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温差对铁皮石斛松柏苷、紫丁香苷影响及相关基因表达分析

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温差对铁皮石斛松柏苷、紫丁香苷影响及相关基因表达分析

作者：王丛巧福建农林大学

学位级别：硕士

铁皮石斛(Dendrobium catenatum)是兰科石斛属植物,九大仙草之首,富含多糖、黄酮、生物碱、松柏苷、紫丁香苷、丁香醛等次生代谢产物。使用原球茎代替成苗进行次生代谢产物生产,是实现野生石斛资源可持续利用的有效方式之一。温度是植... 详细信息

铁皮石斛(Dendrobium catenatum)是兰科石斛属植物,九大仙草之首,富含多糖、黄酮、生物碱、松柏苷、紫丁香苷、丁香醛等次生代谢产物。使用原球茎代替成苗进行次生代谢产物生产,是实现野生石斛资源可持续利用的有效方式之一。温度是植物体内物质积累的重要影响因子,昼夜温差对作物光合、生理特性、花芽分化、物质积累及产量品质等方面均有显著影响。本文以铁皮石斛原球茎为材料,优化了铁皮石斛原球茎增殖体系;建立了同时测定铁皮石斛中松柏苷、紫丁香苷的方法;分离了DcF5H、DcCOMT、DcCAD基因cDNA序列及DcCAD基因启动子序列;通过定量PCR分析了DcF5H、DcCOMT、DcCAD表达量的变化与松柏苷、紫丁香苷含量在不同温差处理下的相互关系。主要研究结果如下:1铁皮石斛原球茎增殖条件优化以铁皮石斛原球茎为材料,1/2 MS+50 g/L土豆泥为基础培养基,研究碳源、氨基酸以及不同培养方式对其增殖的影响。结果表明:添加葡萄糖为碳源,原球茎团块细小,颜色呈绿色,无分化,30 d时增殖系数为3.75,利于原球茎增殖;基础培养基添加氨基酸不利于原球茎增殖;悬浮培养铁皮石斛原球茎30 d时,原球茎增殖系数为固体培养的2倍,故悬浮培养可以作为提高其增殖系数的手段;25/21℃昼夜温差能够推迟分化有利于铁皮石斛原球茎的增殖。综上可得,在4℃昼夜温差条件下,使用1/2 MS+50 g/L土豆泥+25 g/L葡萄糖的培养基进行悬浮培养,最适合铁皮石斛原球茎增殖。2 UPLC法测定铁皮石斛原球茎中松柏苷、紫丁香苷建立超高效液相色谱同时测定铁皮石斛中松柏苷、紫丁香苷的方法,为探究昼夜温差对铁皮石斛影响的后续研究提供技术支持。液相色谱柱为ACQUITY UPLC BEH C18(2.1 mm×100 mm,1.7μm),流动相为1%乙酸水溶液(A)/甲醇(C),流速:0.20 mL/min,柱温35℃;进样量为5.0μL。梯度洗脱条件为起始0%A;0 min,80%A;3 min,80%A;80 min,95%A。定量波长为283 nm。两种物质在10 min内完全分离。正交试验研究表明用纯水提取,料液比1:40,提取1 h(每0.5 h震荡一次),两种物质提取率最高。采用以上方法测定四个昼夜温差处理的原球茎样品,结果表明,最利于松柏苷积累的温差是25/21℃,处理15 d,松柏苷含量最高为204.78mg/kg,是对照的1.33倍。最利于紫丁香苷积累的温差是25/17℃,处理10 d,紫丁香苷含量最高为27.04 mg/kg,是对照的2.02倍。昼夜温差影响铁皮石斛原球茎松柏苷、紫丁香苷含量,温差适当起促进作用,温差过大则抑制。3铁皮石斛DcF5H、DcCOMT、DcCAD基因克隆及生物信息学分析本研究以铁皮石斛原球茎为材料,采用PCR技术对DcF5H、DcCOMT、DcCAD进行全长克隆。结果表明:DcF5H的ORF长1 536bp,编码511个氨基酸,亚细胞定位预测其定位于细胞基质。DcF5H有细胞色素P450蛋白保守结构域,属于氧化酶系蛋白。DcCOMT的ORF长1 086 bp,编码361个氨基酸,亚细胞定位预测DcCOMT位于细胞质,DcCOMT有7个保守结构域,这些保守结构域可能具有甲基转移的功能。DcCAD的ORF长641 bp,编码216个氨基酸,亚细胞定位预测DcCAD位于线粒体,含有典型的乙醇脱氢酶保守结构域和NAD(P)结合保守结构域,可以推测该蛋白质具有还原酶的特性。进一步对DcCOMT密码子偏好性进行分析。结果显示,铁皮石斛DcCOMT的ENC值、GC含量以及GC3分别为49、0.452和0.396,表明其密码子偏好性较弱,偏好使用A或T结尾的密码子;突变压力是DcCOMT密码子偏好性形成的主要作用力;铁皮石斛DcCOMT基因和同为兰科植物的香味蝴蝶兰(Phalaenopsis bellina)亲缘关系最近,两者的GC1s、GC2s、GC3s、GC、CAI和ENC也较为相近,表明物种进化关系上越相近其密码子偏好性也较为相似。此外,从密码子使用频率分析得出酵母菌真核表达系统适合铁皮石斛DcCOMT基因的异源表达,模式植物烟草、番茄可以作为其遗传转化受体。获得铁皮石斛DcCAD基因启动子序列。扩增得到该基因的启动子序列2 003 bp,DcCAD的启动子分析表明:该基因转录起始区域位于-147197,转录起始位点为位于-156 bp的G,该启动子含有多个光响应元件、激素应答元件、生长与代谢调控元件以及昼夜调控相关的元件,推测DcCAD可能参与铁皮石斛体内多种激素信号转导、防卫反应及其他生长代谢过程。4铁皮石斛DcF5H、DcCOMT、DcCAD基因的定量表达分析在25/25℃、25/21℃、25/17℃、25/13℃处

关键词：铁皮石斛原球茎 UPLC DcF5H DcCOMT DcCAD

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温差对铁皮石斛原球茎生长及药用成分的影响

园艺与种苗 2022年第2期42卷 20-23页

作者：陈青青王丛巧赖钟雄福建农林大学园艺植物生物工程研究所福建福州350002 福建农林大学园艺学院福建福州350002

[目的]探讨温差对铁皮石斛原球茎生长及药用成分的影响。[方法]以25℃/13℃为处理温差,恒温25℃/25℃(培养室最常用温度)为对照,昼夜温度设置各12 h,观察和测定铁皮石斛原球茎在0~50 d内的生长情况、生物量、多糖含量、多糖总量、生物... 详细信息

[目的]探讨温差对铁皮石斛原球茎生长及药用成分的影响。[方法]以25℃/13℃为处理温差,恒温25℃/25℃(培养室最常用温度)为对照,昼夜温度设置各12 h,观察和测定铁皮石斛原球茎在0~50 d内的生长情况、生物量、多糖含量、多糖总量、生物碱的变化。[结果]温差有利于铁皮石斛PLBs的增殖、促进生物量增加和多糖积累,长时间的恒温处理则有利于生物碱积累。[结论]该研究为原球茎替代野生植株进行工厂化生产提供了依据。

关键词：铁皮石斛原球茎温差多糖生物碱

文心兰15个miRNAs及其候选靶标的表达特性

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应用与环境生物学报 2019年第1期25卷 108-116页

作者：王培育林争春王丛巧高玉莹陈裕坤叶炜赖钟雄林玉玲福建农林大学园艺植物生物工程研究所福州350002

为了解miRNAs及其候选靶标在文心兰不同组织部位及假鳞茎受软腐病病原菌侵染中的表达规律,基于文心兰转录组和miRNA数据库进行分析,从中筛选获得15个miRNAs,结合生物信息学法对其候选靶标进行预测和功能注释,并利用实时荧光定量技术检测... 详细信息

为了解miRNAs及其候选靶标在文心兰不同组织部位及假鳞茎受软腐病病原菌侵染中的表达规律,基于文心兰转录组和miRNA数据库进行分析,从中筛选获得15个miRNAs,结合生物信息学法对其候选靶标进行预测和功能注释,并利用实时荧光定量技术检测miRNA及候选靶标在文心兰不同组织部位和假鳞茎受软腐病病原菌侵染的表达情况.结果表明,文心兰miRNA数据库的miRNA reads分析提示15个miRNAs不同成员可能在文心兰正常植株和感病不同阶段中差异表达. psRNATarget靶标预测显示,文心兰15个miRNAs有828个候选靶标,其中67个可能与抗病相关,包括丝氨酸/苏氨酸蛋白、F-box蛋白基因、锌指蛋白、RGA抗病蛋白等.基于文心兰miRNAs读取次数(Reads)和Unigene候选靶标RPKM值,发现miRNAs及其候选靶标在文心兰正常植株和假鳞茎不同感病时段表达均存在差异.实时荧光定量PCR分析显示,在文心兰不同组织部位中,miR159a、miR167b、miR168a、miR169a、miR171a和miR172a均在假鳞茎和叶中均大量表达,并与对应候选靶标的表达呈负调控关系,推测它们参与假鳞茎和叶的发育和形态建成.在软腐病病菌侵染文心兰假鳞茎中,miR159a、miR168a、miR169a、miR171a和miR172a在8 h处理时表达量高,并且与对应的候选靶标在侵染0-8 h表达呈负调控关系,推测上述miRNAs通过负调控候选靶标在中期响应软腐病病原菌侵染过程;而miR167b在处理0h高表达,并且与候选靶标在侵染0-8h表达呈负调控关系,推测其通过下调表达参与软腐病病原菌侵染过程的响应.上述研究表明,文心兰miRNAs通过介导候选靶标的裂解可能广泛参与文心兰不同组织的发育及软腐病病原菌侵染过程的响应.

关键词：文心兰 miRNAs 软腐病靶标表达分析

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文心兰PAD4基因克隆及表达分析

热带作物学报 2018年第12期39卷 2436-2445页

作者：郭艳芳王丛巧李蓉陈裕坤赖钟雄王天池福建农林大学园艺植物生物工程研究所福建福州350002

为了研究文心兰(Oncidium hybridum)抗病相关基因PAD4在文心兰抗病种质资源培育中的功能,采用RT-PCR结合RACE法,从巧克力文心兰(Oncidium Sharry Baby ‘Sweet Fragrance’)中克隆得到一条全长2 214 bp的基因的cDNA序列,开放阅读框长1 8... 详细信息

为了研究文心兰(Oncidium hybridum)抗病相关基因PAD4在文心兰抗病种质资源培育中的功能,采用RT-PCR结合RACE法,从巧克力文心兰(Oncidium Sharry Baby ‘Sweet Fragrance’)中克隆得到一条全长2 214 bp的基因的cDNA序列,开放阅读框长1 894 bp,预测可编码647个氨基酸,5′UTR长度为65 bp,3′UTR长度为255 bp。生物信息学分析表明:PAD4编码的蛋白属于水解酶超家族,有6个跨膜螺旋,无信号肽,亚细胞定位预测其主要定位于细胞质膜上。系统进化树表明,文心兰PAD4与同为兰科植物的小兰屿蝴蝶兰(Phalaenopsisequestris)、铁皮石斛(Dendrobium catenatum)、深圳拟兰(Apostasia shenzhenica)亲缘关系最近。同源分析结果显示,与铁皮石斛的PAD4蛋白同源性最高(78.08%)。实时荧光定量PCR分析显示,PAD4在文心兰不同组织部位中都有表达,在假鳞茎中的表达量最高,其次是下端叶,在根中的表达量最低。接种软腐病病原菌显示,PAD4在感病文心兰中表达量上调,侵染后4 h时快速响应并达到最高值。SA(salicylicacid)和CaCl2都能够诱导PAD4的表达,都在24h时达到最高峰。研究表明,PAD4基因可能在文心兰抗病过程中有重要作用。

关键词：文心兰抗病 PAD4 基因克隆表达分析

文心兰25条miRNA前体序列特性及其表达分析

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西北植物学报 2018年第9期38卷 1587-1597页

作者：王培育王丛巧张舒婷王雪晶叶炜赖钟雄林玉玲福建农林大学园艺植物生物工程研究所福州350002

为了解文心兰miRNA的序列特性及其在不同组织部位中以及软腐病侵染过程中的表达规律,该研究对文心兰转录组及miRNA数据库中的25条miRNA前体(pre-miRNA)序列和15条成熟体序列进行序列特性分析,并对25条pre-miRNAs在文心兰不同组织部位及... 详细信息

为了解文心兰miRNA的序列特性及其在不同组织部位中以及软腐病侵染过程中的表达规律,该研究对文心兰转录组及miRNA数据库中的25条miRNA前体(pre-miRNA)序列和15条成熟体序列进行序列特性分析,并对25条pre-miRNAs在文心兰不同组织部位及软腐病侵染的假鳞茎中的表达情况进行实时荧光定量分析。结果显示:(1)文心兰25条pre-miRNAs序列可分为13个家族,其中包含15条成熟体序列。(2)Mfold二级结构预测显示,文心兰25条pre-miRNAs的最小折叠自由能在-32.04～-120.98kal/mol之间,均可以形成典型、稳定的发夹结构。(3)序列比对分析发现,同一家族的前体与成熟体存在一个约20个碱基长度的保守区域,推测该区域可能为文心兰miRNA成熟体所在区域。其中,13个前体家族中,有10个家族的成熟体可以完全定位于其前体中。(4)实时荧光定量PCR结果显示,在文心兰不同组织部位中,miR159-unigene0037857、miR167-unigene0011236、miR167-unigene0002619、miR169-unigene0022341、miR172-unigene006514、miR396-unigene19032、miR398-unigene0009996、miR2950-unigene0006151、miR2950-unigene0006422等pre-miRNAs在叶片中大量累积可能有利于其叶的形态建成;miR162-unigene0003615、miR162-unigene0013441、miR166-unigene0011870、miR168-unigene0009958等pre-miRNAs同时在根和叶中均大量表达有利于其根和叶的发育;而miR171-unigene0045985、miR396-unigene0011179、miR396-unigene0011180在根和茎中的大量表达可能有利于其根和茎的发育。(5)在软腐病病菌侵染文心兰假鳞茎的过程中,miR159-unigene0037857、miR167-unigene0011236、miR396-unigene0011179、miR396-unigene0011180、miR396-unigene0019032、miR845-unigene0012489的表达总体呈下降趋势;miR162-unigene0040566、miR166-unigene0011870、miR168-unigene0009958、miR171-unigene0045985在软腐病菌液侵染4h其表达量升高,之后表达量下调;miR162-unigene0003615、miR167-unigene0002619、miR168-unigene0047942、miR169-unigene0022341、miR845-unigene0012489在菌液侵染过程中其表达量呈现先下降后上升的趋势,并在侵染8h后表达量达到最低。研究表明,文心兰pre-miRNAs 13个家族不同成员在进化进程中具有高度保守性与特异性的结构特点,并可能广泛参与文心兰不同组织的生长发育及参与软腐病菌侵染的响应。

关键词：文心兰 pre-miRNAs 序列特性表达分析

苋菜中甜菜红素代谢相关基因AmMYB2的表达与功能分析

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园艺学报 2019年第3期46卷 473-485页

作者：彭丽云王云孙雪丽王晓赵春丽王丛巧项蕾蕾陈家兰赖钟雄刘生财福建农林大学园艺植物生物工程研究所福州350002

为了研究AmMYB2基因在苋菜(Amaranthus tricolor)甜菜红素合成中的作用,对红色苋菜品种‘大红’AmMYB2(登录号为KY814751.1)进行生物信息、基因表达及功能分析。结果表明:AmMYB2的开放阅读框(ORF)全长为678 bp,编码蛋白分子质量为25.96 ... 详细信息

为了研究AmMYB2基因在苋菜(Amaranthus tricolor)甜菜红素合成中的作用,对红色苋菜品种‘大红’AmMYB2(登录号为KY814751.1)进行生物信息、基因表达及功能分析。结果表明:AmMYB2的开放阅读框(ORF)全长为678 bp,编码蛋白分子质量为25.96 kD,该蛋白具有R2R3型MYB结构域,属于R2R3型MYB转录因子。核酸序列分析结果显示,AmMYB2与甜菜红素合成相关的甜菜BvMYB1和苋菜AmMYB1的相似度分别达到62.11%和49.93%。亚细胞观察显示,AmMYB2蛋白定位于细胞核。实时荧光定量(qPCR)分析发现,AmMYB2在红色苋菜品种的表达量高于绿色苋菜品种;在‘大红’苋菜中,不同组织以及叶片不同部位中AmMYB2的表达量与甜菜红素含量成正比。构建AmMYB2过表达载体,将其转入烟草和拟南芥中,发现该基因能够在这两种植物中高水平表达,但不会引起颜色变化,揭示AmMYB2可能是苋菜中甜菜红素合成的正调控因子,可能不参与花青素的合成。

关键词：苋菜 AmMYB2基因甜菜红素表达分析功能鉴定

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建筑结构一致风险抗震设计理论研究进展

建筑结构学报 2024年第10期45卷 1-30页

作者：吕大刚王丛董尧冯云幸哈尔滨工业大学土木工程智能防灾减灾工业与信息化部重点实验室山东建筑大学土木工程学院

从一致危险向一致风险的范式转换，已成为各国地震区划和抗震设计方法的主要发展趋势，但是我国的地震区划和抗震设计实践仍然属于一致危险的旧范式，不能充分考虑不同地区地震危险性的特征差异和建筑结构抗地震倒塌能力存在的不确定性... 详细信息

从一致危险向一致风险的范式转换，已成为各国地震区划和抗震设计方法的主要发展趋势，但是我国的地震区划和抗震设计实践仍然属于一致危险的旧范式，不能充分考虑不同地区地震危险性的特征差异和建筑结构抗地震倒塌能力存在的不确定性，从而导致不同地区建筑结构地震倒塌风险的不一致性。2022年5月，我国发布《“十四五”国家防震减灾规划》,明确提出要提升地震灾害风险防治能力，包括摸清风险底数、强化抗震设防、增强城市韧性等要求，提出修订国家强制性标准GB 18306—2015《中国地震动参数区划图》,开展第六代地震灾害风险区划工作等。在此背景下，迫切需要开展风险导向地震动参数区划和建筑结构一致风险抗震设计理论的研究，从而为第六代地震动参数区划图的编制以及现行建筑抗震设计规范的修订提供决策依据。为此，从风险导向地震动参数、风险导向地震反应谱、一致风险抗震设计方法等方面，全面梳理和总结建筑结构一致风险抗震设计理论国内外的最新研究现状和发展趋势，并指出当前研究存在的主要问题和对策，以期为建筑结构一致风险抗震设计的研究提供概念性释疑和方向性导引。

关键词：一致风险风险导向地震动风险导向地震反应谱一致倒塌风险设计抗震性能设计抗震韧性设计

铁皮石斛咖啡酸-O-甲基转移酶(COMT)密码子偏好模式分析

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分子植物育种 2020年第5期18卷 1462-1471页

作者：王丛巧彭丽云郭艳芳赵桦陈青青林玉玲赖钟雄福建农林大学园艺植物生物工程研究所福州350002

咖啡酸-O-甲基转移酶(COMT)是木质素合成过程的关键酶,参与苯丙烷代谢。了解铁皮石斛COMT(Caffeic acid-O-methyltransferase)基因密码子的偏好性可为其功能和分子进化研究提供科学依据。采用Codon W、EMBOSS、SPSS、Origin等分析铁皮石... 详细信息

咖啡酸-O-甲基转移酶(COMT)是木质素合成过程的关键酶,参与苯丙烷代谢。了解铁皮石斛COMT(Caffeic acid-O-methyltransferase)基因密码子的偏好性可为其功能和分子进化研究提供科学依据。采用Codon W、EMBOSS、SPSS、Origin等分析铁皮石斛COMT的密码子偏好参数,并通过ENC绘图、中性绘图和PR2-plot分析探讨COMT基因密码子偏好性形成的可能因素,同时使用SPSS19.0和MEGA6.0进行聚类分析。结果显示,铁皮石斛COMT基因ENC值、GC含量以及GC3分别为49、0.452和0.396,表明其密码子偏好性较弱,偏好使用A或T结尾的密码子;ENC、中性绘图分析显示突变压力是COMT密码子偏好性形成的主要作用力;铁皮石斛COMT基因和同为兰科植物的香味蝴蝶兰(Phalaenopsis bellina)的亲缘关系最近,两者的GC1s、GC2s、GC3s、GC、CAI和ENC也较为相近,表明物种进化关系上越相近其密码子偏好性也较为相似,但有些物种仍存在一些差异。此外,从密码子使用频率分析得出酵母菌真核表达系统适合铁皮石斛COMT基因的异源表达,模式植物烟草、番茄可以作为其遗传转化受体。本研究为COMT基因功能进一步研究提供参考。

关键词：铁皮石斛密码子偏好性咖啡酸-O-甲基转移酶(COMT) 聚类分析

昼夜温差处理下铁皮石斛原球茎松柏苷和紫丁香苷含量的测定

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热带作物学报 2019年第2期40卷 261-268页

作者：王丛巧王培育郭艳芳鲁瑶彭丽云陈青青林玉玲赖钟雄福建农林大学园艺植物生物工程研究所福建福州350002

研究不同昼夜温差对铁皮石斛原球茎松柏苷、紫丁香苷含量的影响,为开发铁皮石斛原球茎作为药材提供研究基础。采用光照培养箱设置不同温差处理,采用超高效液相色谱法测定松柏苷、紫丁香苷含量变化。建立同时测定松柏苷和紫丁香苷的超高... 详细信息

研究不同昼夜温差对铁皮石斛原球茎松柏苷、紫丁香苷含量的影响,为开发铁皮石斛原球茎作为药材提供研究基础。采用光照培养箱设置不同温差处理,采用超高效液相色谱法测定松柏苷、紫丁香苷含量变化。建立同时测定松柏苷和紫丁香苷的超高效液相色谱法,以ACQUITY UPLC BEH C18(2.1 mm×100 mm,1.7μm)为分析柱;流动相:1%乙酸水溶液(A)和甲醇(C)。正交试验研究提取方法,结果表明用纯水提取,料液比1∶40,提取1 h(每0.5 h震荡一次),2种物质提取率最高。采用此方法测定4个昼夜温差处理的铁皮石斛原球茎样品,结果表明,对照0℃温差松柏苷、紫丁香苷整体变化趋于平缓,8℃温差处理下,松柏苷和紫丁香苷在10 d的处理周期下都表现出含量增加,且明显优于其他处理。4℃温差处理两物质含量在第15天达到最高,12℃温差处理两物质含量前期高于对照处理,处理后期低于对照处理,且低于4℃、8℃温差处理。昼夜温差影响铁皮石斛原球茎松柏苷、紫丁香苷含量,一定范围内的温差呈现促进作用,温差过大则出现抑制作用。

关键词：铁皮石斛原球茎松柏苷紫丁香苷超高效液相色谱昼夜温差