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核酸外切酶Ⅷ截短体的重组表达及其在体外DNA重组反应中的应用

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生物工程学报 2019年第5期35卷 827-836页

作者：朱燕韩小韦牛毅男郑蓓李学俊徐全乐陈鹏西北农林科技大学生命科学学院陕西杨凌712100

核酸外切酶Ⅷ(ExonucleaseⅧ,ExoⅧ)是一种不依赖于ATP的dsDNA 5?-3?核酸外切酶,可作为体外DNA重组反应极具应用价值的候选蛋白。目前关于ExoⅧ在体外DNA重组反应中的应用尚未有文献报道。本研究构建了保留完整外切活性的截短ExoⅧ(Trun... 详细信息

核酸外切酶Ⅷ(ExonucleaseⅧ,ExoⅧ)是一种不依赖于ATP的dsDNA 5?-3?核酸外切酶,可作为体外DNA重组反应极具应用价值的候选蛋白。目前关于ExoⅧ在体外DNA重组反应中的应用尚未有文献报道。本研究构建了保留完整外切活性的截短ExoⅧ(Truncated exonucleaseⅧ,tExoⅧ)的重组表达载体pET28a-tExoⅧ,实现了tExoⅧ在大肠杆菌中的高效表达,在纯化获得高纯度蛋白的基础上,对体外重组反应的温度、反应时间、同源臂长度等因素进行了优化分析。研究结果表明,tExoⅧ在大肠杆菌中以可溶性形式高效表达,每升可纯化92.40 mg tExoⅧ,比活力为1.21×10~5 U/mg;在10μL的重组体系中,2.5 U的tExoⅧ于25℃反应12.5min随后50℃保温50 min时重组效率最高。添加Pfu DNA聚合酶的体外同源臂延伸策略可以有效提高重组克隆的效率。以转化效率为2.2×10~6 CFU/μg的Mach1T1为受体细胞,对于含有21 bp同源臂的1 kb片段与5.8 kb线性化载体的重组,每微克载体可形成1.1×10~4个重组克隆,且阳性率大于80%。同源臂长度在8–21bp范围内,重组反应效率随着同源臂长度增加而提高。在最佳反应条件下,同源臂长度仅为8bp仍可实现有效的重组反应。ExoⅧ介导的体外重组体系具有酶制备方法简单、对DNA的克隆无酶切位点限制及高重组克隆效率等显著优点,是分子生物学领域具有潜在应用价值的高效基因克隆新体系。

关键词：核酸外切酶Ⅷ截短体表达纯化体外同源重组

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黄瓜矮生突变体C1056的茎解剖结构及其生理特性分析

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西北植物学报 2019年第3期39卷 445-452页

作者：刘梦迎王金牛毅男靳卓帅刘朋张馨瑜李玉红西北农林科技大学园艺学院陕西杨陵712100

该研究以黄瓜矮生突变体C1056和野生型CCMC为材料,对其主要生理特性、叶绿体超微结构以及茎显微结构进行了观察、测定和比较分析,以探讨黄瓜株高调控机理并挖掘新的矮化种质,为黄瓜的矮化育种提供依据。结果显示:(1)突变体C1056的株高... 详细信息

该研究以黄瓜矮生突变体C1056和野生型CCMC为材料,对其主要生理特性、叶绿体超微结构以及茎显微结构进行了观察、测定和比较分析,以探讨黄瓜株高调控机理并挖掘新的矮化种质,为黄瓜的矮化育种提供依据。结果显示:(1)突变体C1056的株高较野生型极显著变矮,且叶色加深、叶脉加粗、叶尖内卷、叶片皱缩,但茎粗、节间数与野生型无显著差异,而节间长度极显著低于野生型。(2)茎横切显微结构显示,突变体的维管束数量与野生型无显著差异,但导管直径缩小;纵切结果显示,突变体茎节间细胞长度变短,细胞变小,细胞数目略有补偿。(3)与野生型相比,突变体的叶绿素和类胡萝卜素含量均有不同程度的下降,叶绿素/类胡萝卜素和叶绿素a/b的比值明显增高。(4)突变体叶绿素荧光各参数与野生型相比无明显变化;突变体的净光合速率较野生型降低8%,气孔导度、蒸腾速率较野生型分别提高15%和10%,但差异均不显著,而胞间CO2浓度显著高于野生型。(5)透射电镜观察结果发现,与野生型相比,突变体的叶肉细胞比较小,叶绿体所占细胞面积明增大,且叶绿体形状为半圆形和纺锤形,部分非正常结构的叶绿体的大部分基质、基粒片层未完全分化且不清晰,垛叠不整齐。研究表明,黄瓜矮生突变体C1056的矮化主要因其节间长度缩短以及细胞变小所致,且突变体的叶绿体结构受到一定程度的影响,但并未明显影响其光合能力。

关键词：黄瓜矮化突变体生理特性分析显微结构观察

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粪肠球菌源EndoE的重组表达及酶学性质研究

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农业生物技术学报 2019年第6期27卷 1118-1125页

作者：韩小韦黄云娜牛毅男李学俊徐全乐陈鹏西北农林科技大学生命科学学院广州市从化区从化中学

内切-β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(Endo-β-N-acetylglucosaminidase, ENGase, EC3.***.1.96)是糖蛋白去糖基化重要的工具酶,其可以切割糖蛋白上N-连接的聚糖。本研究基于粪肠球菌(Enterococcus faecalis)基因组数据,通过PCR扩增ENGase基因endoE (endoglycosidase E),并以同源重组方式构建表达载体pET-28a-endoE,实现了EndoE在大肠杆菌(Escherichia coli) BL21 Star (DE3)中的高效表达,并对EndoE去糖化的催化特性等进行了较为系统的分析。研究结果显示,重组EndoE在大肠杆菌中以可溶形式表达,经钴离子螯合层析与阴离子交换层析可获得高纯度的目标蛋白,产量为45.6 mg/L。去糖基化活性分析表明,重组EndoE能去除天然及变性核糖核苷酸酶B (ribonuclease B, RNase B)、鸡卵白蛋白(ovalbumin, Ova)和免疫球蛋白G (immune globulin G, IgG) N-连接的糖基侧链。基质辅助激光解吸/电离串联飞行时间质谱证实了EndoE对RNase B N-连接糖链的水解活性。Endo E在20～50℃和pH 4.0～6.0的范围内均具有良好的水解活性,并对100 mmol/L二硫苏糖醇(DL-dithiothreitol, DTT)、1 mol/L NaCl和2%Triton X-100具有耐受性。EndoE较已报道的粪肠球菌来源的ENGase具有更为广泛的底物作用范围,是蛋白质糖基化分析中有潜在应用价值的工具酶。

关键词：内切-β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(ENGase) N-糖基化重组表达酶学性质

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岩质高边坡开挖及支护条件下稳定性数值模拟

中国农村水利水电 2010年第6期 134-137页

作者：贾欣媛任光明姚男牛毅成都理工大学地质灾害防治与地质环境保护国家重点实验室成都610059 天津市地质调查研究院天津300191

岩质边坡在开挖过程中,由于层面、裂隙、节理等复杂结构面类型的存在,严重影响其稳定性。以某水电站岩质边坡工程为例,综合考虑岩体风化卸荷作用、断层岩脉发育、开挖边坡高陡的特点,采用有限元法,对边坡开挖、支护进行数值模拟,得出了... 详细信息

岩质边坡在开挖过程中,由于层面、裂隙、节理等复杂结构面类型的存在,严重影响其稳定性。以某水电站岩质边坡工程为例,综合考虑岩体风化卸荷作用、断层岩脉发育、开挖边坡高陡的特点,采用有限元法,对边坡开挖、支护进行数值模拟,得出了工程边坡的应力状态、变形破坏区以及松弛范围,在此基础上分析了边坡开挖支护条件下的稳定性,论证了支护方案设计的合理性,并以此来指导施工,为同类型边坡的稳定性评价提供参考。

关键词：岩质边坡开挖支护稳定性锚固效果有限元法

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