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过表达blaNDM-1、blaOXA-48基因的BL21(DE3)菌株的耐药性、适应性及其对MH-S细胞炎性反应的研究

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过表达blaNDM-1、blaOXA-48基因的BL21(DE3)菌株的耐药性、适应性...

作者：潘亚菲宁夏医科大学

学位级别：硕士

目的检测临床肠杆菌科细菌对碳青霉烯类抗生素的敏感性及其耐药基因;构建NDM-1、OXA-48过表达菌株,明确NDM-1、OXA-48对BL21(DE3)菌株耐药性和适应性的影响;同时探究过表达菌株对MH-S细胞炎性反应的影响以及过表达后细菌转录谱的变化。... 详细信息

目的检测临床肠杆菌科细菌对碳青霉烯类抗生素的敏感性及其耐药基因;构建NDM-1、OXA-48过表达菌株,明确NDM-1、OXA-48对BL21(DE3)菌株耐药性和适应性的影响;同时探究过表达菌株对MH-S细胞炎性反应的影响以及过表达后细菌转录谱的变化。方法1.采用WHONET5.6软件筛查2017-2019年宁夏地区某三甲医院碳青霉烯类耐药肠杆菌科细菌(carbapenem-resistant Enterobacteriaceae,CRE)分离株,统计其标本类型、科室分布和药敏结果;采用m CIM联合e CIM实验检测碳青霉烯酶表型;采用PCR法检测碳青霉烯酶耐药基因(NDM、OXA-48、KPC、VIM、IMP)并进行测序。2.构建pET32a(+)-OXA-48-BL21(DE3)、pRSFDuet-1-NDM-1-BL21(DE3)过表达载体,用SDS-PAGE和RT-PCR法检测NDM-1、OXA-48分别在大肠杆菌BL21(DE3)中的表达情况;K-B法测NDM-1及OXA-48过表达菌株的耐药性,通过生物膜形成实验和血清抵抗力实验检测细菌的适应性。3.将BL21(DE3)、pRSFDuet-1-NDM-1-BL21(DE3)、pRSFDuet-1-BL21(DE3)、pET32a(+)-OXA-48-BL21(DE3)和pET32a(+)-BL21(DE3)菌株分别与MH-S细胞共培养,利用RT-PCR方法检测细胞Toll样受体2、4(TLR2、TLR4)和NF-кB p65 m RNA的表达水平。4.将BL21(DE3)、pRSFDuet-1-NDM-1-BL21(DE3)、pRSFDuet-1-BL21(DE3)、pET32a(+)-OXA-48-BL21(DE3)和pET32a(+)-BL21(DE3)菌株分别与MH-S细胞共培养,采用ELISA法检测细胞因子IL-6、IL-10、TNF-α和TGF-β的表达情况。5.提取过表达细菌RNA后进行转录组测序和生物信息学分析。结果1.94株CRE中,40%分离自痰标本,16%分离自引流液,其余来自尿液标本、胆汁标本等。分离率较高的科室有ICU(20株)、PICU(17株)。94株CRE对头孢菌素类、β-内酰胺类等耐药率均在80%以上,对米诺环素和黏菌素B的耐药率较低,为26.60%和15.96%。92.55%(87/94)的CRE产碳青霉烯酶;其中79.31%(69/87)产金属酶,19.54%(17/87)产丝氨酸蛋白酶。耐药基因结果显示:检出率依次为bla 61.70%(58/94)、bla 34.04%(32/94)、bla 17.02%(16/94)、bla 14.89%(14/94)。bla 4.26%(4/94)。测序比对显示:bla 阳性均为KPC-2型,58株NDM阳性的菌株中有46株(79.31%)为NDM-5亚型,12株(20.69%)为NDM-1亚型。***-1-NDM-1-BL21(DE3)与pET32a(+)-OXA-48-BL21(DE3)菌株经IPTG诱导后均有蛋白和m RNA表达。在最佳诱导条件下使NDM-1、OXA-48过表达后,pRSFDuet-1-NDM-1-BL21(DE3)与pET32a(+)-OXA-48-BL21(DE3)菌株对IPM、MEM、CRO和FEP四种抗生素由敏感变为耐药,且在血清中存活率和生物膜生成显著增加(P<0.01)。***-1-NDM-1-BL21(DE3)和MH-S细胞共培养后,与pRSFDuet-1-BL21(DE3)组相比,TLR2在6h、12h的m RNA表达量显著增加(P<0.05);同时12h、24h的TLR4及NF-кB p65表达量显著增加(P<0.05);pET32a(+)-OXA-48-BL21(DE3)和MH-S细胞共培养后,与pET32a(+)-BL21(DE3)组相比TLR2在6h、12h的m RNA表达量显著增加(P<0.05);同时12h、24h的TLR4及NF-кB p65表达量显著增加(P<0.01)。***-1-NDM-1-BL21(DE3)和MH-S细胞共培养后,与pRSFDuet-1-BL21(DE3)组相比IL-6在12h的表达量显著增加(P<0.05);与正常细胞组相比TNF-α在6h、12h和24h的表达量均显著增加(P<0.01);pET32a(+)-OXA-48-BL21(DE3)和MH-S细胞共培养后,与pET32a(+)-BL21(DE3)组相比IL-6在12h、24h的表达量显著增加(P<0.05);与正常细胞组相比TNF-α在6h、12h和24h的表达量均显著增加(P<0.01)。***-seq

关键词： CRE NDM-1 OXA-48 耐药性 RNA-seq

含有bla_(OXA-48)基因BL21(DE3)菌株的转录组测序与分析

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中国病原生物学杂志 2023年第8期18卷 917-921,926页

作者：潘亚菲康宇婷刘文淼贾伟李刚宁夏医科大学总医院医学实验中心宁夏银川750004 宁夏临床病原微生物重点实验室宁夏医学检验临床研究中心

目的了解含有bla_(OXA-48)基因的BL21(DE3)菌株其细菌转录谱的变化,探究bla_(OXA-48)基因的引入对BL21(DE3)菌株代谢及耐药性的影响。方法采用高通量转录组测序的RNA-seq技术对pET32a(+)-OXA-48-BL21(DE3)与pET32a(+)-BL21(DE3)及OXA-48菌株进行检测,测序数据处理后获得表达差异基因,差异表达基因的筛选阈值为:|log2(FoldChange)|>1且qvalue<0.005。对差异表达基因进行聚类分析,利用GO数据库和KEGG数据库对表达差异基因进行注释与富集性分析,筛选部分差异表达关键基因进行分类整理。结果pET32a(+)-OXA-48-BL21(DE3)与pET32a(+)-BL21(DE3)相比有1201个差异表达基因,其中上调592个,下调609个;GO分析表明,代谢过程、生物合成过程、分子功能、催化活性、离子结合等途径共同参与OXA-48菌株的生物过程。KEGG富集分析表明差异基因主要与碳代谢、不同环境中的微生物代谢、抗生素的生物合成、嘌呤代谢、次生代谢物的生物合成等有关。对差异表达关键基因进行整理分析,与耐药性、生物膜形成、及脂多糖合成代谢相关的差异基因有acrA、acrB、ompF、pedR、mcbR和LptD等。结论bla_(OXA-48)在BL21(DE3)菌株中的表达能调控多种与细菌耐药性及代谢相关基因的表达,这为研究耐药基因对于肠杆菌科细菌产生的影响奠定了基础,可为OXA-48菌株的流行病学监测及其感染的预防控制提供参考。

关键词：碳青霉烯类肠杆菌科细菌细菌耐药性转录组

过表达碳青霉烯酶OXA-48对菌株耐药性、适应性及宿主细胞Toll样受体信号通路的影响

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中国生物制品学杂志 2023年第9期36卷 1032-1038页

作者：潘亚菲赵志军党甜甜康宇婷贾伟宁夏医科大学总医院医学实验中心宁夏银川750004 宁夏病原微生物重点实验室宁夏银川750004 宁夏医科大学总医院医学科学研究院宁夏银川750004

目的探讨过表达OXA-48对菌株耐药性、适应性及宿主细胞Toll样受体(Toll-like receptor,TLR)信号通路的影响。方法将重组质粒pET32a(+)-OXA-48转化至*** BL21(DE3)中,获得的重组菌pET32a(+)-OXA-48-BL21(DE3)进行菌落PCR及测序鉴定。以A_(600)(0.3、0.5、0.7)、IPTG终浓度(0.4、0.6、0.8 mmol/L)及诱导时间(2、4、6 h)为变量,mRNA转录水平为响应值,设计3因素3水平正交试验,优化质粒的诱导表达条件。纸片扩散法检测重组菌pET32a(+)-OXA-48-BL21(DE3)对亚胺培南(Imipenem,IPM)、美罗培南(Meropenem,MEM)、头孢曲松(Ceftriaxone,CRO)、头孢吡肟(Cefepime,FEP)的耐药性;通过生物膜形成试验和血清抵抗力试验检测重组菌pET32a(+)-OXA-48-BL21(DE3)的适应性。将pET32a(+)-OXA-48-BL21(DE3)、pET32a(+)-BL21(DE3)和*** BL21(DE3)菌株分别感染小鼠肺泡巨噬细胞MH-S,qRT-PCR法检测细胞中TLR2、TLR4和NF-кB(p65)基因mRNA转录水平,ELISA法检测细胞因子白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)、IL-10、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)和转化生长因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)的表达情况。结果经菌落PCR及测序鉴定,重组菌pET32a(+)-OXA-48-BL21(DE3)构建正确。最佳诱导条件:A_(600)为0.3,IPTG终浓度为0.6 mmol/L,诱导时间为2 h。与pET32a(+)-BL21(DE3)菌株比较,重组菌pET32a(+)-OXA-48-BL21(DE3)对IPM、MEM、CRO和FEP 4种抗生素的耐药性明显降低(t=7.14~22.32,P均0.05);感染12和24 h时,IL-6表达水平显著高于pET32a(+)-BL21(DE3)组(t分别为2.92和3.79,P均<0.05)。结论过表达OXA-48可降低细菌的耐药性,提高适应性及宿主细胞TLRs信号通路相关因子的转录水平,还可影响宿主细胞下游细胞因子的表达水平。

关键词：碳青霉烯酶OXA-48 耐药性适应性 Toll样受体细胞因子

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核桃苗木氮肥肥害发生生理及影响因素研究

核桃苗木氮肥肥害发生生理及影响因素研究

作者：潘亚菲河北农业大学

学位级别：硕士

核桃是适应性极强,集食用、药用、材用、生态于一身的重要经济林树种。近年来,随着核桃产业的快速发展,优质苗木需求量越来越多。施用氮肥是培育优质苗木的重要措施,但是氮肥施用不当会造成肥害。为了探索核桃苗木合理的氮肥施用技术,... 详细信息

核桃是适应性极强,集食用、药用、材用、生态于一身的重要经济林树种。近年来,随着核桃产业的快速发展,优质苗木需求量越来越多。施用氮肥是培育优质苗木的重要措施,但是氮肥施用不当会造成肥害。为了探索核桃苗木合理的氮肥施用技术,在河北农业大学标本园以当年实生核桃苗为试材,对氮肥肥害发生生理及影响因素进行了研究,主要研究结果如下:1.在试验所设的不施N、施尿素10 kg/667m2、施尿素20 kg/667m2、施尿素30kg/667m2和施尿素40 kg/667m2的处理下,施肥量在20 kg/667m2以下时,均不发生肥害;尿素施用量达到30 kg/667m2时开始发生肥害;在施肥量超越临界值后,随着施肥量的增加,肥害病情加重;下透雨后立即地面撒施,下透雨后立即沟施,地面撒施后立即浇水,沟施后立即浇水4种不同施肥方法的平均肥害指数分别为1.37%、1.00%、0.79%、0.63%。4种施肥方法病情指数大小顺序为下透雨后立即地面撒施>下透雨后立即沟施>地面撒施后立即浇水>沟施后立即浇水。2.肥害发生时,施肥量40 kg/667m2的苗木生长区间平均田间相对湿度为77.17%,显著高于0 kg/667m2和10 kg/667m2;4种施肥方法苗木生长区间的田间平均相对湿度分别为79.33%、76.80%、72.80%和69.13%,下透雨后立即地面撒施显著高于下透雨后立即沟施,极显著高于地面撒施后立即浇水和沟施后立即浇水。3.施肥量为0 g/盆、1.08 g/盆、2.25 g/盆、3.33 g/盆、4.50 g/盆时,4.50 g/盆的平均氨气浓度最高为31.88μl·L-1,极显著高于1.08 g/盆(22.91μl·L-1)和2.25 g/盆(24.63μl·L-1);4种施肥方法苗木生长区间空气中的平均氨气浓度分别为:32.64μl·L-1、26.45μl·L-1、25.86μl·L-1、23.77μl·L-1,浇水后立即表面撒施的平均氨气浓度极显著高于其他3种施肥方法。4.施肥后第4天,4种施肥方法不同施肥量的平均光合速率分别为4.99、5.74、6.90、7.54和6.80μmol·m-2·s-1,尿素施用量30 kg/667m2极显著高于0 kg/667m2和10kg/667m2;不同施肥量4种施肥方法的平均光合速率分别为6.86、7.61、5.47和5.62μmol·m-2·s-1,下透雨后立即沟施的平均光合速率显著高于下透雨后立即地面撒施,极显著高于地面撒施后立即浇水和沟施后立即浇水。不同施肥量施肥后第17天和第34天的平均光合速率分别为4.99、7.42、8.78、6.29、5.32、5.85、9.34、10.92、5.41、4.45μmol·m-2·s-1,以施肥量20 kg/667m2处理为高;4种施肥方法施肥后第17天和第34天的平均光合速率分别为7.24、7.01、6.39、6.35、7.25、7.11、6.76、7.64μmol·m-2·s-1,以下透雨后立即地面撒施的方法处理为高。5.施肥后第4天,4种施肥方法不同施肥量的平均蒸腾速率分别为2.13、2.92、3.11、4.76和4.09μmol·m-2·s-1,尿素施用量30 kg/667m2极显著高于0 kg/667m2、10kg/667m2和20 kg/667m2,显著高于40 kg/667m2;不同施肥量4种施肥方法的平均蒸腾速率分别为3.09、3.30、3.47和3.75μmol·m-2·s-1,沟施后立即浇水的平均蒸腾速率显著高于下透雨后立即地面撒施。不同施肥量施肥后第17天和第34天的平均蒸腾速率分别为2.96、3.39、3.61、3.90、3.53、3.14、3.69、4.13、3.48、2.71μmol·m-2·s-1,以施肥量30 kg/667m2和20 kg/667m2处理为高;4种施肥方法施肥后第17天和第34天的平均蒸腾速率分别为3.32、3.40、3.42、3.77、3.08、3.23、3.70、3.71μmol·m-2·s-1,以沟施后立即浇水的方法处理为高。6.4种施肥方法不同施肥量的平均根系活力分别为43.10、80.59、111.40、158.49、107.71μg·g-1·h-1,施肥量30 kg/667m2的平均根系活力最大,极显著高于0 kg/667m2和10 kg/667m2,显著高于20 kg/667m2和40 kg/667m2;不同施肥方法的平均根系活力分别为69.71、79.26、109.26、142.79μg·g-1·h-1,沟施后立即浇水的平均根系活力极显著高于下透雨后立即地面撒施、下透雨后立即沟施,显著高于地面撒施后立即浇水。7.4种施肥方法不同施肥量的平均GR活性、APX活性、CAT活性、MDA含量

关键词：核桃幼苗氮肥光合作用发生生理等

弓形虫ROP16蛋白在人白血病细胞THP-1表达及对其细胞增殖与凋亡的影响

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中国人兽共患病学报 2022年第4期38卷 277-284页

作者：陈梅贾伟党甜甜潘亚菲杨宁爱苏雅静赵志军宁夏医科大学临床医学院银川750004 宁夏临床病原微生物重点实验室银川750004 宁夏医科大学总院医学实验中心银川750004

目的探讨弓形虫Ⅱ型(Me49)ROP16蛋白在急性单核细胞白血病细胞株THP-1中的表达及其对THP-1细胞增殖与凋亡的影响。方法构建过表达ROP16(overExp-ROP16)和空载体(overExp-NC)慢病毒,通过转染THP-1细胞,72 h后观察荧光表达情况,采用PCR与W... 详细信息

目的探讨弓形虫Ⅱ型(Me49)ROP16蛋白在急性单核细胞白血病细胞株THP-1中的表达及其对THP-1细胞增殖与凋亡的影响。方法构建过表达ROP16(overExp-ROP16)和空载体(overExp-NC)慢病毒,通过转染THP-1细胞,72 h后观察荧光表达情况,采用PCR与Western blot验证ROP16在THP-1细胞中的表达。免疫荧光技术检测ROP16蛋白在THP-1细胞中的定位。CCK-8与流式细胞术检测细胞增殖及凋亡。采用qRT-PCR检测细胞凋亡相关因子Bcl-2、Bax、Caspase-3 mRNA相对表达水平。Western blot检测Bax、Bcl-2、Pro-Caspase-3和Cleaved-Caspase-3蛋白的表达变化。结果构建的过表达ROP16重组慢病毒转染到THP-1细胞后,可观察强荧光信号,ROP16蛋白在THP-1细胞中成功表达。免疫荧光结果表明ROP16蛋白定位于THP-1细胞核。CCK-8与流式细胞术证实ROP16蛋白抑制THP-1细胞的增殖并促进其凋亡(均P<0.05)。与对照组相比,过表达组促凋亡因子Bax、Caspase-3 mRNA高表达(P<0.05),抗凋亡因子Bcl-2 mRNA低表达(P<0.01),Bax与Cleaved-Caspase-3蛋白水平上调(P<0.01),Bcl-2与Pro-Caspase-3蛋白水平下调(P<0.01)。结论构建的慢病毒表达质粒overExp-ROP16可在急性单核细胞白血病细胞株THP-1中表达且通过入核调节凋亡蛋白Bcl-2、Bax、Caspase-3而抑制THP-1细胞增殖,促进其凋亡。

关键词：刚地弓形虫 ROP16 THP-1细胞增殖凋亡

弓形虫VEG株ROP16蛋白对THP-1细胞免疫调节及机制研究

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中国兽医科学 2022年第4期52卷 466-474页

作者：陈梅贾伟杨峥党甜甜潘亚菲苏雅静杨宁爱赵志军宁夏医科大学临床医学院宁夏银川750004 宁夏临床病原微生物重点实验室宁夏银川750004 宁夏医科大学总院医学实验中心宁夏银川750004

为了探究弓形虫VEG株ROP16蛋白在THP-1细胞中的表达及对其免疫反应的影响和相关机制,本研究利用慢病毒构建过表达ROP16(overEep-ROP16)载体,空载体(overEep-NC)为对照,通过转染THP-1细胞构建稳转细胞株,对其荧光蛋白表达情况、ROP16在TH... 详细信息

为了探究弓形虫VEG株ROP16蛋白在THP-1细胞中的表达及对其免疫反应的影响和相关机制,本研究利用慢病毒构建过表达ROP16(overEep-ROP16)载体,空载体(overEep-NC)为对照,通过转染THP-1细胞构建稳转细胞株,对其荧光蛋白表达情况、ROP16在THP-1细胞中的表达及定位进行检测;通过RT-PCR检测炎性因子IL-1β、IL-18、TNF-α、IL-10、IL-12 mRNA相对表达水平;Western-blot方法检测炎性小体NLRP3、Caspase-1蛋白与信号通路蛋白STAT3、pTyr705-STAT3的表达水平。结果显示,构建的过表达ROP16重组慢病毒转染THP-1细胞后可观察到强绿色荧光,在THP-1细胞中rop16基因在mRNA与蛋白水平均成功表达且该蛋白定位于THP-1细胞核;与对照组相比,过表达组促炎细胞因子IL-1β、IL-18、TNF-αmRNA表达水平上调(P0.05)。上述结果表明,构建的过表达ROP16重组慢病毒稳转染至THP-1细胞内并表达蛋白,表达的蛋白定位于THP-1细胞核内,该蛋白能激活NLRP3炎性小体促发炎症的发生并通过磷酸化STAT3 Tyr705调控抗炎作用。

关键词：刚地弓形虫 ROP16蛋白 THP-1细胞炎性小体 STAT3

肺炎克雷伯菌铁载体含量对耐碳青霉烯类抗生素的影响

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宁夏医科大学学报 2022年第2期44卷 157-161,166页

作者：潘亚菲赵志军党甜甜陈梅马苗贾伟宁夏医科大学临床医学院银川750004 宁夏医科大学总医院医学实验中心银川750004 宁夏病原微生物重点实验室银川750004

目的探究肺炎克雷伯菌铁载体含量与耐碳青霉烯类抗生素的关系。方法采用铬天青S(CAS)检测法确定肺炎克雷伯菌是否产铁,紫外分光光度法检测铁载体的相对含量,根据中位数将60株临床分离菌分为高产铁载体组(30株)和低产铁载体组(30株);用... 详细信息

目的探究肺炎克雷伯菌铁载体含量与耐碳青霉烯类抗生素的关系。方法采用铬天青S(CAS)检测法确定肺炎克雷伯菌是否产铁,紫外分光光度法检测铁载体的相对含量,根据中位数将60株临床分离菌分为高产铁载体组(30株)和低产铁载体组(30株);用聚合酶链式反应(PCR)检测铁载体基因和碳青霉烯类耐药基因;采用改良碳青霉烯类失活法(mCIM)实验对碳青霉烯酶的型别进行初步分类。分析肺炎克雷伯菌碳青霉烯类耐药与其铁载体含量的关系。结果60株肺炎克雷伯菌均产生铁载体,低产铁载体组的铁载体含量低于高产铁载体组(t=9.530,P<0.01);PCR法共检出27株碳青霉烯耐药基因阳性菌,mCIM试验的敏感度与特异度分别为92.59%和90.90%。高产铁载体组耐药率低于低产铁载体组(χ^(2)=9.600,P<0.01)。根据药敏结果将60株受试菌分耐药组和敏感组各30株,碳青霉烯类药物敏感组菌株较耐药组菌株铁载体产量更高(t=2.481,P<0.05)。结论肺炎克雷伯菌铁载体的产量与碳青霉烯类抗生素耐药性有关。

关键词：铁载体肺炎克雷伯菌碳青霉烯类抗生素耐药性

四相开关磁阻电机带直流偏置正弦激励特性研究

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微电机 2020年第10期53卷 82-87页

作者：李民中李冲潘亚菲蒯松岩河南平宝煤业有限公司河南许昌461000 中国矿业大学江苏徐州221116

针对四相开关磁阻电机(SRM)传统方波励磁转矩脉动大的问题,提出了一种单极性正弦励磁控制方法。首先建立了两相旋转坐标系下四相SRM的数学模型,分析了带直流偏置正弦励磁时瞬时转矩,结果表明转矩和iq分量成正比并且转矩不含三相SRM单极... 详细信息

针对四相开关磁阻电机(SRM)传统方波励磁转矩脉动大的问题,提出了一种单极性正弦励磁控制方法。首先建立了两相旋转坐标系下四相SRM的数学模型,分析了带直流偏置正弦励磁时瞬时转矩,结果表明转矩和iq分量成正比并且转矩不含三相SRM单极性正弦励磁时的磁阻转矩分量。然后研究了在两相旋转坐标系下对电流分量的控制方法,转矩分量采用SPWM控制,励磁分量采用电流滞环跟踪控制。最后对本文提出的控制方法通过有限元进行仿真分析并给出实验验证。实验结果表明在该种控制方式下SRM的转矩脉动小于传统方波励磁的转矩脉动。

关键词：开关磁阻电机正弦励磁转矩脉动直流偏置

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煤矿主井装载自动化技术

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