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*** γ-谷氨酰转肽酶的重组表达、酶学性质及其在谷氨酸发酵中应用的研究

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*** γ-谷氨酰转肽酶的重组表达、酶学性质及其在谷氨酸发酵中应...

作者：熊爱英南京师范大学

学位级别：硕士

γ-谷氨酰转肽酶（GGT）是广泛分布于动植物及微生物体内的特异酶,能专一性催化y-谷氨酰基化合物中的γ-谷氨酰键断裂,释放出谷氨酸,表现为水解作用;同时也能将y-谷氨酰基转移到氨基酸及小肽上,生成新的γ-谷氨酰化合物,表现为转肽作用... 详细信息

γ-谷氨酰转肽酶（GGT）是广泛分布于动植物及微生物体内的特异酶,能专一性催化y-谷氨酰基化合物中的γ-谷氨酰键断裂,释放出谷氨酸,表现为水解作用;同时也能将y-谷氨酰基转移到氨基酸及小肽上,生成新的γ-谷氨酰化合物,表现为转肽作用。基于其双重催化特性,γ-谷氨酰转肽酶具有非常广阔的工业应用前景。目前,国内外对GGT的研究主要集中在各种γ-谷氨酰化合物的合成。然而,对于利用该酶制备谷氨酸却鲜有研究。目的本研究以谷氨酸生产菌株谷氨酸棒状杆菌的模式菌-*** ATCC 13032的GGT（CgGT）为研究对象,对该酶的重组表达、酶学性质、结构基础及其在*** icum发酵谷氨酸中的应用进行了系统的研究,旨在为今后进一步利用其工业化发酵谷氨酸奠定基础,同时也为其更深一步的分子学研究提供必要的参考。方法1.γ-谷氨酰转肽酶基因的克隆、表达及筛选:采用基因工程技术,对目的基因进行重组表达,通过SDS-PAGE及酶活的测定检测γ-谷氨酰转肽酶在不同启动子下的表达情况。2.重组谷氨酸棒状杆菌产酶的发酵优化:通过测定不同时间段的酶活及菌体密度,单因素及正交实验确定重组菌的最佳发酵条件。***酶的提取及性质研究:采用超声及高压均质机破壁,并使用镍柱对GGT进行分离纯化,通过γ-谷氨酰转肽酶活性的测定方法检测其酶学性质。***酶学特性的内在机制:通过生物信息学手段及定点突变技术进行分析。***在谷氨酸发酵中的应用:采用SBA-40E测定不同时间段的菌体发酵谷氨酸的含量。结果1.γ-谷氨酰转肽酶基因的克隆、表达及筛选:以*** ATCC 13032的基因组为模板,通过PCR技术,成功将其γ-谷氨酰转肽酶的基因（ggt）克隆至Ptac、PmaIEI及PH36三种不同启动子下,形成重组质粒pEKEx2-TC、pEKEx2-MC及pEKEx2-HC,将这三种穿梭质粒转化宿主谷氨酸棒状杆菌原始菌株进行诱导表达,成功筛选出GGT活性是对照组31倍的重组谷氨酸棒状杆菌PTC。2.重组谷氨酸棒状杆菌产酶的发酵优化:通过对筛选出的重组菌PTC的培养工艺进一步的优化,确定了其最佳培养条件为:30℃培养至菌体OD达1.2左右时,向发酵体系中添加终浓度为0.6 mmo l/L的IPTG,诱导培养至27 h;最优培养基为:在本课题组已有的培养基配方基础上,加入Tween-80 0.05%、正十六烷5.0%、山梨醇0.01%,且其最终发酵菌液GGT活力能达到869 U/L,比优化前其活性提高了将近22%。***酶的提取及性质研究:研究发现该γ-谷氨酰转肽酶属于重组菌PTC的周质酶。使用亲和层析对C端融有His标签的重组CgGT酶进行分离纯化,其分离效果明显,最终纯化后的蛋白酶表现的水解酶比活为5.84 U/mg,为其转肽酶活力的16.67倍。通过SDS-凝胶电泳分析,可知CgGT酶原的分子量为70 kDa,其成熟酶所含大小亚基分子量分别为48及22 kDa。CgGT水解酶的最适pH为7.0,最适反应温度为50℃,该酶在较宽的pH范围内稳定性较好,且重组酶CgGT具有相对较强的的耐热性,在45℃下处理24 h后其活力基本无损失。金属离子Mg2+、Ca2+、Mm2+、K+及Na+在浓度超过5 mol/L的情况下,对酶的活力均有明显的促进作用,尤其是在加入Mg2+和Mn2+的浓度分别为100 mmol/L和50 mmol/L时,CgGT的水解活性分别高达230和202%。***酶学特性的内在机制:通过对GGT酶的进化关系、序列比对、同源模型及定点突变的结果进行分析,可知,CgGT酶表现出的酶学性质特点主要是由其独特的底物结合区结构决定的。***在谷氨酸发酵中的应用:对强水解酶活性的CgGT提高自身***发酵谷氨酸产量的可行性进行初步的探讨,发现具有高GGT活性的重组菌PTC其在发酵过程中谷氨酸产生量明显高出阴性对照组PP,且在发酵至40 h时,其谷氨酸的产量相比对照组提高了 20%以上。此外,向发酵体系中加入一些酶底物γ-谷氨酰化合物（如Gln、GSH）后,重组菌PTC产酸量能得到进一步的提升,为对照组PP的5.29倍。结论本研究筛选出能高效表达*** ATCC 13032 GGT的重组谷氨酸棒状杆菌PTC,其GGT是一个耐温的水解酶,能显著提高***谷氨酸发酵产量。此外,该酶的耐热性及pH不敏感性,对其工业化应用具有较明显的优势,因此该研究对于今后工业化生产谷氨酸具有巨大的商业指导价值。

关键词： γ-谷氨酰转肽酶谷氨酸棒状杆菌酶学性质结构水解酶谷氨酸

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提高我省电力企业职工队伍素质的几点思考

中国电力教育 2000年第3期 7-9页

作者：熊爱英江西省电力公司!江西省南昌市330006

基于企业财务管理中精细化管理模式的运用分析

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大众投资指南 2020年第3期 123-124页

作者：熊爱英湖南财政经济学院

随着社会化进程的快速发展,我国市场经济正在与国家市场紧密相接,然而,由于我国企业的传统管理方式不能快速适应国际市场的变化,就需要改善企业的管理模式,使企业得以稳定的发展。就当前的企业财务管理而言,需要实行精细化的管理模式,... 详细信息

随着社会化进程的快速发展,我国市场经济正在与国家市场紧密相接,然而,由于我国企业的传统管理方式不能快速适应国际市场的变化,就需要改善企业的管理模式,使企业得以稳定的发展。就当前的企业财务管理而言,需要实行精细化的管理模式,这样才能提升企业内部管理水平。

关键词：企业财务管理精细化管理运用分析

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对心脏病患者濒死前的病情观察

中华护理杂志 1982年第5期 288-289页

作者：熊爱英江西宜春地区医院护理部

多年来,我在值班期间,遇到过不少由于各种心脏病而死亡的患者。通过细致观察,我发现多数患者在死亡前常有一个濒死过程,且死亡时间多在黎明前。一般心脏病患者在濒死期的主要表现有:①在临终前几小时,神志

关键词：心脏病患者痰鸣音喉头心跳骤停心脏骤停便意感

一站式护理急救模式在急性缺血性脑卒中患者抢救中的应用

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齐鲁护理杂志 2018年第23期24卷 34-37页

作者：熊爱英上海市第六人民医院金山分院上海市201599

目的:探讨一站式护理急救模式在急性缺血性脑卒中患者抢救中的应用效果。方法:选择2015年1～12月收治的98例急性缺血性脑卒中患者为对照组,采用传统救治模式;选择2016年1月～2017年3月收治的100例急性缺血性脑卒中患者为实验组,采用一... 详细信息

目的:探讨一站式护理急救模式在急性缺血性脑卒中患者抢救中的应用效果。方法:选择2015年1～12月收治的98例急性缺血性脑卒中患者为对照组,采用传统救治模式;选择2016年1月～2017年3月收治的100例急性缺血性脑卒中患者为实验组,采用一站式护理急救模式。通过救治时间(呼救到接诊时间、接诊到确诊时间、确诊到专科治疗时间)、神经功能状况[采用美国国立卫生院卒中量表(NIHSS)]、Barthel Index评定量表(BI)、救治效果(合并症、致残率、病死率)、就诊-应用静脉溶栓药时间(DNT)和患者满意度等指标评价两组急救效果。结果:实验组呼救到接诊时间、接诊到确诊时间、确诊到专科治疗时间均短于对照组(P <0. 01);出院时实验组NIHSS评分低于对照组(P <0. 05),BI评分高于对照组(P <0. 01);实验组病死率低于对照组(P <0. 05);实验组CT检查-用药时间和DNT明显短于对照组(P <0. 01);两组患者对护理工作的满意度比较差异有统计学意义(P <0. 01,P <0. 05)。结论:一站式护理急救模式可有效缩短急性缺血性脑卒中患者的救治时间,提高救护效率,可有效降低患者的病死率,并提高单病种的护理质量及患者对护理工作的满意度,在缺血性脑卒中患者救护中具有可行性,值得在临床中推广应用。

关键词：缺血性脑卒中一站式护理急救模式抢救护理

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全病程管理模式在腹膜透析患者管理中的效果

国际护理学杂志 2023年第23期42卷 4377-4380页

作者：朱紫英熊爱英陈晓莺上海市第六人民医院金山分院护理部 201599 上海市第六人民医院金山分院肾病科 201599

目的探讨全病程管理模式在腹膜透析患者管理中的效果。方法选取2020年2月至2023年1月在上海市第六人民医院金山分院接受腹膜透析治疗的患者120例, 经随机数字表法分成对照组及观察组, 各60例。对照组实施常规护理, 观察组实行常规护理... 详细信息

目的探讨全病程管理模式在腹膜透析患者管理中的效果。方法选取2020年2月至2023年1月在上海市第六人民医院金山分院接受腹膜透析治疗的患者120例, 经随机数字表法分成对照组及观察组, 各60例。对照组实施常规护理, 观察组实行常规护理联合全病程管理模式。比较两组患者的营养状况指标、生活质量(the World Health Organization Quality of Life-BREF, WHOQOL-BREF)的差异。结果干预前, 两组营养状况、WHOQOL-BREF评分比较差异均无统计学意义(均P>0.05);干预后, 观察组白蛋白、前白蛋白、血红蛋白水平均高于对照组, 营养不良炎症(Malnutrition Inflammation Score, MIS)评分低于对照组, 差异均有统计学意义(均P<0.05);干预后, 观察组WHOQOL-BREF评分高于对照组, 差异有统计学意义(P<0.05)。结论采取全病程管理模式可有效提升腹膜透析的管理效果, 加强营养状况, 改善患者的生活质量。

关键词：全病程管理模式腹膜透析护理管理

酵母乙醇提取物对重组大肠杆菌外源蛋白表达的影响

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安徽农业大学学报 2016年第3期43卷 366-372页

作者：朱岩岩熊爱英桑秀梅王晶王期殷志敏南京师范大学生命科学学院生物化学与生物制品研究所江苏省分子医学重点实验室南京210046

酵母乙醇提取物是利用啤酒干酵母经培养发酵后提取的富含多种活性物质的混合物。初步实验研究发现,该物质对大肠杆菌蛋白表达有明显促进作用。为了进一步研究其对蛋白表达的作用,以*** BL21（DE3）/p GEX-4t-1-ggt为主要研究菌,以2 g·... 详细信息

酵母乙醇提取物是利用啤酒干酵母经培养发酵后提取的富含多种活性物质的混合物。初步实验研究发现,该物质对大肠杆菌蛋白表达有明显促进作用。为了进一步研究其对蛋白表达的作用,以*** BL21（DE3）/p GEX-4t-1-ggt为主要研究菌,以2 g·L-1乳糖作为诱导剂,研究酵母乙醇提取物对γ-GGT蛋白表达的作用。研究发现,分批添加终浓度10 g·L-1的酵母提纯提取物到2 g·L-1的乳糖为诱导剂的培养基中可以显著提高γ-GGT蛋白的表达及宿主菌的生长,蛋白表达量比1 mmol·L-1 IPTG诱导效果高10%~50%,菌体密度提高1.75~3倍左右。对于其他的重组蛋白及表达宿主有相似的作用。酵母乙醇提取物与乳糖组成的复合制剂可以有效替代有毒性的IPTG作为诱导剂的使用,为大规模诱导蛋白表达奠定了基础。

关键词：酵母乙醇提取物乳糖诱导蛋白合成

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习近平文明交流互鉴观的方法论研究

习近平文明交流互鉴观的方法论研究

作者：熊爱姣山东师范大学

学位级别：硕士

自十八大以来,文化发展成为国家发展战略的重要内容,同时西方国家以“霸权”“威胁”质疑我国的发展和崛起。习近平从中华文明的文明性出发进行破题,揭示出文明相处的理想状态,在文明交流上形成了一系列新观点,蕴含着丰富的方法论内容... 详细信息

自十八大以来,文化发展成为国家发展战略的重要内容,同时西方国家以“霸权”“威胁”质疑我国的发展和崛起。习近平从中华文明的文明性出发进行破题,揭示出文明相处的理想状态,在文明交流上形成了一系列新观点,蕴含着丰富的方法论内容。该方法论作为新思想的重要内容,是马克思主义文明方法论在中国文明底色中的新阐释,是其继承与发展的重要过程,同时对新时代如何更好实现中国优秀传统文化的现代化发挥着指导作用,助力实现中国式现代化。本文立足于整体,以方法论作为研究新视角,对习近平文明交流互鉴观进行综合性研究,首先从理论基础和现实需求、主要内容和价值透析三角度分析从哪来,是什么,为什么三个问题,最终落实到如何做,以促进文明交流互鉴活动的进一步完善。第一部分从理论和实践两个角度出发,研究了习近平文明交流互鉴观的方法论产生于哪里,有什么样的理论基础和现实需求。其一,主要继承了马克思恩格斯、列宁、毛泽东、邓小平、江泽民、胡锦涛等人文明交流互鉴中的方法论基础和中华文明中“整体性和辩证性紧密结合”的方法论,文化强国战略和人类命运共同体为其提供了现实基础。第二部分从科学思维角度主要研究了习近平文明交流互鉴观方法论的主要内容。该部分结合习近平文明交流互鉴观的重要内容,从科学思维角度对方法论展开具体论述。首先,系统思维把握文明交流的总体趋势,指出了人类文明新形态的历史走向,主要包括:准确识变,统筹推进两个大局;科学应变,积极谋求战略主动;主动求变,科学谋划战略愿景;其次,创新思维直指当代文明相处之难题,以新方式解决旧问题,主要包括:批判错误思潮,突破霸权逻辑;提出文明交往原则,消解文明矛盾;再次,系统思维阐述文明交流如何推动文明从个体内部到整体的发展,主要包括立足交流过程,彰显文明价值;深化差异认知,构建文明整体;强化互鉴对话,推动社会发展;从次,历史思维从历史角度汲取文明发展的力量,主要概括为:以古鉴今和古为今用;最后,辩证思维方法重点分析了主导性和多样性辩证统一;民族性与世界性辩证统一;现实性和理想性辩证统一;普遍性和特殊性辩证统一。第三部分从理论和实践两个角度讲方法论的价值透析。理论方面,该方法论在继承马克思主义文明观的方法论的同时,以中国思维方式和语言特色展开拓展马克思主义文明主体间性理论,继承了中国特色社会主义理论体系中坚持独立自主的方法论,在守正创新的基础上进一步深化了文明发展的底气与志气。从解决文明问题,以人民为中心等角度提升了习近平新时代中国特色社会主义思想的高度。实践方面,该方法论确定了从时间到空间范围的文化汲取次序助力中国式现代化建设;增加文化的主体性,引导人民以“义”求利,建设人民的精神生活增强建设文化强国的精神力量;通过回应全球化时代之势,明晰文明良性互动的路径和载体夯实人类命运共同体的人文基础。第四部分研究了如何落实习近平文明交流互鉴观的方法论原则。从单个文明角度而言,在继承传统文化精髓的过程中形成文化认同,增强文化自信,推动本民族文化走出去;从不同文明个体而言,在遵循文明演进规律的过程中,推进文化价值共享,消除沟通的价值和心理障碍;从各民族文化的具体对话而言,要以人文交流为载体,以具体领域为依托,以一带一路为抓手,发挥人的主体性和能动性,推动文明以各种媒介实现交流交融。

关键词：文明交流互鉴观方法论科学思维

协同护理模式对改善居家腹膜透析患者自我护理能力的影响研究

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山西医药杂志 2021年第19期50卷 2834-2836页

作者：金吉平陈莉姚卫国熊爱英李丽钱佳依上海市第六人民医院金山分院护理部 201599 上海市第六人民医院金山分院肾内科 201599 上海市第六人民医院金山分院党办 201599 复旦大学附属金山医院门诊

腹膜透析是治疗终末期肾病的有效方式,而居家腹膜透析是一种在家庭成员帮助下进行换液及其他相关腹膜透析操作的治疗方式,可有效清除患者机体大部分代谢废物、多余的水分。但是居家腹膜透析需要准备工作较多,医疗团队也无法每天监督患... 详细信息

腹膜透析是治疗终末期肾病的有效方式,而居家腹膜透析是一种在家庭成员帮助下进行换液及其他相关腹膜透析操作的治疗方式,可有效清除患者机体大部分代谢废物、多余的水分。但是居家腹膜透析需要准备工作较多,医疗团队也无法每天监督患者腹膜操作的完成度,因此长期的居家腹膜透析期间需要患者有良好的自护能力。而协同护理是通过增进医患协同来提高患者自我护理能力的干预模式。

关键词：终末期肾病自护能力居家腹膜透析自我护理能力协同护理医疗团队代谢废物完成度