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微滴式数字PCR定量检测伯氏考克斯氏体方法的建立及应用

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广西农学报 2024年第2期39卷 26-33页

作者：王亚鹏曲瑶张皓博李嘉琪焉鑫孙淑芳孙翔翔欧阳康广西大学广西南宁530005 中国动物卫生与流行病学中心山东青岛266032 山东农业大学山东泰安271000 农业农村部动物生物安全风险预警及防控重点实验室(南方) 山东青岛266032 农业农村部反刍动物重大疫病防控重点实验室(东部) 山东青岛266032

为建立伯氏考克斯氏体(Coxiella burnetii,Cb)微滴式数字PCR(Droplet Digital PCR, ddPCR)检测方法,研究以Cb IS1111基因为靶基因,并针对基因保守区域设计了特异性引物和探针,以使反应的条件更加完善,从而构建了ddPCR检测方法,并对该方... 详细信息

为建立伯氏考克斯氏体(Coxiella burnetii,Cb)微滴式数字PCR(Droplet Digital PCR, ddPCR)检测方法,研究以Cb IS1111基因为靶基因,并针对基因保守区域设计了特异性引物和探针,以使反应的条件更加完善,从而构建了ddPCR检测方法,并对该方法的特异性、敏感性及重复性作出了评估。结果显示,所采用的ddPCR方法最低可检测的浓度为0.52 copies/μL,敏感性较高;与动物布鲁氏菌、牛结核分枝杆菌、土拉杆菌、金黄色葡萄球菌和沙门氏菌无交叉反应,特异性强;组内重复和组间重复变异系数均小于10%,重复性好。使用本实验建立的方法检测了42份疑似感染的临床样品,检测结果与荧光PCR鉴定结果一致。表明建立的ddPCR方法的特异性强、敏感性高、重复性和准确性好,可用于Cb的快速检测和精准定量,对Cb感染的防控具有重要意义。

关键词：伯氏考克斯氏体 Q热微滴式数字PCR 临床检测

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一种有效采集核酸气溶胶的方法

中国动物检疫 2024年第3期41卷 102-106页

作者：孙世雄焉鑫孙翔翔孙明军高玉斌孙静张培培王毓秀孙淑芳中国动物卫生与流行病学中心山东青岛266114

本试验旨在确定一种有效采集核酸气溶胶的方法,用于实验室核酸气溶胶污染的监测。将100μL pBR322质粒DNA均匀喷洒在体积为23 m^(3)的房间内,模拟核酸气溶胶污染。分别于喷洒后0 d(即喷洒当天)、5 d,在6个采样点上同时以对照组和试验组... 详细信息

本试验旨在确定一种有效采集核酸气溶胶的方法,用于实验室核酸气溶胶污染的监测。将100μL pBR322质粒DNA均匀喷洒在体积为23 m^(3)的房间内,模拟核酸气溶胶污染。分别于喷洒后0 d(即喷洒当天)、5 d,在6个采样点上同时以对照组和试验组方法采样,然后用实时荧光定量PCR检测样品。对照组用装有超纯水的离心管进行采样,试验组用气体采样泵连接过滤吸头进行采样。结果显示:在喷洒后0d采样检测时,试验组6个采样点的Ct平均值为22.732,低于对照组的25.027;在喷洒后5 d采样检测时,对照组只有3个采样点检测到Ct值,且皆高于相应试验组数据。在对布鲁氏菌分子生物学实验室核酸气溶胶的日常监测中,试验组方法同样显示出较高的敏感性。结果表明,试验组方法具有较高的采样效率,适用于实验室核酸气溶胶污染的监测。本研究为实验室核酸气溶胶污染监测提供了技术支撑。

关键词：核酸气溶胶气体采样泵实时荧光定量PCR 污染监测

荧光免疫层析技术原理及其在病原微生物检测中的研究进展

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中国动物检疫 2024年第1期41卷 67-71页

作者：苏华彬刘蒙达南文龙孙明军焉鑫毛迎雪曲瑶孙淑芳李桂梅樊晓旭中国动物卫生与流行病学中心山东青岛266032 青岛农业大学动物医学院山东青岛266109 农业农村部反刍动物重大疫病防控重点实验室(东部) 山东青岛266032 山东农业大学动物科技学院山东泰安271000

荧光免疫层析技术是近年来开发的一种新型免疫检测技术,以荧光微球为标记物,既保留了传统胶体金试纸条检测速度快、价格便宜、操作简单、携带方便等优点,又通过荧光技术提高了检测的灵敏度。荧光免疫层析技术对实验设备、资源的要求低,... 详细信息

荧光免疫层析技术是近年来开发的一种新型免疫检测技术,以荧光微球为标记物,既保留了传统胶体金试纸条检测速度快、价格便宜、操作简单、携带方便等优点,又通过荧光技术提高了检测的灵敏度。荧光免疫层析技术对实验设备、资源的要求低,特别适合在条件有限的实验室及野外开展动物疾病快速诊断。本文详细介绍了荧光免疫层析技术的原理及其在病毒、细菌、寄生虫等病原检测方面的应用研究,以期为病原微生物现场快速诊断技术的开发提供参考。

关键词：荧光免疫层析技术荧光微球病原微生物检测

基于不同抗原的犬布鲁氏菌病免疫层析胶体金抗体试纸条的制备和比较

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中国动物检疫 2024年第5期41卷 90-95页

作者：郭晓涵焉鑫邵卫星殷德辉闫昊南文龙樊晓旭孙世雄张培培孙翔翔刘蒙达张皓博孙淑芳孙明军徐州医科大学公共卫生学院江苏徐州221004 中国动物卫生与流行病学中心山东青岛266032 新疆维吾尔自治区动物卫生监督所新疆乌鲁木齐830011

为建立针对犬布鲁氏菌病的免疫层析胶体金快速检测方法,利用从犬种布鲁氏菌菌株提纯的膜蛋白和可溶性蛋白,原核表达纯化的外膜蛋白Omp31和BP26以及基于B细胞抗原肽的融合蛋白F14,分别制备了试纸条,然后采用犬布鲁氏菌病阳性和阴性血清,... 详细信息

为建立针对犬布鲁氏菌病的免疫层析胶体金快速检测方法,利用从犬种布鲁氏菌菌株提纯的膜蛋白和可溶性蛋白,原核表达纯化的外膜蛋白Omp31和BP26以及基于B细胞抗原肽的融合蛋白F14,分别制备了试纸条,然后采用犬布鲁氏菌病阳性和阴性血清,分别对上述试纸条进行敏感性和特异性比较。结果显示:Omp31抗原的敏感性最高,其次是F14和BP26,而全菌膜蛋白和全菌可溶性蛋白的敏感性较差;特异性上,使用由5种抗原制备的胶体金试纸条检测30份犬布鲁氏菌病阴性血清,结果均为阴性;5种试纸条与沙门氏菌、大肠杆菌(O157)、大肠杆菌(H7)、霍乱弧菌、副溶血弧菌、军团菌阳性血清均不发生交叉反应。另外,由F14和BP26制备的试纸条可识别羊布鲁氏菌病阳性血清,而由Omp31、全菌膜蛋白和全菌可溶性蛋白制备的试纸条均不能识别牛、羊布鲁氏菌病阳性血清。综上所述,Omp31、F14和BP26可作为制备犬布鲁氏菌病免疫层析胶体金检测卡的备选抗原。本研究为粗糙型布鲁氏菌引起的布鲁氏菌病的诊断提供了技术支撑。

关键词：犬布鲁氏菌病犬种布鲁氏菌外膜蛋白免疫层析胶体金检测卡

地震下考虑轨道约束的高速铁路桥梁行车安全性研究

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地震下考虑轨道约束的高速铁路桥梁行车安全性研究

作者：焉瑞鑫兰州交通大学

学位级别：硕士

我国高速铁路快速发展使得高速铁路桥梁覆盖了我国境内大面积的地震带,高速运行的列车将不可避免震时桥上行车。高速铁路桥梁所使用的无砟轨道系统具有一定的纵向刚度,改变了桥梁的地震响应,进而对地震作用下高速铁路桥梁的列车行驶安... 详细信息

我国高速铁路快速发展使得高速铁路桥梁覆盖了我国境内大面积的地震带,高速运行的列车将不可避免震时桥上行车。高速铁路桥梁所使用的无砟轨道系统具有一定的纵向刚度,改变了桥梁的地震响应,进而对地震作用下高速铁路桥梁的列车行驶安全性产生影响,那么地震下考虑轨道约束的高速铁路桥梁行车安全性的研究是具有重要意义的。本文的主要研究内容如下:(1)总结国内外学者在轨道约束对桥梁抗震性能影响和地震车桥耦合振动两个领域的研究现状。(2)以一座采用CRTSⅡ型板式无砟轨道系统的20×32m多跨简支梁桥为工程背景,在分析各构件间相互作用特点的基础上对复杂的线—桥系统进行简化,基于有限元软件Workbench分别建立了考虑CRTSⅡ型板式无砟轨道系统纵向刚度约束的线—桥模型和不考虑轨道约束的多跨简支梁桥模型。(3)基于SIMPACK软件建立了31自由度的车辆动力学模型,其中采用的参数化建模方法以方便调整不同车型进行后续研究。介绍了计算轮轨法向接触力的Hertz非线性弹性接触理论,以及计算轮轨切向接触力的简化Kalker理论及FASTSIM数值计算方法。并以SIMPACK的程序接口实现了车—线—桥联合仿真系统的建立。(4)以纵桥向的不同地震峰值加速度的地震激励和德国低干扰轨道不平顺激励,两种激励作为系统激励。分析了评价列车行驶安全性的三个指标。分别研究是否考虑无砟轨道系统纵向刚度约束的两个车—桥系统中,不同地震峰值加速度、不同列车行驶速度对列车安全行驶评价指标的影响特点,并分别给出两个系统下的列车安全行驶阈值。(5)通过对比对比分析两个系统下列车安全运行的阈值,得到CRTSⅡ板式无砟轨道系统的纵向刚度约束可使地震作用下高速铁路桥梁上列车安全行驶的阈值提高。

关键词：高速铁路桥梁地震激励车—桥耦合振动轨道约束行车安全

羊种布鲁氏菌Tat系统底物蛋白ErfK的抗原性和免疫原性研究

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中国动物检疫 2024年第5期41卷 96-103页

作者：吴瑶焉鑫孙明军屈海龙郭晓涵闫昊张培培孙世雄李嘉琪孙翔翔刘蒙达张皓博南文龙邵卫星王方昆樊晓旭孙淑芳中国动物卫生与流行病学中心山东青岛266032 山东农业大学动物医学院山东泰安271000 农业农村部动物生物安全风险预警及防控重点实验室(南方) 山东青岛266032 徐州医科大学公共卫生学院江苏徐州221004 新疆维吾尔自治区动物卫生监督所新疆乌鲁木齐830018 农业农村部反刍动物重大疫病防控重点实验室(东部) 山东青岛266032

为分析羊种布鲁氏菌双精氨酸转运系统(twin-arginine translocation system,Tat system)毒力相关底物蛋白L,D-转肽酶ErfK诱导宿主产生的免疫应答情况,首先对布鲁氏菌M28毒株ErfK基因序列(WP_002963714.1)进行生物信息学分析,参考序列设... 详细信息

为分析羊种布鲁氏菌双精氨酸转运系统(twin-arginine translocation system,Tat system)毒力相关底物蛋白L,D-转肽酶ErfK诱导宿主产生的免疫应答情况,首先对布鲁氏菌M28毒株ErfK基因序列(WP_002963714.1)进行生物信息学分析,参考序列设计引物,构建表达载体pET-30a(+)-ErfK,经IPTG诱导表达、亲和层析和镍柱纯化获得目的蛋白;利用SDS-PAGE和Western blot对重组ErfK(rErfK)蛋白进行抗原性鉴定;将rErfK蛋白免疫小鼠,分别在免疫后15、30和45 d收集血清和脾脏,检测蛋白免疫后小鼠的细胞免疫应答和体液免疫应答情况。生物信息学预测结果显示,ErfK蛋白无跨膜结构,为亲水性蛋白,有多个T细胞和B细胞抗原表位;SDS-PAGE和Western blot均可获得25 kDa的蛋白条带,重组蛋白可与布鲁氏菌阳性血清发生反应,证明rErfK有良好的抗原性;小鼠免疫试验结果显示,rErfK组小鼠脾脏CD8^(+)T细胞含量相比PBS组显著上升(P<0.05),且脾脏Th1型细胞因子IL-2、TNF-α、IFN-γ和Th2型细胞因子IL-4转录水平均显著上升(P<0.05),此外,rErfK免疫也能极显著诱导小鼠血清中总IgG和特异性IgG的产生(P<0.01)。上述结果表明,经大肠杆菌表达的布鲁氏菌rErfK蛋白可诱导小鼠产生良好的体液免疫和细胞免疫应答。本研究为基于ErfK蛋白的布鲁氏菌病诊断试剂和亚单位疫苗研发提供了参考依据。

关键词：布鲁氏菌 Tat系统底物蛋白L,D-转肽酶ErfK 抗原性免疫原性

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智能点检系统在设备管理中的应用

冶金设备 2023年第S2期 234-235页

作者：焉鑫凯包淑花首钢通钢矿业公司选矿厂吉林白山134304

选矿厂引入智能点检系统是提升设备管理水平的必要之举。本文通过需求分析,提出引进更适合具体应用场景的智能点检系统的观点,并围绕人员培训、仪器使用、点检制度等方面展开论述,解决了智能点检系统怎么用、怎么用好的问题,具有指导意义。

关键词：智能点检系统管理制度创新设备管理

大黄素与乳酸菌生物表面活性剂干预金黄色葡萄球菌生物被膜形成研究

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大黄素与乳酸菌生物表面活性剂干预金黄色葡萄球菌生物被膜形成研...

作者：焉鑫东北农业大学

学位级别：硕士

金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)是一种重要的常见病原菌,可以导致人或动物皮肤软组织的化脓,肺炎、胸膜炎、心内膜炎,甚至全身败血症等多种感染病症。在侵染部位形成生物被膜(bacterial biofilms,BF)是金黄色葡萄球菌的一个重... 详细信息

金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)是一种重要的常见病原菌,可以导致人或动物皮肤软组织的化脓,肺炎、胸膜炎、心内膜炎,甚至全身败血症等多种感染病症。在侵染部位形成生物被膜(bacterial biofilms,BF)是金黄色葡萄球菌的一个重要特征,病原菌形成生物膜不仅增强了病原菌本身的致病力,并且对抵抗宿主免疫系统和抗生素的能力大大提高,因此寻找新型有效的抗病原菌生物被膜药物已成为目前研究的前沿和热点。由于亚抑菌浓度下的抗生素易导致细菌产生耐药性的问题,在新型抗菌、抗生物被膜药物和药物靶标开发中,自然界的天然产物和中草药中有抗菌活性的单体小分子化合物,均成为新药研发的宝贵资源。另外,益生乳酸菌生物表面活性剂(BS)凭借优良的安全性和抗菌、抗粘附等生物活性,在研发生物医药、新型抗菌、抗生物被膜制剂方面有极大的应用前景。本研究首先以金黄色葡萄球菌为细菌生物被膜体外模型,首先考察了大黄素、木犀草素、黄芩苷、盐酸小檗碱4种中药单体抗金葡浮游菌活性,筛选出抗浮游菌活性良好的大黄素作为重点研究对象,考察亚MIC浓度下的大黄素对金黄色葡萄球菌体外生物被膜形成的干预作用并对其干预机制进行初步分析。结果显示,大黄素对金葡浮游菌生长(MIC:4～8μg/m L)和溶血素的释放均有良好的抑制作用,亚MIC浓度的大黄素(1/2MIC、1/4MIC)对金黄色葡萄球菌生物被膜的形成有抑制作用。扫描电镜(SEM)观察大黄素干预金黄色葡萄球菌生物被膜形成的形态学变化与结晶紫半定量黏附试验的结果相符合。针对大黄素对金黄色葡萄球菌生物被膜形成可能的干预机制,我们发现大黄素可以抑制金黄色葡萄球菌胞外DNA(e DNA)的释放,且呈剂量依赖性。利用real-time PCR技术检测发现亚MIC大黄素(1/2MIC、1/4MIC)浓度下,生物被膜形成的相关基因cid A、ica A、dlt B、agr A、sar A、sortase A m RNA表达水平显著下降。另外,亚MIC浓度的大黄素对金黄色葡萄球菌群体感应系统(QS)信号分子AI-2的释放也有一定影响。同样以金黄色葡萄球菌为细菌生物被膜体外模型,提取4株益生活性、抑菌活性良好的益生乳酸菌BS,对4株乳酸菌BS提取物的抗菌、抗粘附、抗生物被膜活性进行考察并对其抗生物被膜形成机制进行初步分析。结果显示,4组乳酸菌BS提取物对金黄色葡萄球菌浮游菌MIC值均大于100mg/mL,干预剂对浮游菌生长曲线的测定结果表明4组乳酸菌BS在12.5～50mg/m L浓度下对金黄色葡萄球菌浮游菌的生长没有影响。50mg/mL的4组乳酸菌BS对金黄色葡萄球菌溶血素释放的抑制作用明显。抗粘附实验结果表明4组乳酸菌BS在12.5～50mg/m L浓度下均可抑制细菌黏附。其中,两株瑞士乳杆菌所产BS抗黏附活性更好。结晶紫半定量黏附试验的结果显示,4组乳酸菌BS均有抑制金黄色葡萄球菌生物被膜形成的能力,其中,50mg/mL浓度下的4组乳酸菌BS干预金葡菌生物被膜形成的能力均显著(P<0.01)。扫描电镜对结晶紫半定量黏附实验的结果进行了验证。针对4株乳酸菌BS对金黄色葡萄球菌生物被膜形成可能的干预机制,利用RT-q PCR技术检测了4株乳酸菌BS在12.5～50mg/m L浓度下对金黄色葡萄球菌生物被膜形成相关基因mRNA表达水平的影响。结果显示,各组乳酸菌BS对生物被膜形成相关基因表达的影响各有不同,瑞士乳杆菌27058 BS主要下调表达了agr A、sarA基因,瑞士乳杆菌27170 BS下调表达了agr A、cid A基因,乳酸片球菌27167 BS明显抑制了ica A基因的表达;而植物乳杆菌27172 BS对cid A基因的表达抑制最为明显。以上结果表明,4株乳酸菌BS可能通过调控cid操纵子、ica操纵子和agr调节系统来影响金黄色葡萄球菌生物被膜形成相关基因的表达,从而影响金黄色葡萄球菌生物被膜的形成。此外,4组乳酸菌BS对金黄色葡萄球菌AI-2信号分子的释放均有影响,乳酸片球菌27167和瑞士乳杆菌27170 BS在12.5～50mg/mL浓度下对AI-2信号分子释放的抑制作用显著(P<0.05)。我们对4组乳酸菌BS进行SDS-PAGE蛋白电泳分析发现其中含有蛋白成分,并选择乳酸片球菌27167 BS 15KDa附近处的蛋白条带进行蛋白质谱分析,通过数据库比对和相关软件分析,该条带共检索到2种可能的蛋白。分别是:DNA starvation/stationary phase protection protein;ferritin-like dna-binding protein。鉴于大黄素、乳酸菌BS良好的抗生物被膜活性,本研究尝试将中药单体与乳酸菌BS联合使用抗细菌生物被膜。以大黄素、乳酸菌BS单

关键词：金黄色葡萄球菌生物被膜大黄素乳酸菌生物表面活性剂联合作用

有关国际组织在布鲁氏菌病防控中发挥作用的经验和启示

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中国兽医杂志 2023年第12期59卷 153-156,F0003页

作者：焉鑫孙明军南文龙邵卫星刘蒙达孙淑芳樊晓旭中国动物卫生与流行病学中心山东青岛266032

布鲁氏菌病(Brucellosis)是由布鲁氏菌(***)引起的慢性多器官损伤性人兽共患传染病。动物感染可引起流产和不育,人类感染会引起发热、肌肉和关节疼痛等,严重者完全丧失劳动能力[1]。该病严重威胁着养殖业健康发展、人类食品安全和公共... 详细信息

布鲁氏菌病(Brucellosis)是由布鲁氏菌(***)引起的慢性多器官损伤性人兽共患传染病。动物感染可引起流产和不育,人类感染会引起发热、肌肉和关节疼痛等,严重者完全丧失劳动能力[1]。该病严重威胁着养殖业健康发展、人类食品安全和公共卫生安全。鉴于此,在“同一健康”理念下,世界卫生组织(World Health Organization,WHO)、联合国粮食及农业组织(Food and Agriculture Organization of the United Nations,FAO)、世界动物卫生组织(World Organization for Animal Health,WOAH)和世界贸易组织(World Trade Organization,WTO)等国际组织高度重视对布鲁氏菌病的防控。

关键词：布鲁氏菌病人兽共患传染病世界动物卫生组织动物感染公共卫生安全关节疼痛世界贸易组织经验和启示