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实时荧光定量PCR在猪繁殖与呼吸综合征病毒研究中的应用

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生物技术通报 2010年第8期26卷 40-44页

作者：祝秀梅刘学荣牟克斌中农威特生物科技股份有限公司兰州730046

猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)是一种严重危害种公猪和繁殖母猪及其仔猪的一种接触性传染病,是我国重要猪病病原体之一。建立一种快速、可靠的诊断方法,对于控制和消灭PRRSV至关... 详细信息

猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)是一种严重危害种公猪和繁殖母猪及其仔猪的一种接触性传染病,是我国重要猪病病原体之一。建立一种快速、可靠的诊断方法,对于控制和消灭PRRSV至关重要。实时荧光定量PCR技术的发展为PRRSV在快速检测和鉴别诊断方面开辟了新思路。以下回顾了实时荧光定量PCR操作技术在PRRSV研究应用方面的研究进展,同时提出了该领域目前面临的问题,并对其未来发展方向进行了展望。

关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒实时定量PCR 应用

猪繁殖与呼吸综合征病毒NX-1株ORF5,ORF7基因的克隆

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浙江农业学报 2010年第4期22卷 448-453页

作者：杜平刘学荣黄银君贺延玉牟克斌中农威特生物科技股份有限公司甘肃兰州730046 甘肃农业大学研究测试中心甘肃兰州730070

为了从分子水平了解猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）ORF5和ORF7基因的特征,并为PRRSV的遗传进化和分子变异研究提供资料。对宁夏地区流行的PRRSV进行采样分析,运用RT-PCR技术分别扩增了PRRSV NX-1/2008毒株囊膜蛋白基因ORF5与衣壳蛋白... 详细信息

为了从分子水平了解猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）ORF5和ORF7基因的特征,并为PRRSV的遗传进化和分子变异研究提供资料。对宁夏地区流行的PRRSV进行采样分析,运用RT-PCR技术分别扩增了PRRSV NX-1/2008毒株囊膜蛋白基因ORF5与衣壳蛋白基因ORF7,并对其进行了克隆,随后利用DNAS-TAR生物软件进行了同源性比对和进化分析。结果显示,PRRSV NX-1/2008毒株的ORF5,ORF7基因均与JXa-1/2007等高致病性毒株高度同源,ORF7的氨基酸同源性则达到了100%。与空间距离较远的JXa-1/2007毒株相比,NX-1株的ORF5基因在中和抗体决定区196位上发生突变,而与相距较近的HUB-1/2006,CH-1 a/2001等毒株相比较,则无此突变;与CH-1 a/2001毒株相比,GP5蛋白的免疫原性核心位点B 39位的F→I,在诱导中和抗体起重要作用的33位糖基化位点N→S,同时,诱骗位点A（30~38氨基酸）的32,33和35位氨基酸都发生了突变。NX-1株的ORF7基因与国内CH-1 a/2001等低致病性毒株间的突变有69%位于抗原决定区,而其中有56%是高致病性毒株的主动突变。研究表明,分离的PRRSV高致病性毒株与低致病性毒株的抗原性在基因组上有较大范围的变异,且这种变异可能还主要位于免疫决定区。

关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒 ORF7基因 ORF5基因 RT-PCR

稳定表达T_7RNA聚合酶的猪睾丸细胞系的建立

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东北农业大学学报 2012年第12期43卷 26-31页

作者：祁光宇刘萍刘斌王凡武发菊杜平董金杰黄银君牟克斌刘学荣中农威特生物科技股份有限公司兰州730046 中国农业科学院兰州兽医研究所兰州730046

根据GenBank中登录的T7RNA聚合酶基因参考序列,设计合成了1对特异性引物扩增对T7RNA聚合酶基因进行扩增,将测序正确的T7RNA聚合酶基因和真核表达载体pIRES2-EGFP双酶切后进行连接构建pIRES2-EGFP-T7RNA RNA质粒。再将构建正确的pIRES2-E... 详细信息

根据GenBank中登录的T7RNA聚合酶基因参考序列,设计合成了1对特异性引物扩增对T7RNA聚合酶基因进行扩增,将测序正确的T7RNA聚合酶基因和真核表达载体pIRES2-EGFP双酶切后进行连接构建pIRES2-EGFP-T7RNA RNA质粒。再将构建正确的pIRES2-EGFP-T7RNA质粒经用脂质体法转染猪睾丸细胞,通过G418筛选和单细胞克隆化,同时构建pET-32a-RED原核表达质粒载体,用其检测T7启动子控制下的红色荧光蛋白的表达。结果表明,建立的ST/T7RNA细胞系经20次传代仍然能稳定表达T7RNA聚合酶。结果显示,成功建立能稳定表达T7RNA聚合酶的猪睾丸细胞系,为猪瘟病毒反向遗传操作平台奠定了基础。

关键词： T7RNA聚合酶 EGFP和RED荧光基因猪睾丸细胞 ST T7RNA细胞系

猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)GP3-GP5-M融合蛋白在哺乳动物细胞中的表达

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农业生物技术学报 2012年第10期20卷 1201-1206页

作者：王凡刘建斌吕志慧刘学荣牟克斌中农威特生物科技股份有限公司中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所

猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)是一种严重危害养猪业发展的传染病,为了PRRSV GP3-GP5(N-糖基化蛋白)-M(膜蛋白)融合蛋白在哺乳动物细胞中的表达及其免疫原性,本研究利用脂质体法将构建好的真核重组表达质粒pcDNA3.1-ORF3-ORF5-ORF6转... 详细信息

猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)是一种严重危害养猪业发展的传染病,为了PRRSV GP3-GP5(N-糖基化蛋白)-M(膜蛋白)融合蛋白在哺乳动物细胞中的表达及其免疫原性,本研究利用脂质体法将构建好的真核重组表达质粒pcDNA3.1-ORF3-ORF5-ORF6转染猪肾细胞(PK-15细胞),经G418(600μg/mL)筛选(72h)获得稳定表达PRRSV GP3-GP5-M融合蛋白的稳定细胞株。以RT-PCR分析目的基因转录;间接免疫荧光检测融合蛋白表达;Western blot和小鼠(Mus musculus)免疫试验检测融合蛋白免疫原性。结果表明,RT-PCR检测到3种目的基因的转录;间接免疫荧光检测到融合蛋白得以表达,Western blot检测到融合蛋白可与阳性猪血清发生特异性反应。小鼠免疫试验二免后S/P=样本/阳性对照的比率,达到1.80(S/P>0.4为阳性),并且至少可以持续1个月。本研究成功实现了PRRSV GP3-GP5-M融合蛋白在哺乳动物细胞中的表达,证实PRRSV GP3-GP5-M融合蛋白具有良好的免疫原性,为PRRSV多基因核酸疫苗研制提供了基础资料。

关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV) GP3-GP5-M 蛋白表达

基于TaqMan探针的猪繁殖与呼吸障碍综合症病毒实时荧光定量PCR方法的建立

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中国人兽共患病学报 2012年第6期28卷 579-582,596页

作者：祝秀梅马全英杜平王凡吕志慧牟克斌中农威特生物科技股份有限公司兰州730046

目的建立一种能检测猪繁殖与呼吸障碍综合症病毒(PRRSV)的TaqMan探针荧光定量PCR方法。方法根据PRRSV的ORF7基因保守区的核苷酸序列设计引物和TaqMan探针,通过探针浓度的优化,建立检测PRRSV的TaqMan探针荧光定量PCR方法。用该方法对30... 详细信息

目的建立一种能检测猪繁殖与呼吸障碍综合症病毒(PRRSV)的TaqMan探针荧光定量PCR方法。方法根据PRRSV的ORF7基因保守区的核苷酸序列设计引物和TaqMan探针,通过探针浓度的优化,建立检测PRRSV的TaqMan探针荧光定量PCR方法。用该方法对30份临床疑似病料进行检测,并与常规RT-PCR方法和病毒分离方法进行比较。结果 TaqMan荧光PCR检测PRRSV的最佳探针浓度为0.4μmol,检测灵敏度可达3.51拷贝/μL。检测的30份样品与病毒分离结果的符合率为100%,与普通PCR的检测结果(25/30)比较,本方法对临床样品的检出率(28/30)更高。结论建立的方法特异性强、敏感性高、重复性好,可用于临床样品的检测。

关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒 ORF7基因 TaqMan荧光定量PCR

过硫酸氢钾复合物粉对口蹄疫病毒杀灭效果试验

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湖北农业科学 2013年第8期52卷 1877-1879页

作者：乔莉萍黄银君薛飞群张强周卫马全鸿牟克斌刘学荣中农威特生物科技股份有限公司兰州730046 临洮威特药业有限公司甘肃临洮730500 中国农业科学院上海兽医研究所上海200241 中国农业科学院兰州兽医研究所兰州730046

以过硫酸氢钾复合物粉对口蹄疫病毒(Foot and mouth disease virus,FMDV)的杀灭效果进行了研究。将过硫酸氢钾复合物粉以不同比例稀释后对小白鼠、成年鼠、白兔分别进行皮下注射、灌服、斑贴试验进行消毒剂安全性试验,对病毒悬液进行了... 详细信息

以过硫酸氢钾复合物粉对口蹄疫病毒(Foot and mouth disease virus,FMDV)的杀灭效果进行了研究。将过硫酸氢钾复合物粉以不同比例稀释后对小白鼠、成年鼠、白兔分别进行皮下注射、灌服、斑贴试验进行消毒剂安全性试验,对病毒悬液进行了消毒剂灭活病毒效果试验。结果表明,过硫酸氢钾复合物粉1∶100倍及以上稀释对小白鼠、成年鼠及白兔安全;消毒剂100%杀灭口蹄疫病毒的最高稀释度为1∶1 200。过硫酸氢钾复合物粉对口蹄疫病毒有良好的杀灭效果。

关键词：口蹄疫病毒过硫酸氢钾复合物粉杀灭效果

猪繁殖与呼吸综合征病毒NX-1株ORF5基因的克隆与分析

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猪繁殖与呼吸综合征病毒NX-1株ORF5基因的克隆与分析

猪瘟病毒E2蛋白主要抗原区编码基因的原核表达及抗原性研究

中国畜牧兽医学会生物制品学分会中国微生物学会兽医微生物...

作者：杜平刘学荣黄银君牟克斌中农威特生物科技股份有限公司

采用RT-PCR技术扩增了PRRS NX-1/2008株囊膜蛋白基因ORF5,并对其进行了克隆,同时利用生物软件进行了同源性比对和进化性分析。结果显示,PRRSV NX-1/2008株的ORF5与JXa-1/2007等高致病性毒株高度同源,氨基酸同源性达到了99%。NX-1株ORF5... 详细信息

采用RT-PCR技术扩增了PRRS NX-1/2008株囊膜蛋白基因ORF5,并对其进行了克隆,同时利用生物软件进行了同源性比对和进化性分析。结果显示,PRRSV NX-1/2008株的ORF5与JXa-1/2007等高致病性毒株高度同源,氨基酸同源性达到了99%。NX-1株ORF5基因与空间距离较远的JXa-1/2007毒株在中和抗体决定区196位发生突变,而与HUB-1/2006及CH-1a/2001等相距较近的毒株没有此突变;与CH-1a/200毒株相比,免疫原性核心位点B的39位F→I,在诱导中和抗体起重要作用的33位糖基化位点N→S,同时,诱骗位点A(30～38aa)的32、33和35位氨基酸都发生了突变。表明PRRSV高致病性毒株与低致病性毒株的抗原性在基因组上有较大范围的变异,且这种变异可能还主要位于免疫决定区。

关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒 ORF5基因克隆与分析

来源： cnki会议评论

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中国畜牧兽医 2013年第3期40卷 43-45页

作者：刘萍王宏博祁光宇刘学荣牟克斌中农威特生物科技股份有限公司甘肃兰州730046 中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所甘肃兰州730050

本试验旨在分析猪瘟病毒E2蛋白的免疫反应,应用RT-PCR方法扩增了编码猪瘟病毒兔化弱毒疫苗株C株囊膜糖蛋白E2基因主要编码区,并定向克隆到表达载体pET-30a-c(+)中,获得重组表达载体pET30a-E2,将其转化大肠杆菌Rosetta(DE3)感受态细胞,经... 详细信息

本试验旨在分析猪瘟病毒E2蛋白的免疫反应,应用RT-PCR方法扩增了编码猪瘟病毒兔化弱毒疫苗株C株囊膜糖蛋白E2基因主要编码区,并定向克隆到表达载体pET-30a-c(+)中,获得重组表达载体pET30a-E2,将其转化大肠杆菌Rosetta(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导表达。SDS-PAGE和Western blottin分析结果表明,E2基因获得高效融合表达,且具有免疫反应活性。本试验为建立E2抗原的检测试剂盒奠定基础。

关键词：猪瘟病毒 E2蛋白原核表达抗原性

PRRSV-GSLZ-1/2009细胞毒和组织毒致病特征的比较

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微生物学通报 2011年第1期38卷 63-69页

作者：杜平尚佑军刘学荣董文教贺延玉黄银君牟克斌中农威特生物科技股份有限公司甘肃兰州730046 中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室农业部畜禽病毒学重点实验室围家口蹄疫参考实验室甘肃兰州730046 甘肃农业大学研究测试中心甘肃兰州730070

为了研究猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)野毒株在细胞适应中的遗传变异与其致病性的关系。在进行遗传变异分析后,将GSLZ-1/2009细胞适应毒和组织毒同时接种36日龄健康仔猪,对感染... 详细信息

为了研究猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)野毒株在细胞适应中的遗传变异与其致病性的关系。在进行遗传变异分析后,将GSLZ-1/2009细胞适应毒和组织毒同时接种36日龄健康仔猪,对感染后的临床症状、体征变化、抗体及炎性因子水平进行了实时监测和动力学分析,并对组织病变进行了显微观察。结果显示:在细胞适应过程中致病相关基因并未发生任何突变,但细胞适应株所诱发的抗体及炎症因子反应均明显较组织毒弱,且所造成的病理损伤也比较轻微。表明PRRSV野毒株在细胞适应过程中毒力会减弱,而毒株的弱化可能由遗传变异之外的因素决定。

关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒病毒特性致病特征