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经猪血管内皮细胞多次传代的CSFV E2基因的遗传变异研究

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西北农林科技大学学报（自然科学版） 2008年第8期36卷 31-35页

作者：温元鹏张彦明冶贵生邓文熊奎州王学艳西北农林科技大学动物医学院陕西杨凌712100

【目的】研究猪瘟病毒（CSFV）E2基因在猪脐静脉血管内皮细胞中多次传代后的遗传变异情况,为CSFV的致病机理研究提供理论依据。【方法】分离并培养猪脐静脉血管内皮细胞,接种猪瘟病毒石门株脾毒后继续培养,染毒细胞经3次连续传代后全部... 详细信息

【目的】研究猪瘟病毒（CSFV）E2基因在猪脐静脉血管内皮细胞中多次传代后的遗传变异情况,为CSFV的致病机理研究提供理论依据。【方法】分离并培养猪脐静脉血管内皮细胞,接种猪瘟病毒石门株脾毒后继续培养,染毒细胞经3次连续传代后全部死亡、脱落,收集每代细胞并提取总RNA,采用RT-PCR方法扩增CSFVE2基因。将获得的目的基因克隆入T载体并转化DH5α感受态细胞,提取重组质粒,进行PCR和BamHⅠ、HindⅢ酶切鉴定,将阳性的重组质粒进行测序,并用DNAStar软件进行序列分析。【结果】扩增出了E2基因,重组质粒PMD18-T-E2的PCR和双酶切鉴定结果表明,E2基因与pMD18-T载体连接成功。各代猪脐静脉血管内皮细胞中CSFVE2基因之间的核苷酸序列同源性为99.4%-99.9%,氨基酸序列同源性为98.9%-99.8%;各代猪脐静脉血管内皮细胞中的CSFVE2基因与标准病毒石门株之间的核苷酸序列同源性为98.9%-99.3%,氨基酸序列同源性为98.9%-99.2%。【结论】猪瘟病毒石门株在猪血管内皮细胞上传代的过程中E2基因无明显的变异,能保持遗传的稳定性。

关键词：猪瘟病毒 E2基因猪脐静脉血管内皮细胞序列分析

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猪骨髓基质细胞的分离培养及生物学特性研究

西北农林科技大学学报（自然科学版） 2008年第10期36卷 19-23页

作者：熊奎州张彦明王文秀温元鹏解林红张浩邓文西北农林科技大学动物医学院陕西杨凌712100

【目的】探讨猪骨髓基质细胞（bone marrow stromal cells,BMSCs）的体外分离培养方法,并对猪BM-SCs的生物学特性进行研究,旨在建立一种稳定的体外培养猪BMSCs的方法体系。【方法】分离刚出生猪的BMSCs进行体外培养,传代,分别观察原代... 详细信息

【目的】探讨猪骨髓基质细胞（bone marrow stromal cells,BMSCs）的体外分离培养方法,并对猪BM-SCs的生物学特性进行研究,旨在建立一种稳定的体外培养猪BMSCs的方法体系。【方法】分离刚出生猪的BMSCs进行体外培养,传代,分别观察原代及传代细胞的形态和分化特征,绘制生长曲线,测定细胞分裂指数和贴壁率。采用细胞免疫化学染色对碱性磷酸酶（ALP）进行检测,以确定成骨分化能力,并通过免疫组化法对表面分子CD44、CD34进行染色鉴定。【结果】猪BMSCs体外生长良好,细胞接种后1-2 d生长缓慢,2-5 d进入对数生长期,6 d后细胞数开始下降;猪BMSCs在第4天分裂指数最高,约为10%;猪BMSCs传代后10 h贴壁率最高,达90%以上。猪BMSCs ALP染色阳性率达到75%;CD44阳性率可达98.83%,而CD34在第2代后消失;猪BMSCs在第5代以前生长形态稳定,培养至7代后,衰老现象严重。【结论】该方法分离的猪BMSCs早期生长性状稳定,增殖速度快,并获得了高纯度的猪BMSCs,据此建立了一种稳定的体外培养猪BMSCs的方法体系。

关键词：骨髓基质细胞分离培养猪生物学特性

TGF-β_1基因真核表达载体的构建及在猪脐静脉内皮细胞中的表达

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畜牧兽医学报 2008年第6期39卷 832-836页

作者：王文秀邓文张彦明代晨熊奎州谢林红温元鹏西北农林科技大学动物医学院杨凌712100

应用RT-PCR技术从猪外周血单个核细胞扩增转化生长因子β1(Transforming growth factor-β1,TGF-β1)全基因,构建含有TGF-β1基因及EGFP报告基因的真核表达质粒pEGFP-C1-TGF-β1。采用脂质体法转染体外培养的猪脐静脉内皮细胞(SUVECs)后... 详细信息

应用RT-PCR技术从猪外周血单个核细胞扩增转化生长因子β1(Transforming growth factor-β1,TGF-β1)全基因,构建含有TGF-β1基因及EGFP报告基因的真核表达质粒pEGFP-C1-TGF-β1。采用脂质体法转染体外培养的猪脐静脉内皮细胞(SUVECs)后,通过直接荧光观察pEGFP-C1-TGF-β1融合蛋白在细胞中的分布定位,并通过RT-PCR、间接免疫荧光方法检测TGF-β1基因在SUVECs中的表达。结果在转染后1周观察到绿色荧光,RT-PCR、间接免疫荧光法检测TGF-β1表达均为阳性。本研究成功构建了含有绿色荧光蛋白基因的真核表达载体pEGFP-C1-TGF-β1,且TGF-β1基因在SUVECs中获得表达。

关键词：脐静脉内皮细胞转化生长因子β1(TGF-β1) 转染

转录靶向猪瘟病毒3′-UTRshRNA细胞株干扰猪瘟病毒增殖的检测

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畜牧兽医学报 2008年第6期39卷 746-751页

作者：郭抗抗徐浩张彦明张为民冶贵生熊奎州谢林红党如意西北农林科技大学动物医学院杨凌712100

对筛选的转录猪瘟病毒石门株3-′UTR shRNA的PK-15细胞株P-1（114-132位）、P-2（136-154位）和P-3（209-227位）分别接种猪瘟病毒（CSFV）,在接毒后第72和96小时用半定量反转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）检测CSFVNS3基因及-βactin基因... 详细信息

对筛选的转录猪瘟病毒石门株3-′UTR shRNA的PK-15细胞株P-1（114-132位）、P-2（136-154位）和P-3（209-227位）分别接种猪瘟病毒（CSFV）,在接毒后第72和96小时用半定量反转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）检测CSFVNS3基因及-βactin基因,以研究构建细胞株在转录水平上对CSFV增殖干扰的效果;接毒后第72、96和148小时以酶联免疫吸附试验（ELISA）方法检测细胞NS3蛋白表达量,通过OD490值分析构建细胞株在病毒蛋白表达水平上对CSFV增殖的影响。检测结果表明：（1）接毒后第72和96小时P-1、P-2和P-3细胞株中NS3基因的量明显减少,与接毒的空白PK-15细胞比较差异显著（P〈0.05）,说明P-1、P-2和P-3细胞株转录的shRNA能干扰CSFV RNA的转录;（2）接毒后第72和96小时P-1、P-2、P-3细胞株中NS3蛋白的表达量明显少于接毒的PK-15细胞（P〈0.05）,说明转录的shRNA在病毒蛋白水平上能干扰CSFVNS3基因的表达,但接毒后第148小时干扰效果有所降低。

关键词：半定量RT-PCR ELISA 猪瘟病毒 3′-UTR

TGF-β1诱导SUVEC向平滑肌样细胞转分化的初步研究

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上海交通大学学报（农业科学版） 2007年第5期25卷 478-482页

作者：王文秀张彦明熊奎州张浩邓文代晨西北农林科技大学动物医学院杨凌712100

用不同浓度TGF-1β对猪脐静脉血管内皮细胞(SUVEC)进行诱导,研究体外诱导SUVEC向平滑肌细胞分化的可能性。倒置显微镜下观察诱导前后细胞形态的变化,并采用免疫细胞化学SP法对细胞表面特异性标志物进行染色。结果表明,诱导后细胞失去内... 详细信息

用不同浓度TGF-1β对猪脐静脉血管内皮细胞(SUVEC)进行诱导,研究体外诱导SUVEC向平滑肌细胞分化的可能性。倒置显微镜下观察诱导前后细胞形态的变化,并采用免疫细胞化学SP法对细胞表面特异性标志物进行染色。结果表明,诱导后细胞失去内皮细胞典型的铺路石样形态,而呈现出肌成纤维样细胞;对诱导后的细胞进行免疫组化检测,发现5～***-1 TGF-1β诱导后,平滑肌特异性蛋白-αSMA的相对表达量均显著升高;而浓度升高为20 ***-1时,升高不显著;内皮细胞特异性标志(F-ⅧRAg)的表达均显著下降。该研究表明TGF-1β可诱导猪脐静脉血管内皮细胞向肌样细胞分化,但诱导分化的能力与TGF-1β的浓度有关。

关键词：脐静脉血管内皮细胞转化生长因子β1 转分化平滑肌样细胞

洮河上游林区云冷杉数量化林分蓄积量表的编制及其应用

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甘肃林业科技 1986年第3期 1-7页

作者：熊奎山费乙程弘甘肃省林业勘察设计院

前言洮河林区位于青藏高原的东北边缘,处于甘南高原与陇南山地交接地带,属于甘南藏族自治州的卓尼、临潭、夏河三县境内,北至白石山、南达迭山、东接岷县、西连碌曲草原。其地理位置在东经102°2′—104°47′,北纬34°10′—35°10′... 详细信息

前言洮河林区位于青藏高原的东北边缘,处于甘南高原与陇南山地交接地带,属于甘南藏族自治州的卓尼、临潭、夏河三县境内,北至白石山、南达迭山、东接岷县、西连碌曲草原。其地理位置在东经102°2′—104°47′,北纬34°10′—35°10′之间。林区全境属洮河水系,故称洮河林区。本区气候属高寒半湿润气候。冬长无夏,春秋期短,冬季干燥,春秋湿润,年

关键词：林分蓄积冷杉林云杉林区数量化量表编制