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人乳头状瘤病毒16亚型E6E7基因重组腺病毒的构建及其在小鼠骨髓源树突状细胞中的表达

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中国生物制品学杂志 2011年第1期24卷 25-29页

作者：焦庆昉潘巍巍易发平卜友泉刘革力陈全朱勇宋方洲重庆医科大学分子医学与肿瘤研究中心重庆400016 重庆医科大学免疫教研室重庆400016 重庆医科大学生物化学与分子生物学教研室重庆400016

目的构建人乳头状瘤病毒16亚型(Human papillomavirus 16,HPV16)E6E7基因重组腺病毒,并在小鼠骨髓源树突状细胞(Dendritic cell,DC)中表达。方法双酶切质粒pET-32a(+)-E6E7获得E6E7,基因片段,插入腺病毒穿梭质粒pAd-Track-CMV中,转染HEK293细胞,扩增病毒,经同源重组、包装后获得重组腺病毒pAd-E6E7,转染体外培养的小鼠骨髓源DC,激光共聚焦显微镜观察转染的小鼠DC的形态,流式细胞术检测转染前后小鼠DC表面标志物(CD40、CD86、MHCⅡ和CD11C),Western blot检测E6蛋白的表达。结果双酶切及测序证实,重组腺病毒质粒pAd-E6E7构建正确,插入的E6E7基因片段序列正确;转染HEK293细胞48 h,倒置荧光显微镜下可见绿色荧光蛋白的表达,重组腺病毒的滴度为3×107 CCID50/ml;重组腺病毒pAd-E6E7感染后DC的状态与成熟DC表面标志物(CD40、CD86、MHCⅡ和CD11C)相符合,感染后的DC表面有许多树枝状、刺状突起,符合成熟DC的表面形态;感染后的DC中存在E6蛋白的表达。结论已成功构建了HPV16 E6E7基因重组腺病毒表达质粒,其能在小鼠骨髓源DC中表达。

关键词：乳头状瘤病毒科 E6E7基因腺病毒科树突细胞

HPV 16 E6E7基因修饰树突状细胞疫苗诱导CTL致CaSki细胞凋亡体外实验研究

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中国免疫学杂志 2011年第2期27卷 115-119页

作者：焦庆昉易发平汪长东袁成福刘勒兰欢符少月艾青宋方洲重庆医科大学分子医学与肿瘤研究中心重庆400016 重庆医科大学免疫学教研室重庆400016 重庆医科大学生物化学与分子生物学教研室重庆400016

目的:采用人乳头状瘤-16(HPV-16)E6E7重组腺病毒(pAd-E6E7)转染树突状细胞(Dendritic cell,DC),观察基因修饰的DC疫苗诱导细胞毒性T淋巴细胞(Cytotoxic Tlymphocyte,CTL)致使CaSki细胞凋亡的效果。方法:将pAd-E6E7转染体外培养的小鼠未成熟树突状细胞制备DC疫苗,激光共聚焦显微镜观察转染的小鼠未成熟树突状细胞绿色荧光蛋白表达,流式细胞术检测转染前后小鼠树突状细胞表面标志物(CD40、CD86、MHCⅡ和CD11C)。DC疫苗诱导产生特异性细胞毒性T淋巴细胞,与CaSki细胞共培养后,采用DAPI、TUNEL及流式细胞术检测CaSki细胞凋亡情况。结果:pAd-E6E7成功转染体外培养的小鼠未成熟树突状细胞,体外转染效率约为40%～50%,成功制备了HPV16 E6E7基因修饰树突状细胞疫苗,诱导产生细胞毒性T淋巴细胞,经DAPI、TUNEL及流式细胞术检测证明CaSki出现凋亡。结论:以带有HPV16 E6E7基因的重组腺病毒载体转染DC制备基因修饰的DC疫苗,诱导CTL致使CaSki细胞出现凋亡。

关键词：人乳头状瘤病毒细胞毒性T淋巴细胞 CaSki细胞树突状细胞

雪蟾酊剂对豚鼠皮肤刺激反应和过敏反应的实验研究

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四川中医 2017年第1期35卷 42-44页

作者：张镇王恳杨万全王红李婕婷焦庆昉杨德蕾四川省中西医结合医院肿瘤科四川成都610041

目的:通过观察中药雪蟾酊剂对豚鼠皮肤的刺激反应及过敏反应的实验研究了解中药雪蟾酊剂的副反应情况。方法:皮肤刺激反应实验取健康白色豚鼠20只,随机分为两组:完整皮肤组和破损皮肤组,试验采取同体自身左右侧对比的方法,左侧涂75%乙... 详细信息

目的:通过观察中药雪蟾酊剂对豚鼠皮肤的刺激反应及过敏反应的实验研究了解中药雪蟾酊剂的副反应情况。方法:皮肤刺激反应实验取健康白色豚鼠20只,随机分为两组:完整皮肤组和破损皮肤组,试验采取同体自身左右侧对比的方法,左侧涂75%乙醇作为对照组,右侧涂雪蟾酊剂,分别观察1、24、48及72小时受试区皮肤红斑、水肿的变化情况;皮肤过敏反应实验取白色健康豚鼠60只,随机分为四组:雪蟾酊剂组、乙醇组、二硝基氯苯组、蒸馏水组,每组分别与受试药物接触6小时之后去除受试药物,分别观察即刻、24、48、72小时的过敏反应情况,计算过敏反应平均分值和过敏率。结果:(1)皮肤刺激反应实验:完整皮肤组1、24、48、72小时受试区皮肤未见红斑及水肿表现;破损皮肤组1、24、48、72小时受试区皮肤红斑水肿区域直径逐渐缩小,双侧对比无统计学差异(P>0.05)。(2)皮肤过敏反应实验:四组豚鼠过敏反应分值和过敏率分别是:雪蟾酊剂组0.27、0%;乙醇组0.33、6.7%;二硝基氯苯组7.6、86.67%;蒸馏水组0.2、0%。四组比较,雪蟾酊剂组、乙醇组与蒸馏水组比较无统计学差异(P>0.05),雪蟾酊剂组、乙醇组与二硝基氯苯组比较具有显著统计学差异(P<0.01)。

关键词：雪蟾酊剂皮肤刺激反应过敏反应

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鸭MCHR2的基因克隆及蛋白表达鉴定

中国药理学通报 2010年第11期26卷 1520-1522页

作者：朱勇汪长东刘革力袁成福卜友泉易发平焦庆昉艾青刘竹兰欢武向梅宋方洲胡平生 Tomas Hokfelt 重庆医科大学分子医学与肿瘤研究中心生物化学与分子生物学教研室重庆400016 Karolinska Instituter Stockholm Sweden SE-11276/S-17177

目的筛查能够稳定表达黑色素浓集激素受体2(MCHR2)基因的动物,为构建动物模型提供实验依据。方法利用逆转录-多聚酶链反应(RT-PCR)方法,从新鲜的鸭、Wista鼠、SD鼠、C3H10鼠、C57鼠、狗、羊、猪等大脑组织中提取总RNA,以此扩增MCHR2基... 详细信息

目的筛查能够稳定表达黑色素浓集激素受体2(MCHR2)基因的动物,为构建动物模型提供实验依据。方法利用逆转录-多聚酶链反应(RT-PCR)方法,从新鲜的鸭、Wista鼠、SD鼠、C3H10鼠、C57鼠、狗、羊、猪等大脑组织中提取总RNA,以此扩增MCHR2基因的全长cDNA编码区序列;利用Western blot检测鸭、犬和猪的大脑海马区及皮质区MCHR2蛋白的表达情况。结果通过RT-PCR获得鸭、犬、猪脑组织中的目的片段;通过Western blot验证了MCHR2蛋白在鸭脑组织中具有高表达。结论将鸭作为构建动物模型的对象,用于MCHR2基因的相关功能研究具有可行性。

关键词： MCHR2 MCR RT-PCR Western blot 鸭肥胖

YAP干扰腺病毒载体对宫颈癌增殖、迁移及侵袭的影响

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安徽医药 2021年第6期25卷 1136-1139,I0004页

作者：王红王恳焦庆昉杨万全张镇李婕婷吴扶生王瑾四川省中西医结合医院肿瘤科四川成都610041 中国人民解放军联勤保障部队第九八九医院血液科河南洛阳471003

目的探索YAP蛋白对宫颈癌细胞的恶性增殖、迁移及侵袭性的作用。方法分别以腺病毒靶向YAP干扰载体(pAd-si-YAP)、重组空载体腺病毒(pAd-mock)或磷酸缓冲盐溶液(PBS)感染CaSki细胞。采用定量聚合酶链反应(qPCR)、蛋白质印迹法(Western bl... 详细信息

目的探索YAP蛋白对宫颈癌细胞的恶性增殖、迁移及侵袭性的作用。方法分别以腺病毒靶向YAP干扰载体(pAd-si-YAP)、重组空载体腺病毒(pAd-mock)或磷酸缓冲盐溶液(PBS)感染CaSki细胞。采用定量聚合酶链反应(qPCR)、蛋白质印迹法(Western blotting)、四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法(MTT法)、流式细胞法、划痕试验以及细胞侵袭试验分别分析感染后CaSki细胞的YAP mRNA表达、YAP蛋白表达、细胞增殖活力、细胞周期及凋亡、细胞迁移能力以及细胞侵袭能力。结果qPCR结果显示Ad-si-YAP感染CaSki细胞的YAP mRNA表达明显低于pAd-mock感染的CaSki细胞及PBS处理的CaSki细胞[(22.01±0.24)比(80.12±0.31)、(84.18±0.22),P<0.05],表明Ad-si-YAP可以抑制YAP基因转录。蛋白质印迹法结果显示Ad-si-YAP感染CaSki细胞的YAP蛋白表达低于pAd-mock感染的CaSki细胞及PBS处理的CaSki细胞[(0.6±0.018)比(1.5±0.031)、(1.8±0.27),P<0.05]。MTT结果显示24 h后pAd-mock感染的CaSki细胞及PBS处理的CaSki细胞增殖明显快于Ad-siYAP感染CaSki细胞(P<0.05)。流式细胞结果显示通过沉默YAP后,CaSki细胞周期停滞于G0/G1期明显增加(P<0.05),同时CaSki细胞增多(P<0.01)。划痕试验发现沉默YAP后CaSki细胞的迁移能力下降[(40.01±0.16)比(81.02±0.22)、(86.04±0.31),P<0.05],说明YAP可以促进CaSki细胞迁移。细胞侵袭试验发现沉默YAP后CaSki细胞的侵袭能力下降[(120±4)比(640±3)、(680±4),P<0.05]。结论YAP蛋白的表达可导致宫颈癌细胞的恶性增殖、迁移及侵袭,是应用于宫颈癌综合治疗的一个潜在靶点。

关键词：子宫肿瘤 YAP Hippo信号通路 CaSki细胞恶性增殖迁移侵袭

金水六君煎加减联合化疗对晚期非小细胞肺癌患者免疫功能的影响及其作用机制的探讨

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内蒙古中医药 2021年第6期40卷 71-73页

作者：张镇焦庆昉杨万全王红李婕婷吴扶生王恳四川省中西医结合医院四川成都610041

目的:探讨金水六君煎加减联合化疗对晚期非小细胞肺癌患者免疫功能影响及其作用机制。方法:选取于我院肿瘤科就诊的晚期非小细胞肺癌患者68例,按随机数表法分为对照组和观察组,各34例。对照组采用GP方案化疗,观察组在对照组基础上加服... 详细信息

目的:探讨金水六君煎加减联合化疗对晚期非小细胞肺癌患者免疫功能影响及其作用机制。方法:选取于我院肿瘤科就诊的晚期非小细胞肺癌患者68例,按随机数表法分为对照组和观察组,各34例。对照组采用GP方案化疗,观察组在对照组基础上加服金水六君煎加减煎剂。观察T细胞亚群及Treg细胞、CD8^(+)T细胞表面NKG2D和NKG2A。结果:观察组CD4^(+)细胞、CD8^(+)细胞、CD4^(+)/CD8^(+)和治疗前以及对照组相比均有升高,同时Treg细胞和治疗前以及对照组相比均有下降。观察组的NKG2D较治疗前有升高,NKG2A较治疗前有所下降,而对照组的NKG2D较治疗前有所升高,且NKG2A较治疗前有下降,但观察组的NKG2D较对照组有所升高,NKG2A较对照组有下降。结论:在化疗过程中联合应用金水六君煎可以增强免疫功能,使患者受益。

关键词：金水六君煎晚期非小细胞肺癌免疫功能