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pAPN基因敲除的IPEC-J2介导的TGEV感染特征分析

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畜牧兽医学报 2024年第8期55卷 3395-3407页

作者：夏振涛王楠王婉洁周期律黄雷牟玉莲中国农业科学院北京畜牧兽医研究所北京100193 中国农业科学院农业基因组研究所深圳518120

旨在探究猪氨基肽酶N(porcine aminopeptidase N,pAPN)基因敲除的猪空肠上皮细胞系(intestinal porcine epithelial cell line J2,IPEC-J2)介导猪传染性胃肠炎病毒(transmissible gastroenteritis virus,TGEV)感染的特征,为深入了解pAPN基因在TGEV感染过程中的作用机制提供理论依据。研究分为pAPN基因敲除IPEC-J2组(IPEC-J2-KO组)、野生型IPEC-J2组(IPEC-J2-WT组)和未接种TGEV的野生型IPEC-J2组(Mock组)3组,每组设置3个重复。首先通过实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qPCR)确定IPEC-J2接种TGEV毒株后收取细胞样品的最佳时间节点;其次,对IPEC-J2-KO进行了脱靶效应检测;然后,通过qPCR、蛋白免疫印迹(western blot,WB)、间接免疫荧光分析(indirect immunofluorescence assay,IFA)和50%组织细胞感染量(50%tissue culture infective dose,TCID_(50))对接种TGEV的IPEC-J2-KO、IPEC-J2-WT及Mock进行感染特征分析;最后,通过WB检测IPEC-J2-KO、IPEC-J2-WT和Mock中NF-κB p65及其磷酸化蛋白pp65的表达情况。qPCR结果显示,接毒24 h是收集细胞样本以评估TGEV对IPEC-J2影响的最佳时间节点;脱靶分析结果显示,在IPEC-J2-KO中未检测到脱靶效应;病毒感染特征分析结果显示,与IPEC-J2-WT相比,IPEC-J2-KO内病毒拷贝数、病毒滴度均极显著降低(P0.05),且IPEC-J2-KO内未检测到TGEV-N蛋白的表达;此外,与Mock相比,接种TGEV后,IPEC-J2-WT组NF-κB p65的磷酸化水平极显著上调(P0.05)。本研究表明,IPEC-J2-KO可有效抵抗TGEV的感染,接种TGEV未影响IPEC-J2-KO中先天免疫相关信号通路中转录因子NF-κB的活性。该研究为IPEC-J2作为TGEV感染特征研究的细胞模型提供了理论依据,为阐明pAPN基因在TGEV入侵宿主细胞的机制及抗病猪新品种的研究奠定了基础。

关键词：猪氨基肽酶N IPEC-J2 TGEV NF-κB

CD163基因敲除iPAMs的构建及其感染PRRSV的特征分析

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中国畜牧兽医 2024年第8期51卷 3471-3483页

作者：董泽霞林鑫周期律王楠黄雷刘志国冯政牟玉莲佛山大学生命科学与工程学院佛山528225 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所北京100193 天津农学院动物科学与动物医学学院天津300392 中国农业科学院农业基因组研究所深圳518120

[目的]获得分化抗原163(cluster of differentiation 163,CD163)基因敲除的永生化猪肺泡巨噬细胞系(immortalized porcine alveolar macrophages,iPAMs),并从细胞水平研究CD163蛋白在猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)入侵过程中的作用。[方法]将靶向CD 163基因第7外显子的sgRNA质粒(pX330-sgCD163)转染至iPAMs,转染48 h后通过有限稀释法筛选单克隆细胞并进行基因型鉴定,通过Western blotting和脱靶分析来筛选CD 163基因敲除的iPAMs;通过实时荧光定量PCR、Western blotting、间接免疫荧光试验(indirect immunofluorescence assay,IFA)和半数细胞培养物感染量(50%tissue culture infective dose,TCID 50)等试验分析CD 163基因敲除的iPAMs感染PRRSV的特征。[结果]测序结果表明,100株单克隆细胞中有1株CD 163双等位基因敲除的iPAMs,敲除效率为1%;Western blotting结果显示,CD 163基因敲除的iPAMs中检测不到CD163蛋白的表达,且在预测的脱靶位点未检测到脱靶效应。实时荧光定量PCR结果表明,与野生型iPAMs组相比,CD 163基因敲除的iPAMs组病毒拷贝数极显著降低(P<0.01);Western blotting和IFA结果表明,在接毒24 h后的CD 163基因敲除的iPAMs组中未检测到PRRSV-N蛋白的表达;TCID 50试验结果同样显示,在CD 163基因敲除的iPAMs组中未观察到细胞病变。[结论]本研究利用CRISPR/Cas9编辑系统成功构建了CD 163基因敲除的iPAMs,该细胞系可以完全抵抗PRRSV感染。该细胞系的建立为后续研究PRRSV与CD163蛋白的互作机制提供了新型试验材料。

关键词： CRISPR/Cas9 CD 163基因永生化猪肺泡巨噬细胞系(iPAMs) 猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)

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基因编辑技术在猪育种中的研究进展

中国畜禽种业 2024年第1期20卷 19-28页

作者：刘志国黄雷杨丽景王楠牟玉莲中国农业科学北京畜牧兽医研究所北京100193 中国农业科学院农业基因组研究所广东深圳518120 天津市宁河原种猪场有限责任公司天津301504

以CRISPR/Cas9为代表的基因编辑技术为猪育种提供了前所未有的新工具和新方法,不仅能突破现有遗传变异资源的限制,还可以缩短育种周期,提高育种效率。该文对基因编辑技术的研究进展及其在猪遗传育种方面的应用情况进行综合介绍,以期为... 详细信息

以CRISPR/Cas9为代表的基因编辑技术为猪育种提供了前所未有的新工具和新方法,不仅能突破现有遗传变异资源的限制,还可以缩短育种周期,提高育种效率。该文对基因编辑技术的研究进展及其在猪遗传育种方面的应用情况进行综合介绍,以期为相关科研人员、育种工作者以及政策制定者提供参考,进一步推动基因编辑技术在猪育种方面的应用。

关键词：猪基因编辑 CRISPR/Cas9 碱基编辑器先导编辑生产性能抗病

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村民自治权的宪法学研究

村民自治权的宪法学研究

作者：牟玉莲长春理工大学

学位级别：硕士

村民自治是一种基层民主制度,村民自治权是这种民主的核心。村民自治权是一个多层次的概念:从国家治理的角度看,村民自治权是一种治理权;从村民自治权的本质看,它是一种民主权利;从村民自治权的主体上看,村民自治权又就是一种身份权;从... 详细信息

村民自治是一种基层民主制度,村民自治权是这种民主的核心。村民自治权是一个多层次的概念:从国家治理的角度看,村民自治权是一种治理权;从村民自治权的本质看,它是一种民主权利;从村民自治权的主体上看,村民自治权又就是一种身份权;从国家和社会分权的角度看,村民自治权是村民的一种自治权力。村民自治权在性质上属于一种社会自治权,村民自治权来源于权利对权力的制约,它的主体是作为个体的村民,它体现着宪政的基本理念,即民主、自由和法治。村民自治权作为中国农村民主化进程的新生事物,它的实现必然会受到多种因素的阻碍和制约,本文提出了保障村民自治权实现的对策。村民自治是中国民主宪政建设的基础工程,村民自治权的实现具有重大的价值。

关键词：村民自治权性质主体实现价值

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猪胚胎干细胞培养和建系的影响因素及对策

中国兽医科技 2004年第10期34卷 76-78页

作者：况玲冯书堂余四九牟玉莲甘肃农业大学新疆农业大学新疆乌鲁木齐830052 中国农业科学院畜牧研究所

为解决胚胎干细胞的培养和建系受血清、饲养层、细胞因子、传代时机以及其他一些不明因素影响而很不稳定的问题 ,在总结猪胚胎干细胞 (EG)培养和建系的经验教训的基础上 ,对一些常规的实验方法进行了改进 ,提出了消除上述影响因素的对策。

关键词：胚胎干细胞饲养层传代血清培养基

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催乳素受体基因的研究进展

遗传 2002年第3期24卷 363-366页

作者：牟玉莲孙少华储明星河北农业大学动物科技学院保定071001 中国农业科学院畜牧研究所北京100094

本文介绍催乳素受体的结构 ,催乳素受体基因的发育性表达及作用 ,催乳素受体基因的作用机理与分子调控 ,催乳素受体基因的定位以及其与繁殖性状的关系等。提示催乳素受体基因可作为繁殖性状的一个候选基因。

关键词：催乳体基因研究进展繁殖性状

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中国7个不同地理居群野猪的系统发育研究

中国农业科学 2015年第S1期 58-66页

作者：白立景刘博李林牟玉莲李奎中国农业科学院深圳农业基因组研究所中国农业科学院北京畜牧兽医研究所

【目的】线粒体DNA是真核生物细胞内唯一存在的核外遗传物质,具有相对恒定且不同于核DNA的生物信息量。线粒体DNA序列研究分析为物种的起源和进化研究提供了丰富的理论依据。因此,研究通过分析国内外的野猪线粒体基因组差异,了解中国不... 详细信息

【目的】线粒体DNA是真核生物细胞内唯一存在的核外遗传物质,具有相对恒定且不同于核DNA的生物信息量。线粒体DNA序列研究分析为物种的起源和进化研究提供了丰富的理论依据。因此,研究通过分析国内外的野猪线粒体基因组差异,了解中国不同地理居群野猪遗传资源情况,阐明不同亚种之间的亲缘关系。【方法】选取内蒙古、四川、陕西、浙江、江西、湖南、福建7个省或自治区共计26头野猪耳组织/尾组织,通过酚-氯仿法抽提基因组DNA,取3μg DNA,利用Covaris System(Life Technologies)打碎至200—800 bp片段,经末端配对,加A-尾巴,以插入片段500 bp建库。使用Hiseq-2500(Illumina)平台测序。为了比较国内野猪与国外野猪在线粒体基因组上的差异,从NCBI上下载6头欧洲野猪、1头日本野猪、1头苏门答腊岛(Sumatra)野猪和4份中国野猪的全基因组重测序数据。利用该12头野猪重测序数据与本研究26头国内7个不同地理居群野猪进行线粒体变异检测。通过比较reads对的平均测序质量,挑选出reads平均质量大于Q30的双末端reads。通过BWA和samtools,检测38头野猪之间的线粒体全基因组SNP。通过次等位基因频率(MAF≥0.05)对群体SNP进行筛选。利用筛选出的可信SNP位点,利用最大似然法(ML)进行系统进化树的构建、主成分分析(principal component analysis; PCA)和核苷酸多态性分析(nucleotide diversity;π)。【结果】对38头野猪的线粒体全基因序列分析发现,群体之间共检测到226个SNP位点(0.014SNPs/bp),其中D-loop区域共检测到33个SNP (0.028 SNPs/bp)。通过将不同地理位置的野猪进行分类后,共得到9个组,包括Sumatra,欧洲,日本,陕西,四川,湖南,江西,浙江和内蒙古。通过每个类群的线粒体DNA的GC含量进行分析发现,9个亚群内的GC含量趋于相对稳定,其中A含量平均为34.7%, C含量平均为26.2%, G含量为13.3%,T含量为25.8%。在D-loop区域,相对于线粒体全长来说,A含量减少1%,而G含量增加1%。通过这226个SNP进行PCA和进化树分析发现,欧洲类群和亚洲类群存在明显的分化,说明这两个类群是独立进化的;国内野猪的7个不同地理居群可分为蒙古、川陕、华南野猪3个亚种。通过序列多样性分析发现,结果显示国内不同地区野猪之间的遗传距离较小(0.00024-0.0037),π的平均值为0.0022,而欧洲与中国内地之间的差异较大(0.0044-0.0052),平均值为0.0049,Sumatra和日本与中国内地之间的差异平均为0.0025。说明欧洲野猪相对于Sumatra和日本野猪与中国内地野猪有着较大的序列多样性。【结论】中国野猪虽然存在较丰富的单倍型多态性,但是遗传多样性有逐步丧失的风险,提示要加强中国野猪种质资源的科学规划和保护。

关键词：野猪线粒体DNA 遗传距离系统进化

CD 163基因在猪繁殖与呼吸综合征抗病育种中的研究进展

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畜牧兽医学报 2023年第8期54卷 3127-3138页

作者：王慧冯保亮吴丹向光明王楠牟玉莲李奎刘志国中国农业科学院北京畜牧兽医研究所北京100193 天津市宁河原种猪场有限责任公司天津301504 中国农业科学院农业基因组研究所深圳518120

清道夫受体超家族是一个结构相关的跨膜糖蛋白家族,其特征是包含高度保守的富含半胱氨酸的清道夫受体(scavenger receptor cysteine-rich,SRCR)结构域。CD163蛋白为清道夫受体超家族的B型成员,包含9个SRCR结构域,富含半胱氨酸序列,主要... 详细信息

清道夫受体超家族是一个结构相关的跨膜糖蛋白家族,其特征是包含高度保守的富含半胱氨酸的清道夫受体(scavenger receptor cysteine-rich,SRCR)结构域。CD163蛋白为清道夫受体超家族的B型成员,包含9个SRCR结构域,富含半胱氨酸序列,主要在单核细胞和巨噬细胞中表达。研究发现CD163蛋白是猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)的必需受体,参与PRRSV的脱衣壳过程,而且可能参与非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)的吸附和内化过程。除此之外,CD163蛋白还在免疫生理等多种重要的生物学过程中发挥不可替代的作用。本综述就CD163分子的基本信息、相关生理功能及其在猪繁殖与呼吸综合征抗病育种中的研究进展做综合介绍,为抗病动物新品种培育提供参考。

关键词：清道夫受体 CD163 生理生化功能猪繁殖与呼吸综合征病毒非洲猪瘟病毒

CD163单等位基因表达的iPAMs细胞系的构建及其介导PRRSV感染的特征分析

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中国畜牧兽医 2023年第7期50卷 2617-2628页

作者：王慧冯保亮向光明黄雷刘志国李奎牟玉莲中国农业科学院北京畜牧兽医研究所北京100193 天津市宁河原种猪场有限责任公司天津301504 中国农业科学院深圳农业基因组研究所深圳518120

【目的】试验旨在利用CRISPR/Cas9基因编辑技术获得CD 163(cluster of differentiation 163)单等位基因表达的永生化猪肺泡巨噬细胞系(immortalized porcine alveolar macrophages,iPAMs),并探究其介导猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)感染的特征,为深入研究CD 163基因在PRRSV感染中的作用机制奠定基础。【方法】在猪CD 163基因外显子1区域设计8条向导RNA(single guide RNA,sgRNA),并将其连接到pX458载体中,通过T7E1酶切试验检测不同sgRNA载体的活性;将活性较高的3条sgRNAs表达载体电转染到iPAMs中,通过流式细胞术分选单克隆细胞,对获得的单克隆细胞进行基因型鉴定、蛋白表达检测、脱靶分析以及PRRSV感染分析。【结果】在设计的8条sgRNAs中有3条基因编辑效率在28%以上。基因型鉴定结果表明,50株片段敲除的单克隆细胞中有4株符合预期的CD 163单等位基因表达的iPAMs,效率为8%。蛋白表达检测和脱靶分析结果显示,CD 163单等位基因表达的iPAMs中CD163蛋白表达量显著下降(P0.05)。【结论】本研究利用CRISPR/Cas9编辑系统构建了可以正常感染PPRSV的CD 163单等位基因表达的iPAMs,为阐明CD163在猪繁殖与呼吸综合征传染病中所起的作用以及培育抗病猪新品种奠定了基础。

关键词： CD163 猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV) CRISPR/Cas9 永生化猪肺泡巨噬细胞系(iPAMs)

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