族维生素、相关基因、年龄和性别等因素引起同型半胱氨酸水平升高,同型半胱氨酸在大脑通过神经毒性作用和血管作用引起认知功能损害。结论:同型半胱氨酸水平升高可能是老年性痴呆的一个重要危险因素,是其认知损害的独立危险因素;B族维生素缺乏是同型半胱氨酸水平升高的主要影响因素。在认知功能损害和大脑病理变化出现前用B族维生素治疗可能是有效的预防性干预措施。

关键词：痴呆半胱氨酸认知血清同型半胱氨酸认知功能损害老年人水平 homocysteine B族维生素缺乏随机对照临床试验

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抓典型创新机制推动奶业产业化

农业工程技术(农业产业化) 2006年第2期 32-33页

作者：王仁峰南阳市宛城区人民政府副区长

宛城区位于河南省的西南部,南阳市城区的东半部,辖十个乡镇六个办事处。2001年底宛城区区委决定发展城郊型农业。国内外农业发展的经验告诉我们,奶牛业是今后我国快速发展的产业。宛城区为满足城市越来越多的牛奶需求,决定把奶牛业当作... 详细信息

宛城区位于河南省的西南部,南阳市城区的东半部,辖十个乡镇六个办事处。2001年底宛城区区委决定发展城郊型农业。国内外农业发展的经验告诉我们,奶牛业是今后我国快速发展的产业。宛城区为满足城市越来越多的牛奶需求,决定把奶牛业当作新兴产业发展。发展思路是加强领导,抓好典型,创新机制,带动全区奶业产业化。

关键词：奶牛产业奶牛业快速发展宛城区南阳市奶业产业化奶业协会

自组织竞争神经网络在异步电机参数辨识中的应用

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电机与控制应用 2006年第4期33卷 19-22,26页

作者：王仁峰阮毅陈钱春上海大学机电工程与自动化学院上海200072

介绍了自组织竞争神经网络在交流异步电机参数辨识中的应用。例举了参数辨识所需要的几个实验,阐述了用神经网络处理所采集数据的过程与算法。实验结果证明,该神经网络可以快速稳定地收敛。

关键词：神经网络自组织竞争异步电机参数辨识

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永磁同步电动机矢量控制的研究与分析

电机与控制应用 2007年第2期34卷 25-28页

作者：陈钱春阮毅王仁峰上海大学机电工程与自动化学院上海200072

利用MATLAB仿真软件建立了两种常用的永磁同步电动机矢量控制方案的仿真模型,即id=0控制和最大转矩/电流控制。从控制算法、功率因数、对参数的鲁棒性等方面比较了两种控制方案各自的优缺点。研究表明,最大转矩/电流控制算法复杂,对参... 详细信息

利用MATLAB仿真软件建立了两种常用的永磁同步电动机矢量控制方案的仿真模型,即id=0控制和最大转矩/电流控制。从控制算法、功率因数、对参数的鲁棒性等方面比较了两种控制方案各自的优缺点。研究表明,最大转矩/电流控制算法复杂,对参数的鲁棒性不高,但在功率因数方面要高于id=0控制。给出了两种控制方案的仿真结果。

关键词：永磁同步电动机矢量控制最大转矩/电流控制

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两种空间矢量脉宽调制生成方法的分析与比较

电机与控制应用 2006年第9期33卷 34-38页

作者：陈钱春阮毅王仁峰上海大学上海200072

通过对电压空间矢量脉宽调制(SVPWM)原理的介绍及算法的分析,在TMS320LF2407上分别以2种方法实现了SVPWM波形的输出,并对这2种实现方法的输出效果进行了比较,同时就零矢量分布方式的不同对磁链合成及死区的影响角度分析了两者之间的差... 详细信息

通过对电压空间矢量脉宽调制(SVPWM)原理的介绍及算法的分析,在TMS320LF2407上分别以2种方法实现了SVPWM波形的输出,并对这2种实现方法的输出效果进行了比较,同时就零矢量分布方式的不同对磁链合成及死区的影响角度分析了两者之间的差异。仿真和实验结果证明,与零矢量集中分布方式相比,零矢量均匀分布方式对磁链造成的谐波分量小,但其基波分量也小,低频时尤为显著。

关键词：空间矢量脉宽调制零矢量死区

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浅析住宅小区绿化存在的误区

山西建筑 2006年第19期32卷 338-339页

作者：李文王仁峰吉林白城某部队营房处吉林白城137001

对现代住宅小区绿化存在的主要问题做了细致分析，对产生误区的主要原因进行了深入研究，并有针对性地提出了解决方法，使小区绿化发挥其生态、社会效益，满足居民要求。

关键词：小区绿化生态效益大树移植